抗CD47的单克隆抗体及其用途转让专利
申请号 : CN202010919545.8
文献号 : CN112442123A
文献日 : 2021-03-05
发明人 : 张鹏 , 李百勇 , 夏瑜 , 王忠民
申请人 : 中山康方生物医药有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段,其中:
所述抗体包含选自以下重链可变区和轻链可变区中包含的CDR序列(1)SEQ ID NO:2所示的重链可变区包含的HCDR1,HCDR2和HCDR3,和SEQ ID NO:4所示的轻链可变区包含的LCDR1,LCDR2和LCDR3;或(2)SEQ ID NO:12所示的重链可变区包含的HCDR1,HCDR2和HCDR3,和SEQ ID NO:14所示的轻链可变区包含的LCDRl,LCDR2和LCDR3;或(3)SEQ ID NO:16所示的重链可变区包含的HCDR1,HCDR2和HCDR3,和SEQ ID NO:18所示的轻链可变区包含的LCDR1,LCDR2和LCDR3;或(4)SEQ ID NO:20所示的重链可变区包含的HCDR1,HCDR2和HCDR3,和SEQ ID NO:22所示的轻链可变区包含的LCDR1,LCDR2和LCDR3;
优选地,所述抗体包含:
HCDR1,其包含SEQ ID NO:5所示的序列,与所述序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,HCDR2,其包含SEQ ID NO:6所示的序列,与所述序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,和HCDR3,其包含SEQ ID NO:7所示的序列,与所述序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,并且所述抗体还包含:
LCDR1,其包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸,或与所述序列具有至少80%,优选81%,
82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,LCDR2,其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,与所述序列具有至少80%,优选81%,
82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,和LCDR3,其包含SEQ ID NO:10所示的序列,与所述序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体还包含选自以下组成的组的重链可变区的框架区FR和轻链可变区的框架区FR:
(1)所述重链可变区的框架区FR包含FR-H1,FR-H2,FR-H3和FR-H4,其中FR-H1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:23所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其列组成;FR-H2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,
93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,
88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H4包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:26所示的序列具有至少80%,优选81%,
82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成,所述轻链可变区的框架区FR包含FR-L1,FR-L2,FR-L3和FR-L4,其中FR-L1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;
(2)所述重链可变区的框架区FR包含FR-H1,FR-H2,FR-H3和FR-H4,其中FR-H1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,
93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,
88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H4包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,所述轻链可变区的框架区FR包含FR-L1,FR-L2,FR-L3和FR-L4,其中FR-L1包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQID NO:35所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与SEQ ID NO:36所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;
(3)所述重链可变区的框架区FR包含FR-H1,FR-H2,FR-H3和FR-H4,其中FR-H1包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,
93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,
88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H4包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与SEQ ID NO:42所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,所述轻链可变区的框架区FR包含FR-L1,FR-L2,FR-L3和FR-L4,其中FR-L1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:43所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-L2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:44所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:45所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:46所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;
(4)所述重链可变区的框架区FR包含FR-H1,FR-H2,FR-H3和FR-H4,其中FR-H1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:47所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-H2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:48所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,
93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-H3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:49所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,
88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-H4包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:50所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,
83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成,所述轻链可变区的框架区FR包含FR-L1,FR-L2,FR-L3和FR-L4,其中FR-L1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:51所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQIDNO:51所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:52所示的序列具有至少
80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:53所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:54所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包括:(1)重链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,和轻链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;
(2)重链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,和轻链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:14所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;
(3)重链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,和轻链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:18所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;
(4)重链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:20所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,和轻链可变区,其包含下述序列或由下述序列组成:
SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,或
与SEQ ID NO:22所示的序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,
92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示的HCDR1-3和LCDR1-3:
重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下:
HCDR1:GYTFTSYW(SEQ ID NO:5),HCDR2:IDPSDSET(SEQ ID NO:6),HCDR3:ARLYRWYFDV(SEQ ID NO:7);和轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下:
LCDR1:EIVGTY(SEQ ID NO:8),
LCDR2:GAS(SEQ ID NO:9),
LCDR3:GQSYNFPYT(SEQ ID NO:10)。
5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体还包含重链恒定区和轻链恒定区,且所述恒定区来自不是鼠类的物种,例如来自人抗体,优选来自人IgG或IgM,更优选IgG1,优选地,所述重链恒定区为Ig gamma-1 chain C region,ACCESSION:P01857(SEQ ID NO:58)或Ig gamma-4 chain C region,ACCESSION:P01861.1(SEQ ID NO:
56);所述轻链恒定区为Ig kappa chain C region,ACCESSION:P01834(SEQ ID NO:57)。
6.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含选自以下组成的组的重链和轻链:
(1)SEQ ID NO:59表示的重链和SEQ ID NO:60表示的轻链;
(2)SEQ ID NO:61表示的重链和SEQ ID NO:62表示的轻链;
(3)SEQ ID NO:63表示的重链和SEQ ID NO:64表示的轻链;
(4)SEQ ID NO:65表示的重链和SEQ ID NO:66表示的轻链;
(5)SEQ ID NO:67表示的重链和SEQ ID NO:68表示的轻链;和(6)SEQ ID NO:69表示的重链和SEQ ID NO:70表示的轻链。
7.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体还包含按照EU编号系统在234和/或235位点引入的氨基酸突变。
8.权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体按照EU编号系统包含突变L234A和/或L235A。
9.权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含选自以下组成的组的重链和轻链:
(1)SEQ ID NO:59表示的重链和SEQ ID NO:60表示的轻链;
(2)SEQ ID NO:61表示的重链和SEQ ID NO:62表示的轻链;和(3)SEQ ID NO:63表示的重链和SEQ ID NO:64表示的轻链。
10.分离的多肽,其包含:
(1)SEQ ID NO:5,6和7所示的序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还包含SEQ ID NO:8,9和10所示的序列;
(2)SEQ ID NO:8,9和10所示的序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还包含SEQ ID NO:5,6和7所示的序列;
(3)选自SEQ ID NO:2,12,16或20所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,
87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:4,14,18或22所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有个或多个(优选1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;或者(4)选自SEQ ID NO:4,14,18或22所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,
87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述单克隆抗体还对应包含选自SEQ ID NO:2,12,16或20所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,
98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列。
11.权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如,scFv)、双价抗体或结构域抗体。
12.权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
-
13.权利要求1-12任一项所述的抗原或其抗原结合片段,其中所述抗体以小于大约10
5M,例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合人CD47蛋白。
14.权利要求1-13任一项所述的抗原或其抗原结合片段,其中所述抗体以小于大约
100nM,例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、
0.1nM或更小的EC50结合人CD47蛋白。
15.编码多肽的分离的多核苷酸,所述多肽选自:
(1)包含SEQ ID NO:5,6和7所示的序列的多肽,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还包含SEQ ID NO:8,9和10所示的序列;
(2)包含SEQ ID NO:8,9和10所示的序列的多肽,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还包含SEQ ID NO:5,6和7所示的序列;
(3)包含选自SEQ ID NO:2,12,16或20所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选
86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列的多肽,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:4,14,18或22所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,
95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;或(4)包含选自SEQ ID NO:4,14,18或22所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选
86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列的多肽,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:2,12,16或20所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,
95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列。
16.权利要求15所述的分离的多核苷酸,其中
(1)所述多核苷酸分子包含下述序列或由下述序列组成:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列,或与所述序列具有至少85%,优选86%,
87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列;
(2)所述多核苷酸分子包含下述序列或由下述序列组成:SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,
87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列。
17.载体,其包含权利要求15或16所述的多核苷酸分子。
18.宿主细胞,其包含权利要求15或16所述的多核苷酸分子,或者权利要求17所述的载体。
19.制备权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括在合适的条件下权利要求18的宿主细胞,以及从细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段的步骤。
20.抗体偶联物,其包括权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段,以及与所述抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分,所述偶联部分为纯化标签(如His标签)、细胞毒性剂,或可检测的标记。优选地,所述偶联部分为放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
21.多特异性抗体,优选双特异性抗体,其包括权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段,以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
22.融合蛋白,其包括权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
23.试剂盒,其包括权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或者包括权利要求20所述的抗体偶联物、权利要求21所述的多特异性抗体或权利要求22所述的融合蛋白。
24.权利要求23所述的试剂盒,所述试剂盒还包括第二抗体,其特异性识别所述抗体或其抗原结合片段;任选地,所述第二抗体还包括可检测的标记,例如放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
25.杂交瘤细胞株以及由其产生的单克隆抗体,所述杂交瘤细胞为杂交瘤细胞株LT012,其保藏编号为CCTCC NO:2018135。
26.权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段,权利要求20所述的抗体偶联物、权利要求21所述的多特异性抗体或权利要求22所述的融合蛋白检测人CD47在样品中的存在或其水平,或在制备检测人CD47在样品中的存在或其水平的试剂盒中的用途。
27.药物组合物,其包含权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段,权利要求
20所述的抗体偶联物、权利要求21所述的多特异性抗体或权利要求22所述的融合蛋白;可选地,其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
28.权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段,权利要求20所述的抗体偶联物、权利要求21所述的多特异性抗体或权利要求22所述的融合蛋白在制备如下药物中的用途:
阻断人CD47与人SIRPα结合的药物,
阻断人CD47活性或下调其水平的药物,或者
阻断人SIRPα与CD47结合所介导的细胞学反应的药物。
29.权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段,权利要求20所述的抗体偶联物、权利要求21所述的多特异性抗体或权利要求22所述的融合蛋白在治疗肿瘤中的用途,或在制备治疗肿瘤的药物中的用途,所述肿瘤优选为表达CD47的肿瘤,优选癌症,例如恶性血液肿瘤或实体瘤,更优选淋巴瘤、结肠癌或乳腺癌;更优选非霍奇金淋巴瘤,进一步更优选B细胞淋巴瘤细胞。
30.权利要求29的所述的用途,所述药物为适于注射的形式,优选是适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
31.体内或体外方法,包括施加包含权利要求1-14任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求20所述的抗体偶联物、权利要求21所述的多特异性抗体或权利要求22所述的融合蛋白的细胞的步骤,或给予有需求的受试者以有效量的所述抗体或其抗原结合片段,所述抗体偶联物,所述多特异性抗体或所述融合蛋白的步骤,所述方法选自如下各项:阻断CD47与人SIRPα的结合的方法,
阻断人CD47活性或下调其水平的方法,或者
阻断人SIRPα与CD47结合所介导的细胞学反应的方法。
说明书 :
抗CD47的单克隆抗体及其用途
技术领域
背景技术
al.Functions and molecular mechanisms of the CD47-SIRPα signalling
pathway.Trends in cell biology,2009,19(2):72-80.)。而正常红细胞由于细胞膜表面的CD47和巨噬细胞的SIPRα结合产生抑制性信号,从而不被吞噬。(Oldenborg P A,
Zheleznyak A,FangY F,et al.Role of CD47 as amarker of self on red blood
cells.Science,2000,288(5473):2051-2054.)。TSP1是由3条肽链组成的同源三聚体,与其它细胞表面受体、基质成分和生长因子相互作用参与细胞增殖、凋亡、粘附、迁移、血管生成等过程(Jiang P,Lagenaur CF,Narayanan V.Integrin-associated Protein Is a
Ligand for the P84 Neural Adhesion Molecule.Journal ofBiological Chemistry
1999.274∶559-62)。
细胞或其他免疫细胞,令其对病原体做出反应。目前研究认为肿瘤细胞具有逃逸巨噬细胞
吞噬的机制,在肿瘤细胞生长过程中表面会形成特异性蛋白比如钙网蛋白,暴露肿瘤身份
吸引巨噬细胞吞噬,但与此同时具有SIRPα的巨噬细胞与高表达CD47的肿瘤细胞由于CD47-SIRPα通路激活抑制巨噬细胞的吞噬作用,巨噬细胞误判为正常细胞致使肿瘤细胞逃逸巨
噬细胞的吞噬(CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and
leukemia cells to avoid phagocytosis.Jaiswal S,Jamieson C H M,Pang W W,et
al.Cell,2009,138(3)271-285)。
CD8+T细胞发挥肿瘤杀伤效应。DC细胞通过抗CD47抗体和亲吞噬分子如钙网蛋白协同作用,吞噬肿瘤细胞,并提呈肿瘤相关抗原给CD8+T细胞,进而发挥CD8+T细胞对肿瘤的特异性杀
伤作用(CD47 blockade as another immune checkpoint therapy for
cancer.Vonderheide R H.Nature Medicine,2015,21(10):1122)。结合这两个机理表明抗CD47抗体极有可能具有同时激活非特异性免疫以及特异性免疫的能力。
恶性血液病和实体瘤的生长和转移(Abstract PR13:The anti-CD47 antibody Hu5F9-G4
is a novel immune checkpoint inhibitor with synergistic efficacy in
combination with clinically active cancer targeting antibodies[J]Chao M P,
McKenna K M,Cha A,et al.,2016)。
发明内容
的杂交瘤细胞株。
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,和
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,并且所述抗体还包含:
96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,
96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,和
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、
4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;
FR-H2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24所示的序列具有至少80%,优选
81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,
96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,
91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H4包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,
86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、
4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、
4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;
FR-L2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28所示的序列具有至少80%,优选
81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,
96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,
91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,
86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、
4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
31的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:31所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:32所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:33所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换,插
入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H4包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:34所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,
90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
35的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:35所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:36所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:37所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:38所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
39的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:39所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H2包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:40所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成,FR-H3包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:41所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H4包含SEQ ID
NO:42的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:42所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
43的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:43所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L2包含SEQ ID NO:
44的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:44所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:
45的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:45所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:46所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
47的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:47所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:48所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或,或与SEQ ID NO:49所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,
88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-H4包含
SEQ ID NO:50的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:50所示的序列具有至少80%,优选81%,
82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,
97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成。
51的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:51所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:52所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,
94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L3包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:53所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,
89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成;FR-L4包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:54所示的序列具有至少80%,优选81%,82%,83%,
84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或
99%以上序列同一性的序列,或与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列相比具有一个或多个
(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,或由其组成。
26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还分别对应包含选自SEQ
ID NO:4,14,18或22所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,
90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;或者
26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述单克隆抗体还对应包含选SEQ
ID NO:2,12,16或20所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,87%,88%,89%,
90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列。
NO:58),或采用Ig gamma-4链C区,更优选GenBank登记号为ACCESSION:P01861.1的Ig
gamma-4链C区(SEQ ID NO:56);轻链恒定区均采用Ig kappa链C区,更优选GenBank登记号为ACCESSION:P01834的Ig kappa链C区(SEQ ID N O:57)。本发明的抗体在6F7H1L1、6F7 H2L2和6F7 H3L3的可变区基础上采用以下恒定区:重链恒定区为Ig gamma-1chain C
region,ACCESSION:P01857(SEQ ID NO:58)或重链恒定区Ig gamma-4chain C region,
ACCESSION:P01861.1(SEQ ID NO:56);轻链恒定区为Ig kappa chain C region,
ACCESSION:P01834(SEQ ID NO:57)。本发明的另一方面涉及编码多肽的分离的多核苷酸,所述多肽包含SEQ ID NO:5,6和7所示的序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部
分,特异性结合人CD47,所述抗体还包含SEQ ID NO:8,9和10所示的序列。
90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:4,14,18或22所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,
87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;或
90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列,其中所述多肽作为抗人CD47的抗体的一部分,特异性结合人CD47,所述抗体还分别对应包含选自SEQ ID NO:2,12,16或20所示的序列或与所述序列具有至少85%,优选86%,
87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%以上序列同一性的序列,或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换,插入或缺失)的氨基酸序列;
述抗体或其抗原结合片段的步骤。
平,或在制备检测人CD47在样品中的存在或其水平的试剂盒中的用途。
明的抗体偶联物或多特异性抗体或融合蛋白的步骤,所述方法选自如下各项:
断有关肿瘤或在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断有关肿瘤的药物中的用途。
源于单个来源,或可以是“嵌合的”,即,抗体的不同部分可来源于如下文中进一步描述的两个不同来源。抗体或其抗原结合片段可通过重组DNA技术在杂交瘤中产生,或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。除非另外指出,否则术语“抗体”,除了包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外,还包括其衍生物、变体和片段。
一个方面,此类片段将保留至少一个存在于抗体全长轻链或重链中的CDR,并且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可通过重组DNA技术产生,
或可以例如通过完整抗体的酶促或化学切割产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括,但不
限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab/c、dAb、Fv、结构域抗体和单链抗体,并且可来源于任何哺乳动物来源,包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔。还设想本文中公开的抗体的功能性部分例如一个或多个CDR可被共价地结合于第二蛋白或小分子以生成导向身体中的特定靶
标的治疗剂,从而具有双功能治疗性质或具有延长的血清半衰期,例如融合蛋白。
轻链包括κ链和λ链。
260,203(所述国际专利申请公开号和美国专利号的公开内容通过引用并入)中进行了详细
描述。
Clin.Exp.Immunol.79:315-321;Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位,所述表位存在于相同或不
同的蛋白质靶标上。
体而言的,其通常包含至少2种或更多种的不同抗体,这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,
1975),但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
此外,受体抗体的框架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替
换,或被其他抗体的氨基酸残基替换,以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容,可参见例如,Jones et al.,Nature,321:522 525(1986);Reichmann et al.,Nature,332:323 329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992);和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。
13,14或15个连续或非连续的氨基酸,其可以是“线性的”或“构象的”。参见,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris,Ed.
(1996)。在线性表位中,蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着
蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中,相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质
氨基酸残基而存在。
糖蛋白而被修饰的或磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可由天然存在的细胞和非重组
细胞产生;或其由基因工程或重组细胞产生,并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分
子,或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。
中,片段的长度为约5至500个氨基酸。例如,片段的长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、
100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段,包括结合结构域。在人CD47抗体的情况下,有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的部分或正好其包括2个CDR的可变结构域等。
70%、75%或80%的序列同一性,至少90%或95%的序列同一性,和至少97%、98%或99%的序列同一性。在某些情况下,不相同的残基位点相异在于保守氨基酸置换。”保守氨基酸置换”是这样的置换,即其中氨基酸残基被具有拥有相似化学性质(例如,电荷或正在水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换。一般地,保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此相异在于保守置换的情况下,可上调百分
比序列同一性以就置换的保守性质进行修正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员
来说是熟知的。参见例如Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族羟基侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸:2)脂肪族羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸:3)含酰胺侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺:4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸:5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸:6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸;和7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。例如,保守氨基酸置换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、苏氨酸-丝氨酸、赖氨酸-精氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺
任何变化。“中度保守的”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
列同源性或序列同一性。参见,例如,GCG Version 6.1(University of Wisconsin,WI)。还可使用缺省或推荐的参数利用FASTA比较多肽序列,参见GCG Version 6.10 FASTA(例如,
FASTA2和FASTA3)提供质询序列与搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一
性(Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990):Pearson,Methods Mo l.Biol.132:185-
219(2000))。当将序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库相比较时,另一个优选算
法是计算机程序BLAST,特别地blastp或tblastn(使用程序提供的缺省参数)。参见,例如,Altschul等人,Mol.Biol.215:403-410(1990):Al tschul等人,Nucleic Acids Res.25:
3389-402(1997)。
瘤细胞CD47亲和力与对照抗体Hu5F9-G4相当,而对正常人RBC亲和力低于对照抗体Hu5F9-
G4,所以本发明抗体在尽量避免影响正常人红细胞的基础上,具有更佳的肿瘤治疗潜能。
附图说明
具体实施方式:
3T3,厂家:ATCC,货号:CRL-1658,在NIH/3T3的基础上转染上述人CD47成熟肽进细胞,构建
3T3-CD47稳定表达系)。取免疫后小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,制成杂交瘤细胞,分别以CD47 IgV TEV-His,3T3-CD47细胞作为抗原,对杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选,获得能够分泌与CD47特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对ELISA筛选得到的杂交瘤细胞,通过竞争ELISA筛选出能够分泌与受体人SIRPαECD-hFc-Biotin(其中SIRPαECD表示SIRPα的胞外区,蛋白GenBank登录号:NP_542970.1的位置31-373;hFc为人IgG Fc纯化标签,具体为Ig gamma-1chain C region,GenbankID:P01857位置114-330)竞争结合人CD47 IgV TEV-
His的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株LT012,其分泌的单克隆抗体命名为6F7。
430072。
receptor alpha chain.Eur J Biochem.1998;258(2):831-6.)以及实施例2获得的抗体
6F7的序列,通过计算机模拟抗体模型,根据模型设计突变,得到抗体6F7H1L1、6F7 H2L2和
6F7 H3L3的可变区序列(抗体恒定区序列,来自NCBI的数据库,重链恒定区序列为Ig
gamma-4 chain C region,ACCESSION:P01861.1;轻链恒定区为Ig kappa chain C
region,ACCESSION:P01834)。
供)载体中,分别获得pUC57simple-6F7H1、pUC57simple-6F7L1;pUC57simple-6F7H2、
pUC57simple-6F7L2、pUC57simple-6F7H3和pUC57simple-6F7L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术,EcoRI&HindIII酶切基因合成的重、轻链全长基因,通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中;获得表达质粒pcDNA3.1-6F7H1,
pcDNA3.1-6F7L1,pcDNA3.1-6F7H2 pcDNA3.1-6F7L2,pcDNA3.1-6F7H3,和pcDNA3.1-6F7L3,并进一步对重组表达质粒的重轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质
粒设计基因组合(pcDNA3.1-6F7H1/pcDNA3.1-6F7L 1,pcDNA3.1-6F7H2/pcDNA3.1-6F7L2,
和pcDNA3.1-6F7H3/pcDNA3.1-6F7L3)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验
证正确后,制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达,培
养7天后收集细胞培养液,采用Protein A柱(MabSelect SURE(GE))进行亲和纯化获得人源
化抗体。
receptor alpha chain.Eur J Biochem.1998;258(2):831-6.)以及实施例2获得的抗体
6F7的序列,通过计算机模拟抗体模型,根据模型设计突变,得到抗体6F7H1L1、6F7 H2L2和
6F7 H3L3的可变区序列(抗体恒定区序列,来自NCBI的数据库,重链恒定区为Ig gamma-
1chain C region,ACCESSION:P01857;轻链恒定区为Ig kappa chain C region,
ACCESSION:P01834),为了与前述实施例3中的人源化抗体相区分,上述人源化抗体分别命名为6F7H1L1(G1)、6F7H2L2(G1)和6F7 H3L3(G1)。
获得pUC57simple-6F7H1、pUC57simple-6F7L1;pUC57simple-6F7H2、pUC57simple-6F7L2、pUC57simple-6F7H3和pUC57simple-6F7L3。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术,EcoRI&HindIII酶切基因合成的重、轻链全长基因,通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-6F7H1,pcDNA3.1-6F7L1,
pcDNA3.1-6F7H2,pcDNA3.1-6F7L2,pcDNA3.1-6F7H3,和pcDNA3.1-6F7L3,并进一步对重组表达质粒的重轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合
(pcDNA3.1-6F7H1/pcDNA3.1-6F7L1,pcDNA3.1-6F7H2/pcDNA3.1-6F7L2,和pcDNA3.1-
6F7H3/pcDNA3.1-6F7L3)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后,制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达,培养7天后收集
细胞培养液,采用Protein A柱(MabSelect SURE(GE))进行亲和纯化获得人源化抗体。
到丙氨酸的点突变(L235A),获得了新的人源化抗体,并分别命名为6F7H1L1(G1M)、6F7H2L2(G1M)和6F7 H3L3(G1M)。
PBST洗板3次。洗板后加入1∶5000比例稀释的HRP标记的羊抗人IgG(H+L)(购自Jackson
ImmunoResearch Inc.,货号:109-035-088)二抗工作液,置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板3次,后加入TMB(Neogen,308177)避光显色5min,加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中,选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
PBST洗板3次。洗板后加入1∶5000比例稀释的HRP标记的羊抗人IgG(H+L)(购自Jackson
ImmunoResearch Inc.,货号:109-035-088)二抗工作液,置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板3次,后加入TMB(Neogen,308177)避光显色5min,加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中,选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
行分析处理。
0.194nM,阻断活性与Hu5F9-G4相同。
0.274nM,阻断活性与Hu5F9-G4相当。
体结合,抗原浓度为3.125-100nM(两倍梯度稀释),结合时间为420s,抗原抗体在PBST中解离,时间600s。
CDR区结合CD47的能力与Hu5F9-G4相当,都具有较强的结合能力。
CD47 IgV-TEV-His固定于CM5芯片表面,固定的信号值为171.6RU。抗体与人CD47结合,抗体浓度为0.78-12.5nM(两倍稀释),流速为30μL/min,结合的时间为120s,解离时间为300s。芯片使用3M MgCl2再生,流速为30μL/min,时间为30s。数据以1∶1模型拟合分析,得到亲和力常数。使用Biacore Control 2.0软件进行数据采集,Biacore T200 Evaluation 2.0软件
进行数据分析。6F7 H1L1(hG4)以及Hu5F9-G4(作为对照抗体)与人CD47 IgV TEV-His亲和
力常数检测结果见表6,检测结果如图6、7。
(hG4)与人CD47有较强的结合能力。
Hu5F9-G4 4.42E-11 3.00E+06 8.49E+03 1.32E-04 5.69E-07 238.81-327.23
心管中加入15mL Ficoll Plaque分离液,按照3∶4体积比缓慢加入稀释后的新鲜血液于分
离液液面上,即每管加入稀释后的血液20mL;1550rpm离心30min;小心吸取离心管底部RBC并用PBS离心洗涤3次;用500μL 1%PBSA重悬细胞沉淀,计数;调整RBC细胞浓度,按每管30万细胞将细胞转移至1.5mL离心管;5600rpm/min离心5min,弃上清;按实验设计加入相应浓度的抗体(终浓度为,100,10,1,0.1,0.01,0.001,nM),每管100μL,并设计Blank(PBSA+细胞)和同型对照(hIgG)组,冰上孵育1h;加入500μL1%PBSA,5600rpm/min离心5min,去上清;
每管加入100μL FITC山羊抗人IgG(1∶500),混匀后,冰上避光孵育30min;加入500μL 1%PBSA,5600rpm/min离心5min,去上清;200μL1%洗涤缓冲液/管重悬细胞,在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。
EC50分别为0.077nM和0.057nM,两者结合活性相当。
1hr;1hr后,加入1%PBSA,5600rpm离心5min,去上清;每管加入100μL FITC山羊抗人IgG(1∶
500),混匀后冰上避光孵育30min;加入500μL 1%PBSA,5600rpm离心5min,去上清;1%PBSA/管重悬细胞,在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。以MFI和样品浓度进行曲线
拟合,计算EC50。
100μL SIRPα-mFc,混匀,终浓度为20nM,冰上继续孵育1h;加入1%PBSA,5600rpm离心5min,弃上清;加入FITC山羊抗鼠IgG,每管100μL(1∶500稀释),冰上避光孵育40min;加入1%PBSA,5600rpm离心5min,弃上清。加200μL 1%PBSA重悬细胞沉淀,转移至流式上样管;在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。以MFI和样品浓度进行曲线拟合,计算EC50。
后的血液稀释比例为1∶3)。往50mL的离心管中加入15mL Ficoll Plaque plus分离液(GE,货号:17-1440-02),按照3∶4体积比缓慢加入稀释后的新鲜血液于分离液液面上,既每管加入稀释后的血液20mL。每管配平后离心1550rpm,30min。吸取中间白膜层的细胞PBMC。按照细胞体积比∶血液缓冲液=1∶4的比例加入血液缓冲液混合均匀,离心950rpm,15min后弃上清。加入血液缓冲液20mL将PBMC混悬,离心弃上清。离心,重复洗两次。用10mL RPMI-1640(无FBS)洗涤细胞一次。离心弃上清,用5mL RPMI-1640(含10%FBS)重悬细胞,计数,3*105细胞/样本,每管加入500μL 1%PBSA,5600rpm离心5min弃上清;按加入相应浓度的抗体(终浓度为300,100,10,1,0.1,0.01,0.001nM),每管100μL,并设计Blank(PBSA+细胞)和同型对照(人IgG),冰上孵育1h;加入1%PBSA,5600rpm离心5min,去上清;每管加入100μL FITC山羊抗人IgG(Jacson,货号:109-095-098,1∶500稀释)或FITC山羊抗鼠IgG(BD bioscience,货号:555988)(1∶500),混匀后冰上避光孵育30min;加入1%PBSA,5600rpm离心5min,去上清;200μL洗涤缓冲液/管,重悬细胞,在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。Flowing software分析结果,GraphPad prism 5分别以MFI和样品浓度进行曲线拟合,计算EC50。
结合EC50分别为0.60nM和0.06nM,Hu5F9-G4与RBC的亲和力高出6F7 H1L1(hG4)约10倍。
6F7 H1L1(hG4) 10.25 19.55 47.29 134.58 152.50 185.31 190.18 0.60
0.1、0.01、0.001、0.0001nM),同时设置空白对照(100μL 1%PBSA加细胞)和同型对照(人IgG),冰上孵育30min。每管加入100μL SIRPα-ECD-mFc(mFc的序列如SEQ ID NO:71所示),使终浓度为20nM,混匀,冰上继续孵育1h;加入1%PBSA,5600rpm离心5min,弃上清;加入FITC山羊抗鼠IgG,每管100μL(1∶500稀释),冰上避光孵育40min;加500μL 1%PBSA,
5600rpm离心5min,弃上清。加200μL 1%PBSA重悬细胞沉淀,在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。
6F7 H1L1(hG4) 50.27 54.37 42.64 16.80 15.66 14.83 0.017
100μL FITC山羊抗人IgG(1∶500),混匀后冰上避光孵育30分钟;加入500μL1%PBSA,
5600rpm离心5分钟,去上清;200μL1%PBSA/管重悬细胞,转移至流式上样管;上流式细胞仪BD FACSCalibur检测;Flowing software分析结果,GraphPad prism 5分别以MFI和样品浓度进行曲线拟合,计算EC50。
和0.06nM,6F7 H1L1(hG4)略优于Hu5F9-G4。
6F7 H1L1(hG4) 15.26 25.41 48.15 135.95 146.67 149.81 0.02
6F7 H1L1(hG4) 56.79 59.59 64.52 34.21 23.76 26.52 17.46 11.35 9.44 0.10
3
体积达到100-120mm 左右时,将小鼠按照肿瘤体积平均分成5组,模型组、Hu5F9-G4高剂量组、Hu5F9-G4低剂量组、6F7 H1L1(hG4)高剂量组和6F7 H1L1(hG4)低剂量组,高剂量组给药剂量为0.2mg/kg,低剂量组给药剂量为0.02mg/kg,分组当天记为D0,分别在D0,D3,D7,D10,D14,D17给药,每组7只。
间比较采用GraphPad统计学处理软件处理后,进行单因素方差分析评价结果。
MDA-MB-231肿瘤生长的抑制均具有量效关系,对照抗体Hu5F9-G4高剂量组、6F7 H1L1(hG4)高剂量组、6F7 H1L1(hG4)低剂量组的TGI(%)分别为67%、63%、25%,与对照抗体组相比,
6F7 H1L1(hG4)低剂量组药效显著优于Hu5F9-G4,高剂量相当6F7 H1L1(hG4)高剂量药效与
对照抗体高剂量相当,(P>0.05)。
些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
GGCATGATCGACCCAAGCGATTCCGAGACCCACAACAATCAGATGTTTAAGGACAAGGCCACCCTGACAGTGGATA
AGAGCTCCAATACCGCCTACATGCACCTGTCTAGCCTGACATCTGAGGACAGCGCCGTGTATCACTGCGCCCGGCT
GTACAGATGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCCTCT(SEQ ID NO:1)
TACGGCGCCTCCAATCGGTATACAGGCGTGCCTGACAGATTCACCGGCTCTGGCAGCGCCACAGACTTCACCCTGA
CAATCTCTAACGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGATTATCACTGCGGCCAGAGCTACAATTTCCCTTATACCTTTGG
CGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:3)
GGAATGATCGACCCTTCCGATTCTGAGACCCACAATGCCCAGAAGTTTCAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACA
AGAGCACCTCCACAGCCTACATGCACCTGAGCTCCCTGCGGTCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGCT
GTACCGCTGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:11)
TACGGAGCAAGCAACAGGTATACCGGAGTGCCAGCACGCTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTTTACCCTGA
CAATCAGCTCCGTGCAGCCTGAGGACCTGGCCGATTATCACTGCGGCCAGTCTTACAATTTCCCATATACCTTTGG
CGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:13)
GGAATCATCGACCCTTCCGATTCTGAGACCTCTAATGCCCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCCTGACAGTGGACA
AGAGCACCTCCACAGCCTACATGCACCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGCT
GTACCGCTGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:15)
TATGGCGCCAGCAACAGGGCAACCGGCATCCCCGCACGCTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTTTACCCTGA
CAATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACCTGGCCGATTACTATTGCGGCCAGTCTTACAATTTCCCATATACCTTTGG
CGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:17)
GGCATCATCGACCCTTCCGATTCTGAGACCTCTTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCAGGGTGACCCTGACAGTGGACA
AGAGCACCTCCACAGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGCGCAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGCT
GTACAGATGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:19)
TACGGAGCCAGCACCAGGGCAACAGGCATCCCCGCACGCTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGA
CAATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCCGTGTACTATTGCGGCCAGTCTTACAATTTCCCATATACCTTTGG
CGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:21)
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:55)
DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:56)
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:58)
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
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NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:59)
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NO:60)
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YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:61)
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NO:62)
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NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:63)
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ID NO:65)
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NO:66)
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PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST
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QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC