用于结核分枝杆菌感染检测的抗原组合物

摘要

本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原组合物。本发明筛选出的15条相配的特异性组合多肽，使结核分枝杆菌感染测定结果灵敏度更高、特异性更强。

权利要求

1.抗原组合物，其包含序列如SEQ ID NO:1～15所示的多肽。

2.编码权利要求1所述的抗原组合物的核酸。

3.含有权利要求2所述的核酸的载体。

4.含有权利要求2所述核酸或权利要求3所述载体的宿主细胞。

5.含有权利要求1所述的抗原组合物的结核分枝杆菌感染检测试剂盒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其还含有配对的抗γ‑干扰素第一抗体和第二抗体、固相载体、反应缓冲液、洗涤液、γ‑干扰素抗原标准品、阳性对照刺激物以及阴性对照中的一种或多种；

所述第一抗体偶联有信号物质。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述第二抗体固定包被于所述固相载体上；所述固相载体选自试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔或微球。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述固相载体为磁微粒。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，所述信号物质选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，所述信号物质为吖啶酯。

11.权利要求1所述的抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应的检测试剂或试剂盒中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，所述的检测试剂或试剂盒采用基于化学发光法、放射免疫法、酶联免疫反应法或胶体金技术检测γ‑干扰素。

说明书

用于结核分枝杆菌感染检测的抗原组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及医学检测领域，具体而言，涉及一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原组合物。

背景技术

[0002] 结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，全球范围内，结核病是导致死亡的十大原因之一。目前对结核病的诊断主要依据临床症状、胸部X光片及细菌学检查，这些传统的诊断方法费时且检测率低，延误了早期发现及早期治疗的最佳时机。早期人们发现结核分枝杆菌可以刺激体内T细胞产生免疫反应，利用结核分枝杆菌的纯化抗原(tuberculinpurifiedproteinderivate，PPD)做成结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)可快速诊断结核病。然而随着人们对诊断方法的深入研究发现，结核菌素试验存在诸多缺点，例如TST中使用的纯蛋白衍生物PPD的某些抗原成分与卡介苗和大多数环境中非结核分枝杆菌的抗原成分相同，易发生交叉反应，使TST出现较高的假阳性率，诊断特异性较低。

[0003] 而现目前采取结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应(即γ‑干扰素释放试验，IGRAs)的主要原理：受到结核分枝杆菌抗原刺激致敏的T淋巴细胞(T细胞)再次遇到相同抗原时可产生γ‑干扰素，IGRAs通过检测样本中的T细胞在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下产生的γ‑干扰素，判断受试者是否存在结核分枝杆菌感染。目前，国际上较成熟的IGRAs有两种：一是检测全血中致敏T细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的γ‑干扰素水平；二是测定在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中能够释放γ‑干扰素的效应T细胞数量。目前用于刺激的试剂主要为各种组合抗原，如常用的ESAT‑6和CFP‑10等抗原肽，单个抗原肽对于检测的灵敏度不能满足，需多个抗原肽联合检测，从而提高检测的灵敏度。而抗原肽的制定过程中，易产生类毒素，使测定结果产生假阳性，从而使测定的特异性降低。

发明内容

[0004] 本发明综合以上矛盾，获得了一种具有较高灵敏度和特异性的可用于结核分枝杆菌感染或者结核病的检测所需的组合多肽作为刺激物。

[0005] 本发明涉及一种抗原组合物，其包含序列如SEQ ID NO:1～15所示的多肽。

[0006] 可选的，如上所述的抗原组合物，SEQ ID NO:1～15所示的多肽中的任意2种或多种融合形成融合肽。

[0007] 本发明还提供编码如上所述的抗原组合物的核酸。

[0008] 本发明还提供含有如上所述的核酸的载体。

[0009] 本发明还提供含有如上所述核酸或如上所述载体的宿主细胞。

[0010] 本发明还提供含有如上所述的抗原组合物的结核分枝杆菌感染检测试剂盒。

[0011] 可选的，如上所述的试剂盒，其还含有抗γ‑干扰素抗体、固相载体、反应缓冲液、洗涤液、阳性对照刺激物以及阴性对照中的一种或多种；

[0012] 所述γ‑干扰素抗体偶联有信号物质。

[0013] 可选的，如上所述的试剂盒，所述γ‑干扰素抗体固定包被于所述固相载体上。

[0014] 可选的，如上所述的试剂盒，所述固相载体选自试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔或微球。

[0015] 可选的，如上所述的试剂盒，所述信号物质选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。

[0016] 本发明还涉及如上所述的抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应的检测试剂或试剂盒中的应用。

[0017] 可选的，如上所述的应用，所述的检测试剂或试剂盒用于执行如下方法中的任一项：

[0018] 酶联免疫斑点试验、酶联免疫吸附试验、免疫胶体金试验、细胞因子内染色和T细胞增殖试验。

[0019] 本发明筛选出的上述相配的特异性组合多肽，使结核分枝杆菌感染测定结果灵敏度更高、特异性更强。

具体实施方式

[0020] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0021] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0022] 本发明涉及一种抗原组合物，其包含序列如SEQ ID NO:1～15所示的多肽。

[0023] 本发明涉及到的组合多肽，主要来自以下几种蛋白：早期分泌的抗原靶(ESAT‑6)和培养滤液蛋白10(CFP10)，它们是结核病免疫诊断中两个公认的特异性抗原，这两个抗原具有较强的免疫活性。

[0024] 发明人发现，联合使用ESAT‑6和CFP10在早期结核的诊断上，可展现出较高的灵敏度，但是在持续感染中，其分泌量逐渐减少，从而导致其灵敏度有所降低，故根据研究可得出两种抗原的主要优势肽段，作为混合肽的组成成分。Rv2031c被证实主要在结核分枝杆菌体外缺氧时表达。而Rv1174c则被认为是参与了休眠的分枝杆菌再激活，及在卡介苗老化后仍旧会引起结核分枝杆菌的生长。Rv1985c被推测是一种染色体复制起始的抑制蛋白，它是种能够同时激活细胞免疫和体液免疫的结核特异性蛋白。本发明通过实验选定ESAT‑6、CFP10和其余3种蛋白，一共5种蛋白，作为优势肽段组成的混合多肽，在对结核分枝杆菌感染者的生物样本进行刺激后，测定其产生的特异性T细胞分泌的γ‑干扰素，检测其反应显示更灵敏、特异性更高。

[0025] 抗原的“抗原性部分”(可以是也可以不是可溶性的)是能够与从结核分枝杆菌感染个体获得的血清反应的部分(即，在本文描述的代表性磁微粒化学发光测定中，用感染个体的血清产生的吸收读数至少在用未感染个体血清获得的吸收的三个标准偏差以上)。“结核分枝杆菌感染个体”是已由结核分枝杆菌感染的人(例如，具有直径至少0.5cm的对PPD的真皮内皮试反应)。感染个体可以显示出结核病的症状，或可以是无疾病症状的。

[0026] 本发明的组合物与方法也包括上述多肽的变体。如本文所使用的″变体″是仅在保守取代和/或修饰上不同于天然抗原(以便所述多肽的抗原性特性得到保留)的多肽。通过采用本文描述的代表性方法修饰一种上述多肽序列并评价修饰的多肽的抗原性特性可以一般性地鉴别这样的变体。

[0027] “保守取代”是这样一种取代，其中一种氨基酸取代具有类似性质的另一种氨基酸，以便肽化学领域的技术人员可以期望多肽的二级结构与亲水性质实质上不变。一般来说，下组氨基酸代表保守取代：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。

[0028] 变体也可以(或选择性地)是由例如氨基酸缺失或者添加(对多肽抗原性特性，二级结构和亲水性质具有最小限度的影响)修饰的。例如，多肽可以连结到蛋白质N端的信号(或前导)序列上，后者共翻译或翻译后指导蛋白质的转移。所述多肽也可以连结到使多肽容易合成，纯化以及鉴定或增强多肽结合到固相支持物上的接头和其他序列(例如poly‑His)上。例如，多肽可以连结到免疫球蛋白Fc区上。

[0029] 在一些实施方式中，SEQ ID NO:1～15所示的多肽中的任意2种或多种融合形成融合肽。

[0030] 融合肽之间可以通过连接肽相连，在一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽；在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种。

[0031] 在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n，其中n选自1，2，3，4，5或6。

[0032] 本发明还涉及如上所述的抗原组合物的核酸。

[0033] 本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。

[0034] 术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

[0035] 本发明还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或如上所述的载体。

[0036] 根据本发明的再一方面，本发明还涉及含有如上所述的抗原组合物的结核分枝杆菌感染检测试剂盒。

[0037] 在一些实施方式中，所述试剂盒还含有配对的抗γ‑干扰素第一抗体和第二抗体、固相载体、反应缓冲液、洗涤液、阳性对照刺激物以及阴性对照中的一种或多种；

[0038] 所述第一抗体偶联有信号物质。

[0039] 在一些实施方式中，阳性对照刺激物为植物凝集素。

[0040] 在一些实施方式中，抗γ‑干扰素抗体可以是抗人或动物(例如，小鼠，大鼠，兔，绵羊以及山羊)的γ‑干扰素抗体。

[0041] 在一些实施方式中，所述第二抗体固定包被于所述固相载体上。

[0042] 在本发明的上下文中，术语“包被”指非共价缔合(如吸附)和共价连接(可以是抗原和在支持物上的官能团的直接键合，或者可以是利用交联剂连接)。包被在磁微粒上的实施方式是优选的。在这样的情况下，每毫克磁微粒包被的抗体量优选为1μg到10μg，更优选为5μg。

[0043] 在一些实施方式中，所述固相载体选自试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔或微球。

[0044] 在本发明中，术语“微粒”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、500μm；优选为400nm～10μm。

[0045] 微粒优选为磁微粒，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。

[0046] 多孔板优选为酶标板，其含有的孔位可以为8、16、32、48、64、96或更多。

[0047] 在一些实施方式中，所述信号物质选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。

[0048] 下面非限定部分列出这些标记：

[0049] ·产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β‑半乳糖苷酶和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶。

[0050] ·发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物(例如吖啶酯)和染料。

[0051] ·具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。

[0052] ·可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。

[0053] ·电子致密物质，如放射性分子(如32P，35S或125I)。

[0054] 根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的抗原组合物在制备用于体外检测结核感染引起的特异性T细胞免疫反应的检测试剂或试剂盒中的应用。

[0055] 在一些实施方式中，所述的检测试剂或试剂盒采用基于化学发光法、放射免疫法、酶联免疫反应法或胶体金技术检测γ‑干扰素。

[0056] 另一方面，本发明提供了用于利用以上所描述的抗原组合物来诊断结核病的方法。

[0057] 所述方法通过利用所述抗原组合物刺激生物样品中的免疫细胞(特别是T细胞)，使其释放γ‑干扰素，通过抗γ‑干扰素抗体捕获并检测其含量。

[0058] 在一些实施方式中，所述抗原组合物中，SEQ ID NO:1～15所示的多肽的工作浓度均为3μg/m～7μg/mL，优选5μg/mL。

[0059] 本文所使用的“生物样品”是任何从患者所获得的含有抗体的样品。优选地样品是全血(优选外周血，更优选是经过纯化的外周血单个核细胞)、浆膜腔积液、腹水和脑脊液。这样的抗体的存在表明对可以指示结核病的分枝杆菌抗原的早期致敏作用。

[0060] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

[0061] 实施例

[0062] 1.结核分枝杆菌特异型组合多肽，实施例1～实施例8所用多肽组合的组合方式依次如表1～8所示，其结果如表9、表10所示；

[0063] 2.本发明的组合肽可用于结核感染的检测，作为临床用于检测结核分支杆菌的检测。

[0064] 检测试剂盒包括：

[0065] (1)血液培养管：含结核分枝杆菌特异型组合多肽；植物凝集素(PHA)溶液阳性对照刺激物；阴性对照物；

[0066] (2)免疫磁微粒：抗人或鼠γ‑干扰素单克隆抗体按合适的包被比例(作为优选：5μg/mg)包被在磁微粒上。生物素封闭磁微粒上多余的空白位点，洗涤后用通用磁珠稀释液将其稀释至工作浓度；

[0067] (3)吖啶酯标记物：吖啶酯标记的抗人或鼠γ‑干扰素单克隆抗体；

[0068] (4)校准品：γ‑干扰素抗原。

[0069] 试验方式：

[0070] (1)采集：采用静脉穿刺术，使用肝素抗凝的真空采血管采集全血标本；

[0071] (2)分装：将采集的全血标本轻柔颠倒混匀3～5次后，分装到空白管、阳性对照管和组合多肽管中，每管平均1mL；

[0072] (3)培养：将培养管轻柔颠倒混匀后，迅速放入37℃孵育18±2小时，培养过程中保持培养管封闭直立；

[0073] (4)离心：培养后的培养管以3000～5000转/分钟离心10分钟，取上层血浆进行化学发光检测。

[0074] 本项目选取结合病例220例，健康志愿者220例，总共440例样本。

[0075] 样本应满足如下要求：

[0076] (1)病例样本临床表现需为确诊的肺结核患者且其结核分枝杆菌的菌落培养为阳性；

[0077] (2)每例样本的量应不少于4mL，每管应保证为相同的体积1mL；

[0078] (3)样本在刺激前应放置于室温条件下，进行刺激的最晚时间不得超过18小时。

[0079] 表1

[0080] 编号 序列 量SEQ ID NO:1 EQQWNFAGIEAAASA 5μg/mL
SEQ ID NO:2 IQGNVTSIHSLLDEG 5μg/mL
SEQ ID NO:3 ELNNALQNLARTISE 5μg/mL
SEQ ID NO:4 ARTISEAGQAMASTE 5μg/mL
SEQ ID NO:5 QGQWRGAAGTAAQAA 5μg/mL
SEQ ID NO:6 QAAVVRFQEAANKQK 5μg/mL
SEQ ID NO:7 ISTNIRQAGVQYSRA 5μg/mL
SEQ ID NO:8 AEMKTDAATL 5μg/mL
SEQ ID NO:9 NIRQAGVQY 5μg/mL
SEQ ID NO:10 TAAQAAVVRF 5μg/mL

[0081] 表2

[0082]编号 序列 量
SEQ ID NO:1 EQQWNFAGIEAAASA 5μg/mL
SEQ ID NO:2 IQGNVTSIHSLLDEG 5μg/mL
SEQ ID NO:3 ELNNALQNLARTISE 5μg/mL
SEQ ID NO:4 ARTISEAGQAMASTE 5μg/mL
SEQ ID NO:5 QGQWRGAAGTAAQAA 5μg/mL
SEQ ID NO:6 QAAVVRFQEAANKQK 5μg/mL
SEQ ID NO:7 ISTNIRQAGVQYSRA 5μg/mL
SEQ ID NO:8 AEMKTDAATL 5μg/mL
SEQ ID NO:9 NIRQAGVQY 5μg/mL
SEQ ID NO:10 TAAQAAVVRF 5μg/mL
SEQ ID NO:11 GRSEFAYGSFVRTVS 5μg/mL
SEQ ID NO:12 AYGSFVRTVSLPVGA 5μg/mL
SEQ ID NO:13 DEARRMWASAQNISG 5μg/mL

[0083] 表3

[0084]

[0085]

[0086] 表4

[0087] 编号 序列 量SEQ ID NO:1 EQQWNFAGIEAAASA 5μg/mL
SEQ ID NO:2 IQGNVTSIHSLLDEG 5μg/mL
SEQ ID NO:3 ELNNALQNLARTISE 5μg/mL
SEQ ID NO:4 ARTISEAGQAMASTE 5μg/mL
SEQ ID NO:5 QGQWRGAAGTAAQAA 5μg/mL
SEQ ID NO:6 QAAVVRFQEAANKQK 5μg/mL
SEQ ID NO:7 ISTNIRQAGVQYSRA 5μg/mL
SEQ ID NO:8 AEMKTDAATL 5μg/mL
SEQ ID NO:9 NIRQAGVQY 5μg/mL
SEQ ID NO:10 TAAQAAVVRF 5μg/mL
SEQ ID NO:11 GRSEFAYGSFVRTVS 5μg/mL
SEQ ID NO:12 AYGSFVRTVSLPVGA 5μg/mL
SEQ ID NO:13 DEARRMWASAQNISG 5μg/mL
SEQ ID NO:16 MATWFSAVFDGLGDV 5μg/mL
SEQ ID NO:17 LLDVRIEDQDHSARL 5μg/mL
SEQ ID NO:18 LREGVAMGAVTTERN 5μg/mL
SEQ ID NO:19 TTERNPVPGCRVHPL 5μg/mL
SEQ ID NO:20 RRAITRPTHFVPTTE 5μg/mL
SEQ ID NO:21 GFTAAARAGLGWGMF 5μg/mL
SEQ ID NO:22 GWGMFPEKLAASPLA 5μg/mL

[0088] 表5

[0089]

[0090]

[0091] 表6

[0092] 编号 序列 量SEQ ID NO:1 EQQWNFAGIEAAASA 5μg/mL
SEQ ID NO:2 IQGNVTSIHSLLDEG 5μg/mL
SEQ ID NO:3 ELNNALQNLARTISE 5μg/mL
SEQ ID NO:4 ARTISEAGQAMASTE 5μg/mL
SEQ ID NO:5 QGQWRGAAGTAAQAA 5μg/mL
SEQ ID NO:6 QAAVVRFQEAANKQK 5μg/mL
SEQ ID NO:7 ISTNIRQAGVQYSRA 5μg/mL
SEQ ID NO:8 AEMKTDAATL 5μg/mL
SEQ ID NO:9 NIRQAGVQY 5μg/mL
SEQ ID NO:10 TAAQAAVVRF 5μg/mL
SEQ ID NO:14 AVINTTCNYGQ 5μg/mL
SEQ ID NO:15 ASPVAQSYL 5μg/mL

[0093] 表7

[0094]

[0095]

[0096] 表8

[0097] 编号 序列 量SEQ ID NO:1 EQQWNFAGIEAAASA 5μg/mL
SEQ ID NO:2 IQGNVTSIHSLLDEG 5μg/mL
SEQ ID NO:3 ELNNALQNLARTISE 5μg/mL
SEQ ID NO:4 ARTISEAGQAMASTE 5μg/mL
SEQ ID NO:5 QGQWRGAAGTAAQAA 5μg/mL
SEQ ID NO:6 QAAVVRFQEAANKQK 5μg/mL
SEQ ID NO:7 ISTNIRQAGVQYSRA 5μg/mL
SEQ ID NO:8 AEMKTDAATL 5μg/mL
SEQ ID NO:9 NIRQAGVQY 5μg/mL
SEQ ID NO:10 TAAQAAVVRF 5μg/mL
SEQ ID NO:16 MATWFSAVFDGLGDV 5μg/mL
SEQ ID NO:17 LLDVRIEDQDHSARL 5μg/mL
SEQ ID NO:18 LREGVAMGAVTTERN 5μg/mL
SEQ ID NO:19 TTERNPVPGCRVHPL 5μg/mL
SEQ ID NO:20 RRAITRPTHFVPTTE 5μg/mL
SEQ ID NO:21 GFTAAARAGLGWGMF 5μg/mL
SEQ ID NO:22 GWGMFPEKLAASPLA 5μg/mL

[0098] 表9

[0099]

[0100] 根据上表结果可得，再具体实施例1的基础上增加组合多肽，可以一定程度上的增加试剂的灵敏度，但是变化不大；在一定范围内，具体实施例3中多肽1～15混合的结果最好，在灵敏度升高的同时，其特异性无明显变化。而再增加新的组合多肽，灵敏度没有明显上升，而特异性有所降低。结果表明，该抗原多肽库在结核病的患者中具有较高的反应性，且与健康志愿者结果比较，特异性也最高。因此，应用该组合多肽，进行γ‑干扰素检测对于结核病患者能产生有效的诊断结果。

[0101] 由实施例1～8的结果可得，ESAT‑6和CFP‑6中的10条多肽对于测定结果影响较大，故采取两种方式尝试多肽加样量的梯度

[0102] 实施例9：1～15条肽加入量为5μg/mL。

[0103] 实施例10：1～15条肽加入量为7μg/mL。

[0104] 实施例11：1～10条肽加入量为7μg/mL；11～15条肽加入量为5μg/mL。

[0105] 表10

[0106]

[0107] 根据上表结果可得，在实施例7的基础上调整多肽的加入量，结果表明，实施例9结果最好，将前1～15条的量均为5μg/mL时，灵敏度和特异性综合能达到最好的效果；因此，应用该优选的组合多肽的加入量，进行γ‑干扰素检测对于结核病患者能产生有效的诊断结果。

[0108] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0109] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。