氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法

摘要

本发明建立了一种氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法。该方法通过分支型滚环扩增（HRCA）技术提高了制备DNA水凝胶的效率，同时将功能核酸序列设计在HRCA反应的模板序列中，为制备出的水凝胶提供可形成如铜纳米簇（CuNCs）的荧光金属纳米簇的模板。此外，将氧化石墨烯（GO）纳米材料引入制备体系中，降低了HRCA反应体系对CuNCs荧光的影响，显著增强了CuNCs荧光强度。本发明通过GO的加入、CuNCs的形成提升了水凝胶网络致密度及粘弹性，同时为以纳米花为基础的微观结构提供了新的形貌。本发明实现了快速制备荧光增强且通用性强的GO荧光增强型功能核酸水凝胶，在包括分子检测、生物成像等方面，具有非常好的应用前景。

权利要求

1.一种氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括由分支型滚环扩增反应HRCA获得的长单链DNA产物，氧化石墨烯纳米材料以及荧光铜纳米簇制备而成；

所述氧化石墨烯纳米材料与分支型滚环扩增反应的双引物同时加入，通过扩增反应的进行与长单链DNA产物发生物理吸附，相互交联，形成氧化石墨烯‑HRCA水凝胶；

所述长单链DNA产物为荧光铜纳米簇的形成提供成核序列，在加入纳米簇形成体系后，能够在氧化石墨烯‑HRCA水凝胶中形成荧光铜纳米簇，并在特定波长激发下产生荧光；

所述分支型滚环扩增反应包括一条锁式探针，所述锁式探针为SEQ ID NO:1所示序列；

所述纳米簇形成体系为抗坏血酸钠和硫酸铜溶液，形成荧光铜纳米簇，在340nm下激发荧光。

2.如权利要求1所述氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述分支型滚环扩增反应体系包括一条锁式探针、一条连接引物和两条引物A、B；

所述锁式探针与连接引物通过互补配对并在连接酶作用下连接成环状模板，再加入含DNA聚合酶的扩增体系后，能够进行分支型滚环扩增反应的第一阶段扩增；

所述两条引物A、B以第一阶段扩增反应获得的长单链DNA为模板，在扩增体系下进行分支型滚环扩增反应第二阶段扩增，进一步获得大量长单链DNA产物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述锁式探针、连接引物和两条引物A、B具有如下1）‑4）的结构：

1）所述锁式探针序列包括与连接引物互补的连接区域与非链接区域；

2）所述锁式探针序列中的连接区域是分别靠近5’端和3’端，且长度各为10nt的区域，通过与连接引物互补以形成环状模板；

3）所述锁式探针序列中的非连接区域设置有长度为20nt的荧光铜纳米簇的成核序列，可形成CuNCs的富鸟嘌呤序列，为后续形成CuNCs的荧光铜纳米簇提供模板；

4）所述两条引物A、B序列是与锁式探针序列中的非连接区域互补，长度为20nt且相互间无重复的核酸序列。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述锁式探针、连接引物和两条引物A、B具有如下1）‑3）的结构：

1）所述锁式探针序列为序列表中SEQ ID NO：1所示核酸序列5’端经过磷酸化修饰得到核酸序列；

2）所述连接引物为序列表中SEQ ID NO：2所示核酸序列；

3）所述引物A、B为序列表中SEQ ID NO：3和 SEQ ID NO：4所示核酸序列。

5.根据权利要求2‑4任一所述的制备方法，其特征在于，按照分支型滚环扩增反应的步骤，连接成环后的锁式引物与连接引物先进行第一阶段扩增，25℃孵育至少1小时，以获得一定量的第一阶段分支型滚环扩增产物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，按照分支型滚环扩增反应的步骤，在获得一定量的第一阶段分支型滚环扩增产物的基础上，加入氧化石墨烯与两条引物A、B继续进行第二阶段扩增，25℃孵育至少4h，最终获得氧化石墨烯功能核酸水凝胶产物。

7.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，通过调节氧化石墨烯浓度，以及荧光铜纳米簇形成体系，实现荧光纳米材料荧光强度的可控；

所述氧化石墨烯浓度为1‑20 μg/mL；

所述荧光铜纳米簇形成体系包括CuSO4和抗坏血酸钠，其中所述CuSO4浓度为100 μM‑

500 μM，所述抗坏血酸钠浓度为2‑10 mM。

8.权利要求1‑7任一所述制备方法获得的氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶在分子检测、生物成像的应用。

说明书

氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物材料领域，具体涉及一种氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法。

背景技术

[0002] 传统线性滚环扩增（RCA）技术制备DNA水凝胶存在耗时长，直接获得的RCA水凝胶机械强度低、可利用性较差等问题。同时，RCA反应体系中的酶、二硫苏糖醇、ATP等物质对荧
光功能核酸水凝胶的荧光强度具有较大抑制作用，极大地限制了应用的开发与拓展。此外，
基于线性RCA技术获得的核酸水凝胶微观形貌单一，并且在制备过程中难以调控其大小及
形貌结构。因此，将线性RCA技术替换成分支型RCA（HRCA）技术能够巧妙地解决以上问题。一
方面缩短了传统线性RCA技术制备DNA水凝胶的时间，进一步摆脱了对人工合成高浓度核酸
链的依赖；另一方面充分利用了DNA的可编程性将功能核酸序列设计在RCA反应的模板序列
中，为获得的水凝胶提供可形成如荧光铜纳米簇（CuNCs）等荧光金属纳米簇的模板。同时，
将氧化石墨烯（GO）纳米材料引入水凝胶的制备体系中，显著增强如CuNCs等荧光金属纳米
簇的荧光强度，降低了HRCA反应体系对CuNCs荧光的影响。此外，氧化石墨烯功能核酸水凝
胶具有较高的粘弹性和独特的微观形貌，并实现了通过HRCA反应时间、荧光金属纳米簇的
形成体系及GO的浓度进行调节。因此，该方法在包括分子检测、生物成像等方面，具有非常
好的应用前景。

发明内容

[0003] 本发明建立的核酸水凝胶制备新方法，具有高效制备、荧光增强、形貌可控且通用性强等优点，在包括分子检测、生物成像等方面，具有非常好的应用前景。

[0004] 本发明的一个目的是提供一种核酸水凝胶制备方法，所述方法基于一种体外恒温核酸扩增技术, 所述体外恒温核酸扩增技术的反应体系包括锁式探针和连接引物，其特征
在于，所述锁式探针的5’端经过磷酸化修饰且含有与连接引物互补的区域；所述连接引物
能够与锁式探针的5’端和3’端杂交形成2段相邻的碱基互补配对区域；

[0005] 所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。

[0006] 所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶。

[0007] 所述连接酶包括可用于体外核酸扩增技术的连接酶。

[0008] 所述扩增反应体系中的序列包括现有技术或公知常识所定义的序列，公众可直接人工合成获得，其制备方法属于现有技术；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设
计方法。

[0009] 具体的，所述分支型滚环扩增（HRCA）反应还包括以下步骤：

[0010] 1）所述体外核酸扩增技术包括HRCA反应，所述HRCA的反应过程包括：连接反应和扩增反应两部分；

[0011] 2）所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交的过程，反应过程包括：80～100℃，5～10min，缓慢降温；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板的过程，
反应过程包括：16～30℃，20min～3h；

[0012] 3）所述扩增反应包括环化模板与一条连接引物的扩增阶段1，和环化模板与两条引物A、B及氧化石墨烯纳米材料的扩增阶段2，各阶段反应过程包括：30～37℃，2h～8h，最
终获得氧化石墨烯功能核酸水凝胶。

[0013] 4）所述锁式探针公众可直接人工合成获得，其制备方法属于现有技术。

[0014] 锁式探针序列是5’端经过磷酸化修饰的长链序列，5’端磷酸化修饰的化学结构为：

[0015]

[0016] 5）在进行HRCA反应过程中，10 μg/mL氧化石墨烯与两条引物A、B均在锁式探针与连接引物连接完成并进行25℃孵育4h后一起加入反应体系进行第二阶段的扩增反应，最终
获得氧化石墨烯功能核酸水凝胶。

[0017] 具体的，所述HRCA反应体系包括一条锁式探针、一条连接引物和两条引物A、B，其特征在于，所述HRCA反应体系包括下述1）‑4）中所述的至少一种情况：

[0018] 1）所述锁式探针序列包括与连接引物互补的连接区域与非链接区域；

[0019] 2）所述锁式探针序列中的连接区域是分别靠近5’端和3’端，且长度各为10nt的区域，通过与连接引物互补以形成环状模板；

[0020] 3）所述锁式探针序列中的非连接区域设置有长度为20nt如可形成CuNCs的富鸟嘌呤序列，为后续形成CuNCs的荧光金属纳米簇提供模板；

[0021] 4）所述两条引物A、B序列是与锁式探针序列中的非连接区域互补，长度为20nt且相互间无重复的核酸序列。

[0022] 具体的，所述锁式探针与连接引物通过互补配对并在T4 DNA连接酶的作用下连接成环状模板，在加入包括phi 29 DNA聚合酶等扩增体系后，开始分支型滚环扩增反应的第
一阶段。所述两条引物A、B是以第一阶段扩增反应获得的长单链DNA为模板，负责进行分支
型滚环扩增反应第二阶段的引物，在包括phi 29 DNA聚合酶等扩增体系中进一步获得大量
长单链DNA产物。

[0023] 还具体的，所述HRCA反应体系包括下述1）‑3）中的至少一种：

[0024] 1）所述锁式探针序列包括对序列表中SEQ ID NO：1所示核酸序列5’端经过磷酸化修饰得到核酸序列和/或SEQ ID NO：1所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺
失和/或添加的核酸序列；

[0025] 2）所述连接引物包括序列表中SEQ ID NO：2所示核酸序列和/或SEQ ID NO：2所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。

[0026] 3）所述引物A、B包括序列表中SEQ ID NO：3和 SEQ ID NO：4所示核酸序列和/或SEQ ID NO：3和 SEQ ID NO：4所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或
添加的核酸序列。

[0027] 进一步的，氧化石墨烯功能核酸水凝胶中加入如CuNCs等荧光金属纳米材料的形成体系，即3‑吗啉丙磺酸缓冲溶液、不同浓度的CuSO4和抗坏血酸溶液，室温下孵育5min以
形成CuNCs。

[0028] 更进一步的，含有如CuNCs等金属纳米颗粒的氧化石墨烯功能核酸水凝胶，将其置于340nm的激发波长下，即可获得氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶。

[0029] 本发明的技术方案中，可通过调节CuSO4和抗坏血酸钠的浓度，用于控制形成荧光CuNCs的形成体系，以实现荧光纳米材料荧光强度的可控。

[0030] 本发明的一个方面，提供一种氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法，包括由分支型滚环扩增反应HRCA获得的长单链DNA产物，氧化石墨烯纳米材料以及荧光
铜纳米簇制备而成；

[0031] 可选的，氧化石墨烯纳米材料与分支型滚环扩增反应的双引物同时加入，通过扩增反应的进行与长单链DNA产物发生物理吸附，相互交联，形成氧化石墨烯‑HRCA水凝胶；

[0032] 可选的，长单链DNA产物为荧光纳米簇的形成提供成核序列，在加入纳米簇形成体系后，能够在氧化石墨烯‑HRCA水凝胶中形成荧光纳米簇，并在特定波长激发下产生荧光。

[0033] 可选的，荧光纳米簇为荧光铜纳米簇。

[0034] 可选的，纳米簇形成体系为抗坏血酸钠和硫酸铜溶液，形成荧光铜纳米簇，在340nm下激发荧光。

[0035] 本发明的另一个方面，上述制备方法中，分支型滚环扩增反应体系可以包括一条锁式探针、一条连接引物和两条引物A、B；

[0036] 可选的，锁式探针与连接引物通过互补配对并连接酶作用下连接成环状模板，再加入DNA聚合酶等扩增体系后，能够进行分支型滚环扩增反应的第一阶段扩增；

[0037] 可选的，两条引物A、B以第一阶段扩增反应获得的长单链DNA为模板，在扩增体系下进行分支型滚环扩增反应第二阶段扩增，进一步获得大量长单链DNA产物。

[0038] 另一方面，上述分支型滚环扩增反应中，连接成环后的锁式引物与连接引物先进行第一阶段扩增，25℃孵育至少1小时，以获得一定量的第一阶段分支型滚环扩增产物；

[0039] 可选的，在获得一定量的第一阶段分支型滚环扩增产物的基础上，加入氧化石墨烯与两条引物A、B继续进行第二阶段扩增，25℃孵育至少4h，最终获得氧化石墨烯功能核酸
水凝胶产物。

[0040] 本发明的另一个方面，通过调节氧化石墨烯浓度，以及荧光纳米簇形成体系，实现荧光纳米材料荧光强度的可控；优选的，所述氧化石墨烯浓度为1‑20 μg/mL；优选的，荧光
纳米簇的形成体系中CuSO4浓度为100μM‑500 μM，抗坏血酸钠浓度为2‑10mM。

[0041] 本发明的另一个方面，通过本发明方法制备的氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶在分子检测、生物成像的应用。

[0042] 本发明的另一个目的是提供一种制备方法，所述方法包括氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备，所述氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备体系包括氧化
石墨烯功能核酸水凝胶和荧光金属纳米簇形成体系。

[0043] 具体的，所述氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备方法还包括在获得的氧化石墨烯功能核酸水凝胶中加入CuNCs金属纳米颗粒的形成体系，即3‑吗啉丙磺酸缓冲
溶液、不同浓度的CuSO4和抗坏血酸溶液，其中CuSO4的浓度设置为200μM、200μM、300μM和400
μM，抗坏血酸钠的浓度设置为5mM、8mM、6mM和5mM。随后，室温下孵育5min以形成CuNCs，在
340nm的激发波长下，即可获得氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶。

[0044] 本发明的有益效果包括：

[0045] 1、本发明通过采用分支型滚环扩增技术高效获得大量DNA长单链产物，相较于传统线性滚环扩增技术用时更短，显著提高DNA水凝胶的制备效率；

[0046] 2、本发明采用的分支型滚环扩增技术为引入荧光金属纳米簇的成核序列提供了更多位点，便于后续荧光金属纳米簇的形成。

[0047] 3、本发明通过引入氧化石墨烯纳米材料，降低了分支型滚环扩增反应体系对金属纳米颗粒荧光强度的抑制作用，并显著增强了CuNCs荧光强度。

[0048] 4、本发明通过分支型滚环扩增的长单链产物、氧化石墨烯以及荧光金属纳米簇的相互交联，提升了水凝胶网络致密度及粘弹性，为以纳米花为基础的微观结构提供了新的
形貌。

[0049] 5、本发明通过调整氧化石墨烯浓度、荧光金属纳米簇形成体系的浓度实现了微观形貌可控。

附图说明

[0050] 图1为氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶制备原理图。

[0051] 图2为氧化石墨烯功能核酸水凝胶光学照片。

[0052] 图3为氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶中未加入（A）和加入（B）GO的微观结构对比（比例尺=1μM）。

[0053] 图4为氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶中未形成（A）和形成（B）CuNCs的微观结构对比（比例尺=10μM）。

[0054] 图5为GO对氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的荧光强度影响：不同CuNCs形成体系下，有/无GO的氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶（A）和上清液（B）的荧光曲线。
CuNCs形成体系中CuSO4浓度（μM）/抗坏血酸钠浓度（mM）分别为200 / 5、400 / 5、200 / 8、
300 / 6。

具体实施方式

[0055] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0056] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0057] 以下所述实施例进一步说明本发明的内容和实施方式，其描述较为具体和详细，但不应理解为对本发明专利范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明
方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围之内。

[0058] 实施例1、氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的制备与表征

[0059] （一）实验材料

[0060] 本实施例所采用的实验试剂信息见表1，所设计的引物的核苷酸序列见表2和序列表。

[0061]

[0062] 除表1中实验试剂外，实验用水均来自Milli‑Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。

[0063]

[0064] 表2中，锁式探针的5’端经磷酸化修饰，其化学结构为：

[0065]

[0066] 表2所列的序列均为人工合成。

[0067] （二）氧化石墨烯功能核酸水凝胶的制备

[0068] 1）连接反应

[0069] 如图1所示，RCA反应的第一步是将锁式探针在连接引物的辅助下经T4连接酶作用连接形成环型扩增模板。滚环扩增连接体系组成如下（表3）所示。首先，将表3中的组分混合
后置于PCR仪中90 ˚C加热5 min，以1 ˚C/min的速度缓慢冷却到室温。随后，加入3μL T4 
DNA 连接酶（40 U/μL）于以上体系中，用枪头轻轻吹吸混匀，于室温孵育2 h。

[0070]

[0071] 2）扩增反应

[0072] RCA反应的第二步是将连接产物在phi29 DNA聚合酶以及dNTPs的作用下进行两个阶段的滚环扩增反应从而获得大量长单链DNA（single‑strand DNAs，ssDNAs）扩增产物。滚
环扩增反应的扩增体系组成如下（表4）所示。首先，将表3中出引物A、B的组分混合后于25 ˚
C下孵育4 h。随后，加入GO、引物A、B于25 ˚C下继续孵育4 h，最后65 ˚C孵育10 min使phi29 
DNA聚合酶失活以终止扩增反应，获得氧化石墨烯功能核酸水凝胶。

[0073]

[0074] （三）氧化石墨烯功能核酸水凝胶的表征

[0075] 通过光学照片和SEM两种方式对制备的氧化石墨烯功能核酸水凝胶进行表征。

[0076] 1）光学照片记录氧化石墨烯功能核酸水凝胶的宏观形态

[0077] 如图2所示，氧化石墨烯功能核酸水凝胶粘弹性较高，可悬挂于移液器枪头尖端不滴落，表明已呈凝胶态。

[0078] 2）SEM表征氧化石墨烯功能核酸水凝胶的微观结构

[0079] 先将样品用液氮进行快速冷冻，然后放入冷冻干燥仪完全干燥。在20 mA的条件下喷铂6 min，并以5 kV电压进行电镜扫描。

[0080] 如图3A所示，当不添加GO时，几乎所有的DNA纳米花直径均小于1 um，并且与成形的纳米花结构以及纳米花花瓣之间的间隙相比，大多数纳米花仍处于形成的最初始状态。
加入GO后， DNA纳米花直径显着增加。更重要的是，在GO的强吸附作用下，可以清晰地观察
到纳米花被组装并彼此交联，从而形成体积更大的纳米花聚集体。此外，GO的加入能够加快
DNA纳米花结构的形成，多数已处于形成的后期，并且纳米花花瓣之间的间隙明显减小（图
3B）。（四）氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的形成及表征

[0081] 1）氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的形成

[0082] 在获得的氧化石墨烯功能核酸水凝胶中加入CuNCs形成体系，即3‑吗啉丙磺酸缓冲溶液液、不同浓度的CuSO4和抗坏血酸溶液，其中CuSO4的浓度设置为200μM、200μM、300μM
和400μM，抗坏血酸钠的浓度设置为5mM、8mM、6mM和5mM。随后，室温下孵育5min以形成
CuNCs，在340nm的激发波长下测量荧光强度。

[0083] 2）氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的SEM表征

[0084] 在添加CuSO4和抗坏血酸钠后，未加入GO的DNA纳米花的表面具有大量类似蜂巢的规则形状，表明CuNCs的形成增大了DNA纳米花之间的交联，使水凝胶网络结构更为致密（图
4A）。此外，如图4B所示，在GO和CuNCs对DNA纳米花的双重交联作用下，DNA纳米花之间的交
联网络更加复杂和密集。可以观察到交联网络的层叠状态。

[0085] 3）氧化石墨烯荧光增强型功能核酸水凝胶的荧光强度表征

[0086] 如图5A所示，GO加入DNA水凝胶后，水凝胶的荧光强度显著增强。这主要是由于GO的强吸附作用能够屏蔽HRCA反应体系对CuNCs荧光的抑制作用，从而进一步保护了CuNCs荧
光的生成。同时，GO还充当了交联剂的作用，提升了水凝胶内结构支架的稳定性，缩短了DNA
纳米花之间的距离和促使CuNCs聚集，从而导致CuNCs荧光的局部增强。相比之下，如图5B所
示，作为对照的上清液样品几乎没有荧光，表明在上清液中没有形成CuNCs，并且通过HRCA
反应获得的大量CuNCs形成模板（poly‑T区域）在上清液中几乎没有游离，而是全部聚集一
起形成DNA水凝胶。

[0087] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技
术方案，均应落在本发明的保护范围之内。