本发明公开了一种关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，属于兽药残留检测领域，所述的新方法，包括如下步骤：(1)样品预制备；(2)样品前处理；(3)基质混合标准工作曲线溶液的制备；(4)测定；(5)定性、定量分析。本发明的新方法操作简单、快速、净化效果好，准确度高，重现性好，灵敏度高，工作效率大大提高。
1.一种关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）样品预制备；
所述样品前处理包括以下步骤：精密称取步骤（1）匀浆混匀的鸡蛋样品5g，置于50mL聚丙烯离心管中，精密加入20mL乙腈，涡旋混匀1min，振荡提取5min，加入1.5g乙酸钠和6g硫酸镁使盐析分层，涡旋1min，以5000r/min离心5min后，吸取上清液置于净化过滤柱中，收集过滤液直接装进样小瓶，供超高效液相—串联质谱仪测定；
所述净化过滤柱包括：注射器管、第一筛板、净化吸附剂层、微孔滤膜、第二筛板、过滤液出口，所述第一筛板位于注射器管内部空间的上部，所述净化吸附剂层设置于第一筛板和微孔滤膜之间，所述微孔滤膜设置于净化吸附剂层的下部，所述第二筛板设置于微孔滤膜的下部，所述过滤液出口设置于注射器管的底部；
所述净化吸附剂层组成原料包括：50mg粒径为42‑58μm的PSA粉末、50mg粒径为40‑56μm的PEP粉末、50mg粒径为41‑55μm的C18粉末、160mg的无水硫酸镁；
所述测定的方法，包括以下步骤：设定超高效液相—串联质谱仪测定条件，将基质混合标准工作曲线溶液注入三重四极杆超高效液相—串联质谱仪；色谱测定条件如下：ACQUITY UPLC® BEH C18 2.1×100mm，1.7μm；流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L乙酸铵‑0.1%甲酸溶液；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL；流动相梯度及时间如下：流动相梯度依次为：流动相A: 10%、90%、90%、10%，流动相B：90%、10%、10%、90%，流动相时间：1min、3min、
6min、10min；质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源（ESI）, 多反应监测（MRM）；负离子扫描模式：电喷雾电压（IS）‑4500 V；离子源温度（TEM）550 ℃；气帘气（CUR）流速35 L/min；雾化气（GS1）流速50L/min；辅助加热气（GS2）流速50 L/min；射入电压（EP）‑10 V；其中，离子对、去簇电压、碰撞能量、碰撞室射出电压条件具体如下：①氟虫腈：母离子434.9，定量离子329.8，去簇电压‑101V，碰撞能量‑21V，碰撞室射出电压‑15 V；母离子434.9，子离子249.8，去簇电压‑101V，碰撞能量‑34V，碰撞室射出电压‑
②氟甲腈：母离子386.9，定量离子350.8，去簇电压‑66V，碰撞能量‑22V，碰撞室射出电压‑11V；母离子386.9，子离子281.8，去簇电压‑66V，碰撞能量‑46V，碰撞室射出电压‑11V；
③氟虫腈砜：母离子450.9，定量离子281.8，去簇电压‑110V，碰撞能量‑40V，碰撞室射出电压‑15V；母离子450.9，子离子243.8，去簇电压‑110V，碰撞能量‑65V，碰撞室射出电压‑
④氟虫腈亚砜：母离子418.9，定量离子382.8，去簇电压‑78V，碰撞能量‑17V，碰撞室射出电压‑15V；母离子418.9，子离子261.8，去簇电压‑78V，碰撞能量‑36V，碰撞室射出电压‑
2.根据权利要求1所述的关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，其特征在于，步骤（1）中样品预制备包括以下步骤：鸡蛋样品取可食用部分，匀浆混匀、冷冻保存。
3.根据权利要求2所述的关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，其特征在于，所述样品冷冻保存的温度为‑20℃。
4.根据权利要求1所述的关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，其特征在于，所述离心管为50mL聚丙烯离心管。
5.根据权利要求1所述的关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，其特征在于，步骤（3）中基质混合标准工作曲线溶液的制备包括以下步骤：取鸡蛋空白基质按照步骤（1）、（2）制备，得到空白基质提取液；混合标准溶液用空白基质提取液稀释，制备一系列梯度浓度的基质混合标准工作曲线溶液。
6.根据权利要求5所述的关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，其特征在于，所述一系列梯度浓度的基质混合标准工作曲线溶液的浓度分别为：1ng/ml、2ng/ml、
7.根据权利要求1所述的关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，其特征在于，步骤（5）中所述定性、定量分析的方法，包括以下步骤：以保留时间和相应浓度的相对丰度比对氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜四种组分进行定性分析，用外标法进行定量结果计算。
一种关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法。【背景技术】
[0002] 目前，鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留测定采用的标准方法为GB23200.115‑2018食品安全国家标准鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定液相色谱‑质谱联用法，该方法原理是试样用乙腈提取后，提取液经分散固相萃取净化，采用液相色谱‑质谱联用仪检测，外标法定量。该方法的净化过程采用的分散固相萃取净化剂为50mgPSA粉末，50mgC18粉末和150mg无水硫酸镁，经过涡旋分散吸附干扰物质后，离心，取上清液过滤。该净化过程操作步骤多，工作效率低。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，以解决现有技术操作步骤多，工作效率低等问题。
[0004] 为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案。
[0005] 一种关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，包括如下步骤：
[0006] (1)样品预制备；
[0007] (2)样品前处理；
[0008] (3)基质混合标准工作曲线溶液的制备；
[0009] (4)测定；
[0010] (5)定性、定量分析。
[0011] 进一步地，步骤(1)中样品预制备包括以下步骤：鸡蛋样品取可食用部分，匀浆混匀、冷冻保存。
[0012] 进一步地，所述样品冷冻保存的温度为‑20℃。
[0013] 进一步地，步骤(2)中所述样品前处理包括以下步骤：精密称取步骤(1)匀浆混匀的鸡蛋样品5g，置于50mL聚丙烯离心管中，精密加入20mL乙腈，涡旋混匀1min，振荡提取5min，加入1.5g乙酸钠和6g硫酸镁使盐析分层，涡旋1min，以5000r/min离心5min后，吸取上清液置于所述的净化过滤柱中，收集过滤液直接装进样小瓶，供超高效液相—串联质谱仪测定。
[0014] 进一步地，所述离心管为50mL聚丙烯离心管。
[0015] 进一步地，步骤(3)中基质混合标准工作曲线溶液的制备包括以下步骤：取鸡蛋空白基质按照步骤(1)、(2)制备，得到空白基质提取液；混合标准溶液用空白基质提取液稀释，制备一系列梯度浓度的基质混合标准工作曲线溶液。
[0016] 进一步地，所述一系列梯度浓度的基质混合标准工作曲线溶液的浓度分别为：1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。
[0017] 进一步地，步骤(4)中所述测定的方法，包括以下步骤：设定超高效液相—串联质谱仪测定条件，将基质混合标准工作曲线溶液注入三重四极杆超高效液相—串联质谱仪；色谱测定条件如下：ACQUITY BEH C18 2.1×100mm，1.7μm；流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L乙酸铵‑0.1％甲酸溶液；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL；流动相梯度及时间如下：流动相梯度依次为：流动相A:10％、90％、90％、10％，流动相B：90％、10％、
10％、90％，流动相时间：1min、3min、6min、10min；质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源(ESI),多反应监测(MRM)；负离子扫描模式：电喷雾电压(IS)‑4500V；离子源温度(TEM)550℃；气帘气(CUR)流速35L/min；雾化气(GS1)流速50L/min；辅助加热气(GS2)流速50L/min；
射入电压(EP)‑10V；其中，离子对、去簇电压、碰撞能量、碰撞室射出电压条件具体如下：
[0018] ①氟虫腈：母离子434.9，定量离子329.8，去簇电压‑101V，碰撞能量‑21V，碰撞室射出电压‑15V；母离子434.9，子离子249.8，去簇电压‑101V，碰撞能量‑34V，碰撞室射出电压‑15V；
[0019] ②氟甲腈：母离子386.9，定量离子350.8，去簇电压‑66V，碰撞能量‑22V，碰撞室射出电压‑11V；母离子386.9，子离子281.8，去簇电压‑66V，碰撞能量‑46V，碰撞室射出电压‑11V；
[0020] ③氟虫腈砜：母离子450.9，定量离子281.8，去簇电压‑110V，碰撞能量‑40V，碰撞室射出电压‑15V；母离子450.9，子离子243.8，去簇电压‑110V，碰撞能量‑65V，碰撞室射出电压‑11V；
[0021] ④氟虫腈亚砜：母离子418.9，定量离子382.8，去簇电压‑78V，碰撞能量‑17V，碰撞室射出电压‑15V；母离子418.9，子离子261.8，去簇电压‑78V，碰撞能量‑36V，碰撞室射出电压‑10V。
[0022] 进一步地，步骤(5)中所述定性、定量分析的方法，包括以下步骤：以保留时间和相应浓度的相对丰度比对氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜四种组分进行定性分析，用外标法进行定量结果计算。
[0023] 与标准方法比较，本发明的有益效果是：
[0024] 采用本发明的新方法检测鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的残留量，操作比GB 23200.115‑2018《食品安全国家标准鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定液相色谱‑质谱联用法》简单、快速、灵敏、净化效果更好，同时净化过程省去了国标中涡旋和离心的步骤，采用一步式净化过滤，大大提高了工作效率。
【附图说明】
[0025] 图1是实施例1中的氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜4种目标物的离子质谱图。【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施方式并对照附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
[0027] 实施例1
[0028] 一种关于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量测定的新方法，按如下步骤分别测定10批鸡蛋样品中的氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜残留量：
[0029] (1)样品预制备：10批次鸡蛋样品分别取可食用部分，匀浆混匀、‑20℃冷冻保存；
[0030] (2)样品前处理：精密称取步骤(1)匀浆混匀的鸡蛋样品5g(精确至0.01g)，置于50mL聚丙烯离心管中，精密加入20mL乙腈，涡旋混匀1min，振荡提取5min，加入2g氯化钠和
6g无水硫酸钠，涡旋1min，以5000r/min离心5min；取上清液置于净化过滤柱中，所述净化过滤柱包括：注射器管、第一筛板、净化吸附剂层、微孔滤膜、第二筛板、过滤液出口，所述第一筛板位于注射器管内部空间的上部，所述净化吸附剂层设置于第一筛板和微孔滤膜之间，所述微孔滤膜设置于净化吸附剂层的下部，所述第二筛板设置于微孔滤膜的下部，所述过滤液出口设置于注射器管的底部。
[0031] 所述注射器管为内径12.9mm，管长67.6mm，体积6ml的聚丙烯管，作为净化过滤柱的外壳。第一筛板和第二筛板为直径13.0mm，厚度1.2mm的20μm孔径的聚丙烯筛板，主要起固定净化吸附剂层和微孔滤膜，以及控制过柱流速的作用。所述净化吸附剂层组成原料包括：50mg粒径为42‑58μm的PSA粉末、50mg粒径为40‑56μm的PEP粉末、50mg粒径为41‑55μm的C18粉末、160mg的无水硫酸镁，各原料混合均匀组成，可选择性的吸附提取液中的杂质而不吸附待测组分，待测组分则留在净化过滤液中，达到分离杂质的目的。微孔滤膜为0.2μm孔径的聚四氟乙烯(PTFE)微孔滤膜，可过滤净化液，防止溶液颗粒堵塞仪器。
[0032] 收集过滤液直接装进样小瓶，供超高效液相—串联质谱仪测定；
[0033] (3)基质混合标准工作曲线溶液的制备：取鸡蛋空白基质按照步骤(1)、(2)制备，得到空白基质提取液。混合标准溶液用空白基质提取液稀释，制备系列梯度浓度为1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的基质混合标准工作曲线溶液；
[0034] (4)测定：将基质混合标准工作曲线溶液和试样溶液注入三重四级杆超高效液相—串联质谱仪中进行测定，氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜4种目标物的离子质谱图详见图1，色谱测定条件如下： BEH C18 2.1×100mm，1.7μm；流动相A为甲醇，流动相B为5mmol/L乙酸铵‑0.1％甲酸溶液；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样量：
2μL；流动相梯度及时间如下：流动相梯度依次为：流动相A:10％、90％、90％、10％，流动相B：90％、10％、10％、90％，流动相时间：1min、3min、6min、10min；质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源(ESI),多反应监测(MRM)；负离子扫描模式：电喷雾电压(IS)‑4500V；离子源温度(TEM)550℃；气帘气(CUR)流速35L/min；雾化气(GS1)流速50L/min；辅助加热气(GS2)流速50L/min；射入电压(EP)‑10V；其中，离子对、去簇电压、碰撞能量、碰撞室射出电压条件具体如下：
[0035] ①氟虫腈：母离子434.9，定量离子329.8，去簇电压‑101V，碰撞能量‑21V，碰撞室射出电压‑15V；母离子434.9，子离子249.8，去簇电压‑101V，碰撞能量‑34V，碰撞室射出电压‑15V；
[0036] ②氟甲腈：母离子386.9，定量离子350.8，去簇电压‑66V，碰撞能量‑22V，碰撞室射出电压‑11V；母离子386.9，子离子281.8，去簇电压‑66V，碰撞能量‑46V，碰撞室射出电压‑11V；
[0037] ③氟虫腈砜：母离子450.9，定量离子281.8，去簇电压‑110V，碰撞能量‑40V，碰撞室射出电压‑15V；母离子450.9，子离子243.8，去簇电压‑110V，碰撞能量‑65V，碰撞室射出电压‑11V；
[0038] ④氟虫腈亚砜：母离子418.9，定量离子382.8，去簇电压‑78V，碰撞能量‑17V，碰撞室射出电压‑15V；母离子418.9，子离子261.8，去簇电压‑78V，碰撞能量‑36V，碰撞室射出电压‑10V；
[0039] (5)定性：在相同实验条件下进行样品测定时，如检出的色谱峰保留时间与标准品的保留时间一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，目标物的质谱定量离子和定性离子均出现，而且同一批次检验，对同一化合物，样品中目标物的定性离子和定量离子的相对丰度比与质量浓度相当的基质标准溶液相比，其允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在目标物；
[0040] (6)定量：以外标曲线法进行定量，为减少基质效应的影响，采用基质匹配的工作溶液做标准曲线，测定定量离子峰面积，试样溶液中目标物的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围内，检测结果在3批鸡蛋样品中检出氟虫腈，结果见表1，计算公式如下：
[0041]
[0042] 公式中：ω‑样品中目标物的残留量，单位为毫克每公斤(mg/kg)；ρ‑基质标准工作溶液中目标物的质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；A‑试样溶液中目标物的色谱峰面积；As‑基质标准工作溶液中目标物的色谱峰面积；V‑试样溶液最终定容体积，单位为毫升(ml)；m‑试样溶液所代表的的试样质量，单位为克(g)；1000为换算因子。
[0043] 表1鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物残留量检测结果
[0044]
[0045] 检出限和定量限的测定：采用鸡蛋空白基质中添加标准溶液的方法，以3倍的信噪比测定目标物的检出限，以10倍的信噪比测定目标物的定量限，结果见表2，远远低于GB 23200.115‑2018《食品安全国家标准鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定液相色谱‑质谱联用法》的定量限0.005mg/kg，表明本方法灵敏度较高。
[0046] 表2鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物残留量检测方法检出限和定量限
[0047]
[0048]
[0049] 重复性和回收率的测定：取鸡蛋空白基质，采用添加标准溶液的方法，三水平各三份，测定重复性和回收率，结果见表3，回收率均在85％～105％范围内，说明本方法的稳定性良好。
[0050] 表3鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物残留量检测方法重复性(RSD)和回收率[0051]
[0052] 4种目标物的线性范围、线性方程及相关系数见表4，本方法的4种目标物在1～20ng/ml的浓度范围内，线性关系良好，可用于鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的定量测定。
[0053] 表4鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物残留量检测方法的线性范围、线性方程及相关系数
[0054]
[0055]
[0056] 方法准确性的比较：按0.01mg/kg的水平添加标准溶液至阴性鸡蛋样品中，得到阳性样品，分别采用GB 23200.115‑2018《食品安全国家标准鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定液相色谱‑质谱联用法》和本方法进行检测，测定结果见表5，两个方法测定结果的重现性＜5.0，表明本方法准确性良好。
[0057] 表5两个方法测定结果及重现性
[0058]
[0059] 结论：本发明通过采用乙腈进行提取，净化过滤柱进行净化过滤，超高效液相色谱‑串联质谱法测定鸡蛋中氟虫腈及其代谢物，可以更有效的去除杂质干扰、操作简单、快速、灵敏度高、回收率稳定、准确性好。
[0060] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
