循环血外泌体miR-146a-5p作为视网膜静脉阻塞治疗及预后评估标志物中的应用

摘要

本发明公开了循环血外泌体miR‑146a‑5p作为视网膜静脉阻塞治疗及预后评估标志物中的应用，通过动物实验验证候选基因在疾病治疗过程中的改变，进一步探索miRNA与RVO抗VEGF治疗的关系，证实了血浆外泌miR‑146a‑5p表达量的上调能作为预测治疗效果良好的辅助指标，因此，本发明为诊断视网膜静脉阻塞提供了新的研究方向。

权利要求

1.检测循环血外泌体miR-146a-5p表达水平的试剂在制备视网膜静脉阻塞治疗或预后评估的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的检测循环血外泌体miR-146a-5p表达水平的试剂在制备视网膜静脉阻塞治疗或预后评估的试剂盒中的应用，其特征在于，所述视网膜静脉阻塞包括视网膜中央静脉阻塞和视网膜分支静脉阻塞。

3.根据权利要求1所述检测循环血外泌体miR-146a-5p表达水平的试剂在制备视网膜静脉阻塞治疗或预后评估的试剂盒中的应用，其特征在于，所述视网膜静脉阻塞治疗为抗VEGF治疗。

4.根据权利要求1所述检测循环血外泌体miR-146a-5p表达水平的试剂在制备视网膜静脉阻塞治疗或预后评估的试剂盒中的应用，其特征在于，试剂盒中还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、荧光探针、RNA酶抑制剂和Taq酶。

说明书

循环血外泌体miR-146a-5p作为视网膜静脉阻塞治疗及预后

评估标志物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及到循环血外泌体miR-146a-5p作为视网膜静脉阻塞治疗及预后评估标志物中的应用。

背景技术

[0002] 视网膜静脉阻塞(retina vein occlusion，RVO)作为一种常见的视网膜血管性疾病，是全球范围内导致视力损害的重要原因。根据阻塞部位的不同，RVO分为视网膜中央静脉阻塞(central retina vein occlusion，CRVO)与视网膜分支静脉阻塞(branch retina vein occlusion，BRVO)，其共同的发病原因包括动脉硬化压迫、血管内皮损伤诱发血栓形成以及血管炎症等。此外，血流动力学改变诸如高脂血症、多发性骨髓瘤和甲状腺功能亢进等引起血液粘滞性升高的疾病也可能是诱发RVO的原因。视网膜毛细血管无灌注、黄斑水肿和视网膜出血等病理变化是造成视力损害的主要原因。RVO患者的眼底可见视网膜内出血、黄斑囊样水肿、渗出和棉绒斑。已有研究表明，RVO会引起血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胎盘生长因子(placental growth factor，PGF)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)等炎症因子的增多，从而导致黄斑水肿、血管渗漏甚至虹膜新生血管等病理改变。虽已有许多关于RVO发病诱因的研究，但其确切的发病原因和分子机制尚未有明确的结论。

[0003] 外泌体是一种可由多种细胞分泌的具有磷脂双分子层的分泌型囊泡样小体，电镜下观察其直径在30-150nm，在细胞内由多泡体(multivesicular body，MVB)的外膜内陷形成，可包裹多种如表面蛋白受体、脂质、mRNA、microRNA(miRNA)及其它非编码RNA等细胞内基因信息。当MVB外膜与细胞膜融合，其内的外泌体从细胞中释放，进入细胞间质，可以被临近的受体细胞吸收，或随体液运输到远端作用于不同的细胞。不同类型的多种活细胞在生理或病理状态下均能分泌外泌体，因此，外泌体广泛存在于生物体的如血液、尿液、唾液、脑脊液、腹水和胸水等多种体液中，且其内容物和膜表面标志物等更具供体细胞的特性。由于外泌体的磷脂双分子层结构，且富含RNA，能较为容易地将核酸转移到受体细胞中，是一种良好的信息传递工具。外泌体的磷脂双分子层使外泌体中的分子不容易被破坏，能相对稳定地存在于体液中，因此外泌体携带的特异性的分子信息，可以作为理想的生物标志物。

[0004] RVO的并发症中，黄斑水肿是最常见且最影响中心视力的一种，其发生原因与RVO后，血流循环障碍、血管内皮细胞通透性增加有关。RVO并发黄斑水肿的治疗中，抗VEGF药物治疗是目前应用广泛的方法，常用的药物包括雷珠单抗和康柏西普等。血液是人类所有疾病最好的信使，外泌体携带细胞内信使释放到各种体液中，为体液检测提供了新思路。在已有的临床标志物中，特异性良好的血液游离miRNA并未发现。外泌体miRNA比游离的miRNA更具有标志物的潜质。

[0005] 我们收集了RVO患者抗VEGF药物治疗前后的血浆外泌体，通过高通量测序并生物信息学分析，筛选外泌体miRNA在RVO疾病中的表达差异，进一步通过实时荧光定量PCR验证表达水平，探讨其作为疾病治疗效果以及预后评估中的应用可行性，以期能为RVO类疾病提供新的诊疗思路及理论依据。

发明内容

[0006] 针对现有技术存在的不足，本发明的要保护的是发现了循环血外泌体miR-146a-5p作为视网膜静脉阻塞治疗及预后评估的标志物中的新用途，为视网膜静脉阻塞预后效果提供更加精准，便捷的方式。

[0007] 本发明的目的在于提供一种与视网膜静脉阻塞治疗和预后效果辅助评估相关的循环血外泌体miRNA标志物。

[0008] 本发明的另一目的在于提供上述循环血外泌体miRNA及其引物在制备视网膜静脉阻塞治疗或预后评估的试剂盒中的应用。

[0009] 本发明的又一目的在于提供用于视网膜静脉阻塞治疗或预后评估的试剂盒。

[0010] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

[0011] 一种与视网膜静脉阻塞治疗和预后效果辅助评估相关的循环血外泌体miRNA标志物，该标志物为miR-146a-5p。

[0012] 上述的循环血外泌体miR-146a-5p标志物在视网膜静脉阻塞治疗和预后效果辅助评估中的应用。

[0013] 上述的循环血外泌体miR-146a-5p标志物在制备视网膜静脉阻塞治疗和预后效果辅助评估试剂盒中的应用。

[0014] 一种与视网膜静脉阻塞治疗和预后效果辅助评估相关的循环血外泌体miR-146a-5p标志物的引物；

[0015] 上述的引物在视网膜静脉阻塞治疗和预后效果辅助评估试剂盒中的应用。

[0016] 一种视网膜静脉阻塞治疗和预后效果辅助评估试剂盒，该试剂盒中含有miR-146a-5p引物。

[0017] 该试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂。

[0018] 该试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。

[0019] 本发明所涉及的循环血外泌体miR-146a-5p的序列均已公开，如其序列如SEQ ID NO.1所示。miR-146a-5p标志物的扩增引物均可通过市场购买获得，本发明实施例中使用的循环血外泌体miR-146a-5p的引物为购自广州复能基因有限公司(GeneCopoeia)提供的特异性miRNA茎环PCR引物。

[0020] 本发明的有益效果在于：相较于传统的外周血游离miRNA检测，外泌体作为新型的生物标志物的代表，具有稳定性好、灵敏性和特异性高的特点。外泌体的磷脂双分子层使外泌体中的分子不容易被破坏，能相对稳定地存在在体液中，其受到外界干扰性低，能够作为一种更加精准稳定的标记物。另外，外泌体由供体细胞的内质网产生，并非细胞死亡破碎产生，因此相比于血液游离RNA，外泌体更具有标志物的潜质。

[0021] 本申请通过比较抗VEGF治疗前后循环血外泌体miRNA的差异表达，结合患者治疗前后的临床表现，分析miRNA与抗VEGF治疗效果的关系。通过动物实验验证候选基因在疾病治疗过程中的表达改变，进一步探索miRNA与RVO和抗VEGF治疗的关系，证实了血浆外泌体中miR-146a-5p表达量的上调能作为预测治疗效果良好的辅助指标，本发明为诊断视网膜静脉阻塞治疗预后效果提供了新的研究方向。

附图说明

[0022] 图1：RVO患者接受抗VEGF治疗前后外周血浆外泌体miRNA的变化。A：与治疗前(RVO)比较，抗VEGF治疗后(RVO-t)患者血浆外泌体源miRNA表达差异，以|log(Fold Change)|＞1位阈值，P＜0.05为显著差异；B：可能与抗VEGF治疗相关的12个miRNA表达差异热图；C：同一患者抗VEGF治疗前与抗VEGF治疗7天后，外周血血浆外泌体中miRNA-146a-5p的表达量(单因素方差分析，n＝17，***：P＜0.001，****：P＜0.0001)；D：同一患者抗VEGF治疗前与抗VEGF治疗7天后，外周血血浆外泌体中miRNA-96-5p的表达量；图2：抗VEGF治疗RVO继发黄斑水肿的疗效观察。A：患者入院时黄斑区OCT图像，可见明显的黄斑囊样水肿，中心凹结构消失，视网膜浆液性脱离，CFT＝1201μm；B：同一患者抗VEGF治疗1月后复查黄斑区OCT图像，视网膜平伏，黄斑中心凹结构恢复，CFT＝164μm。C：患者抗VEGF治疗前后OCT测量的CFT，与治疗前相比，治疗后CFT明显下降，即黄斑水肿明显减轻(配对t检验，n＝17，**：P＜0.01)。D：患者抗VEGF前后对数记录法的BCVA，与治疗前相比，抗VEGF治疗后视力明显提高(配对t检验，n＝17，*：P＜0.05)；图3：抗VEGF治疗RVO继发黄斑水肿前后，血浆外泌体miRNA表达量与CFT、BCVA改变的关系，以患者CFT明显减小、黄斑水肿明显消退为治疗效果良好的判断标准，对在患者治疗后外周血外泌体miR-146a-5p的表达量与治疗前的比较进行ROC曲线分析，AUC＝0.918；

[0023] 图4：RVO动物模型及玻腔抗VEGF注药的影响；A：小鼠眼底成像。B-C：RVO模型造模后眼底成像，静脉损伤部位明显狭窄，近端血管收缩，远端迂曲扩张。D：小鼠RVO造模7天后，眼底荧光素血管造影视网膜血管循环时间(配对t检验，n＝4，***：P＜0.001)。E：小鼠RVO模型玻璃体液中VEGF含量(t检验，n＝4，***：P＜0.001)。F：小鼠RVO模型视网膜中VEGF含量(t检验，n＝4，**：P＜0.01)。G：小鼠RVO模型及抗VEGF治疗后视网膜miRNA-146a-5p表达量。Control：无处理组；RVO：RVO造模7天后玻璃体腔注药假手术处理7天后；anti-VEGF：RVO造模7天后，玻璃体腔注射抗VEGF药物，注药7天后。与对照组相比，RVO组视网膜miR-146a-5p轻微下调，抗VEGF治疗组明显上调(单因素方差分析，n＝5，*：P＜0.05)。

具体实施方式

[0024] 下面将结合附图以及实施例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。

[0025] 收集温州医科大学附属眼视光医院，40-80岁，经临床检查确诊为RVO，伴有继发的黄斑水肿的病人，详细病例资料，及抗VEGF治疗前的外周血10mL和玻璃体腔注射抗VEGF药物7天后的外周血10mL；

[0026] 外周血采血使用一次性EDTA抗凝真空采血管，2000×g，4℃离心10分钟，分离血浆与血细胞，分别于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

[0027] 其中RVO的诊断标准为：眼底表现：视网膜静脉迂曲扩张，伴有或不伴有火焰状出血，部分可见及灰白色棉絮斑；FFA：动静脉期阻塞的静脉迂曲、充盈迟缓，血管壁着色，荧光渗漏，黄斑区荧光增强，部分患者可见无灌注区；OCT：黄斑水肿，视网膜内积液等。

[0028] RVO收集病例排除了以下几种情况的病例：

[0029] ①患有其它眼底疾病，包括糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、视网膜脱离、黄斑裂孔、色素性视网膜炎、视神经炎以及葡萄膜炎等；

[0030] ②出现严重并发症，如玻璃体积血、严重白内障、新生血管性青光眼等；

[0031] ③既往已接受过视网膜光凝或糖皮质激素玻璃体腔注药术；

[0032] ④患有马凡氏综合征等特殊遗传病或白血病、甲状腺功能亢进症或多发性骨髓瘤等特殊全身性疾病；

[0033] ⑤患有病毒性肝炎、梅毒或艾滋等感染性疾病；

[0034] ⑥患有严重心脑血管疾病，严重肝肾功能不全或凝血功能异常。

[0035] 样品处理

[0036] 抽取同一RVO患者抗VEGF治疗前的外周血和玻璃体腔注射抗VEGF药物7天后的外周血，对血浆外泌体进行分离：

[0037] (1)去除细胞碎片：冻存的血浆冰上解冻后，2000g，4℃离心10分钟，上清转移至新的离心管。10000×g，4℃离心40分钟，上清转移到新的离心管中。为方便操作，使用1.5mL离心管时，使用的血浆体积一般不超过1.2mL。

[0038] (2)分离外泌体：加入1/3血浆体积的广州锐博生物公司生产的Exosome Isolation Reagent外泌体提取试剂，用移液枪吹打充分混匀后，4℃静置30分钟。不宜剧烈震荡，以免影响得率。

[0039] (3)外泌体收集：15000×g，4℃离心15分钟，弃去上清，沉淀即获得的外泌体。

[0040] 抗VEGF治疗前和治疗后RVO患者血浆外泌体总RNA提取

[0041] 血浆外泌体总RNA提取均使用Omega Bio-tek生产的 Total RNA Kit。

[0042] (1)裂解：在外泌体沉淀中加入1mL reagent，研磨器充分研磨后室温静置1-2分钟充分裂解。

[0043] (2)萃取：在匀浆中加入200μL三氯甲烷，上下颠倒充分混匀后，冰上静置10分钟。12000×g，4℃离心15分钟，样品将分为三层。

[0044] (3)过柱：将上层无色透明水相液体的70％转移至新的离心管中，避免吸入中层杂质和下层液体。加入等体积70％乙醇，上下颠倒充分混匀。将混合的液体加入 RNA Column，每次不超过700μL，12000×g，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，Column继续使用，再次将余下混合液加入Column中，离心，可反复多次直到混合液全部过柱。

[0045] (4)洗膜：在Column中加入Wash buffer I500μL，12000×g，室温离心30秒，弃去收集管中液体。向Column中加入预先按比例添加无水乙醇的Wash buffer II 500μL，12000×g，室温离心30秒，弃去收集管中液体，重复两次。

[0046] (5)甩干：20000×g室温离心两分钟，甩干洗涤液。

[0047] (6)溶解：靠近滤过膜加入40μL DEPC水，室温孵育5分钟后，更换收集管，最大转速室温离心1分钟，收集滤过的液体。

[0048] (7)检测浓度：酶标仪检测RNA浓度和纯度，RNA纯度检测结果：吸光度260/280比值在1.8-2.1之间为合格。若浓度过低，可使用滤过的液体再次加入滤过膜孵育5min，再次离心收集后检测RNA浓度和纯度。或提前预热DEPC水，增加RNA溶解度。

[0049] 抗VEGF治疗前和治疗后RVO患者血浆外泌体RNA测序

[0050] 收集8个RVO患者抗VEGF治疗前和治疗后的血浆外泌体中的RNA，反转录为cDNA后进行非特异性PCR扩增，再使用Illumina HiSeq 2500进行miRNA高通量测序，去除反转录时使用的接头，过滤＜17nt的片段(由广州复能基因有限公司提供)。与治疗前的结果相比较，得到的差异表达基因共452个，使用edgeR检验工具检验，认为其中36个上调和27个下调基因共计63个miRNA的表达差异具有显著性，结果如图1A所示。

[0051] 外泌体miRNA作为RVO病患抗VEGF治疗预后效果生物标志物的筛选在63个差异表达的miRNA中，针对表达量较高且差异较大的12个miRNA(图1B)进行一一验证，申请人在本申请中对miR-146a-5p和miR-96-5p在RVO的抗VEGF治疗过程中起的调控作用进行验证。针对miR-146a-5p和miR-96-5p我们进一步研究了它在RVO疾病和治疗过程中的表达情况。

[0052] 对另外收集的17例病例的抗VEGF治疗前后的外周血样本进行检测，其临床检查资料如下：9例男性，8例女性，年龄60.8土10.3岁(46岁-74岁)。同时收集了20位白内障患者外周血作为对照，基本资料为：12例男性，8例女性，年龄62.65±7.5岁(46岁-71岁)，经检验，二者无差异(t检验，P＝0.8727)。随后检测这17组抗VEGF治疗前后的外周血样本外泌体的miR-146a-5p和miR-96-5p表达量和对照组的miR-146a-5p和miR-96-5p表达量。与对照组相比，RVO患病组病人外周血外泌体miR-146a-5p的表达量轻微下调，同一组病人抗VEGF治疗7天后外周血外泌体miR-146a-5p的表达量明显升高(图1C)，而与对照组中的miR-96-5p表达差异性较大，RVO患病组病人外周血外泌体miR-96-5p的表达量轻微下调，同一组病人抗VEGF治疗7天后外周血外泌体miR-96-5p的表达量不具备明显差异。

[0053] RVO患者血浆外泌体miR-146a-5p表达量与RVO病患抗VEGF治疗预后效果的关系[0054] 收集上述17组病例抗VEGF治疗前和治疗一月后OCT检查最佳矫正视力。RVO继发的黄斑水肿的OCT图像可分为三种：视网膜海绵样肿胀、黄斑囊样水肿或视网膜神经上皮浆液性脱离。如图2A中所示，治疗前患者黄斑高度水肿，黄斑中心凹结构不可辩，视网膜内出现囊样液腔，神经上皮与色素上皮间出现液性腔隙。患者接受抗VEGF治疗一月后，复查OCT见黄斑结构恢复，视网膜内液腔消失，视网膜平伏，各层结构清晰，如图2B所示。

[0055] 我们以患者治疗后OCT黄斑区厚度明显下降、黄斑水肿明显消退为治疗效果良好的判断标准，对在治疗后患者外周血外泌体miR-146a-5p的表达量进行ROC曲线分析(图3)，结果显示miR-146a-5p的上调作为疗效良好的标志物预测准确度非常好(AUC＝0.918)。

[0056] 结果表明，RVO患者抗VEGF治疗后，血浆外泌体中miR-146a-5p表达量的上调能作为预测治疗效果良好的辅助指标。

[0057] RVO动物模型中miR-146a-5p的改变

[0058] 为了研究患者miR-146a-5p的表达量改变是否确实由于抗VEGF治疗引起，我们在micro IV眼底成像系统辅助下，使用激光光凝损伤视网膜血管，在小鼠体内模拟了RVO的疾病模型，与光凝前(图4A)相比，损伤处血管明显狭窄，远端血管扩张充盈，近端收缩(图4B-C)。在激光光凝视网膜血管7天后，FFA检测视网膜血管循环时间，验证视网膜血管是否阻塞，模型是否有效建立(图4D)。结果显示，造模眼的视网膜血管循环时间明显延长，表示模型成功建立(配对t检验，n＝4，p＝0.0008)。

[0059] 此后，我们利用ELISA法检测了小鼠RVO模型眼内VEGF的含量(图4E-F)，结果显示，RVO造模组玻璃体液中VEGF含量明显高于对照组(n＝4，P＝0.0006)，视网膜中趋势相同，且含量高于玻璃体液中(n＝4，P＝0.0012)。证明RVO造模造成小鼠眼内玻璃体液中及视网膜中VEGF的表达量上升。

[0060] 随后我们在造模7天后，对治疗组玻璃体腔注射康柏西普2μL，RVO疾病组进行假手术处理，即只进行汉密尔顿针刺入而不注射药物。在玻腔注射药物7天后取小鼠视网膜检测其miR-146a-5p的表达量(图4G)。结果显示，与RVO患者及抗VEGF治疗后血浆外泌体miR-146a-5p的改变趋势相同，与对照组相比，RVO模型小鼠视网膜中miR-146a-5p轻微下调，抗VEGF治疗后miR-146a-5p表达明显上调(单因素方差分析，n＝5，p＝0.0122)。

[0061] 结果表明，RVO病理过程及RVO发生后玻璃体腔注射抗VEGF药物，能引起小鼠视网膜中miR-146a-5p的表达量改变。

[0062] 我们将RVO患者抗VEGF治疗疗效结果与血浆外泌体中miR-146a-5p检测结果结合分析，发现在RVO患者抗VEGF治疗过程中，miR-146a-5p的改变可以作为预测临床疗效良好的辅助分析指标，具备特异性和灵敏性。在我们的研究结果中，RVO患者miR-146a-5p表达量下调，而接受抗VEGF治疗后，miR-146a-5p表达显著上调，这表明miR-146a-5p在RVO发生发展和治疗过程中起到重要作用。

[0063] 以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。