一种尼卡巴嗪检测试剂盒及其用途

摘要

本发明提供了一种尼卡巴嗪检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记物、尼卡巴嗪标识物标准品、20×浓缩洗涤液、20×浓缩复溶液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有尼巴卡嗪半抗原‑载体蛋白，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的尼卡巴嗪特异性抗体。本发明还提供了尼卡巴嗪检测试剂盒在检测鸡肉样本中的应用。本发明尼卡巴嗪检测试剂盒采用一步法检尼卡巴嗪标识物，检测灵敏度高，检测结果的准确度和精密度均较好，且本发明检测试剂盒本身结构简单、使用方便、便携性好、对检测人员要求不高，适于现场大批量样本的快速检测。

权利要求

1.一种尼卡巴嗪检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记物、尼卡巴嗪标识物标准品、20×浓缩洗涤液、20×浓缩复溶液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有尼卡巴嗪半抗原‑载体蛋白，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的尼卡巴嗪特异性抗体，所述尼卡巴嗪半抗原结构式为

2.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪半抗原由以下步骤得到，

1)产物Ⅰ的合成

称取4‑硝基苯胺5.52g、4‑溴丁酸叔丁酯10g、碳酸钾6g置于80mL DMF中，在65℃的油浴中搅拌4h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.7，向反应液加去离子水80mL，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用去离子水洗1次，饱和食盐水洗1次，再用无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，得油状物过柱纯化，DCM:MeOH＝100:1，得无色液体产物Ⅰ8.4g；

2)产物Ⅱ的合成

称取产物Ⅰ5.04g置于40mL甲醇中，加入10％的Pd/C 0.2g，并在H2的氛围中反应8h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1，过滤除去Pd/C，然后减压除去甲醇，得产物Ⅱ4.0g；

3)产物Ⅲ的合成

将产物Ⅱ2.2g用30mL甲苯溶解，在冰水冷却下，滴加4‑硝基苯基异氰酸酯1.64g，搅拌

2h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1，有大量白色固体析出，减压抽滤，得固体产物Ⅲ

3.1g；

4)产物Ⅳ的合成，即尼卡巴嗪半抗原

称取产物Ⅲ1.92g置于10mL甲醇中，加入2mol/LNaOH溶液10mL，室温搅拌5h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.2，减压除去甲醇，所得溶液用1mol/L的HCl调pH至2‑3，向反应液加去离子水20mL，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用去离子水洗2次，饱和食盐水洗1次，无水Na2SO4干燥,减压除去溶剂，得油状物过柱纯化，DCM:MeOH＝100:1，得白色固体产物(Ⅳ)1.2g，即为尼卡巴嗪半抗原。

3.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪标识物标准品浓度分别为0μg/L，0.025μg/L，0.075μg/L，0.225μg/L，0.675μg/L，2.025μg/L。

4.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB，所述终止液为2mol/L H2SO4。

5.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液含1％聚乙二醇400单油酸酯，0.1mol/L MES缓冲液，pH 6.0。

6.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩复溶液含50％DMF，

0.01mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.0。

7.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪特异性抗体由尼卡巴嗪半抗原‑KLH偶联物作为免疫原制备得到。

8.如权利要求7所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪半抗原‑KLH偶联物由以下步骤制备得到：

1)称取12mg尼卡巴嗪半抗原溶解于1mLDMF中；

2)称取15mgEDC和10mgNHS溶解于0.2mL去离子水中；

3)将步骤2)溶液加入步骤1)溶液中，室温搅拌反应30min；

4)称取KLH 50mg溶解于3.8mL PBS中，向其中加入步骤3)得到的溶液，室温搅拌反应

16h；

5)用0.01mol/L PBS透析，截留分子质量8000～14000u，4℃透析3天，每天换透析液，得到尼卡巴嗪半抗原‑KLH偶联物。

9.一种将权利要求1‑8任一项所述的尼卡巴嗪检测试剂盒用于检测鸡肉中尼卡巴嗪残留的用途。

说明书

一种尼卡巴嗪检测试剂盒及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种尼卡巴嗪酶联免疫快速检测试剂盒及其用途。

背景技术

[0002] 尼卡巴嗪又名球虫净、双硝基脲二嘧啶醇，是由二硝基均二苯脲(DNC)和羟基二甲基嘧啶(HDP)组成的1:1复合物，是一种广谱、高效、性能稳定的饲料添加剂。尼卡巴嗪用于预防鸡和火鸡球虫病。尼卡巴嗪虽是由DNC和HDP两种成分组成的复合物，但由于复合物中的HDP成分在动物体内可迅速经尿排出体外,而抗球虫活性成分DNC通过粪便排泄较缓慢，因此国际上将二硝基均二苯脲(DNC)规定为尼卡巴嗪残留标识物。

[0003] 目前尼卡巴嗪应用非常广泛,然而饲喂后在家禽的肌肉及其他组织中会造成不同程度的残留,危害人类生命健康。我国规定尼卡巴嗪在鸡组织中的残留标识物为DNC，在鸡肌肉、皮、脂肪、肝脏、肾脏中的残留限量为200μg/kg。

[0004] 目前，尼卡巴嗪残留标识物的检测方法主要有仪器分析法和免疫学分析法。仪器分析法，前处理程序繁琐，测定时间长，仪器成本高，对检测人员要求高，不能满足尼卡巴嗪的实时快速检测。免疫分析法，主要是以酶为反应介质的快速筛选方法，以抗原抗体为核心检测试剂。免疫分析法具有检测简便、快速，适应于大量样本的检测。申请公布号为CN106771137的发明专利公开的检测尼卡巴嗪的酶联免疫试剂盒及应用，公开了一种酶联免疫试剂盒，其具有包被尼卡巴嗪偶联抗原的酶标板、尼卡巴嗪单克隆抗体、酶标记物抗抗体、尼卡巴嗪标准品溶液、底物显色液、终止液，现有技术酶联免疫试剂盒检测步骤仍然比较繁琐，检测反应所需时间较长，且检测灵敏度仍不高。

发明内容

[0005] 为克服现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种检测灵敏度高，现场检测反应时间短，检测简便的尼卡巴嗪检测试剂盒，本发明检测试剂盒精密度和准确度均较高。

[0006] 本发明技术方案：

[0007] 本发明尼卡巴嗪检测试剂盒包括96孔酶标板、酶标记物、尼卡巴嗪标识物标准品、20×浓缩洗涤液、20×浓缩复溶液、底物A液、底物B液、终止液，其中96孔酶标板上包被有尼卡巴嗪半抗原‑载体蛋白偶联物，酶标记物为辣根过氧化物酶标记的尼卡巴嗪特异性抗体。

[0008] 其中，尼卡巴嗪标识物标准品为0μg/L，0.025μg/L，0.075μg/L，0.225μg/L，0.675μg/L。

[0009] 其中，20×浓缩洗涤液的成分是含1％聚乙二醇400单油酸酯，0.1mol/L MES缓冲液，pH6.0。

[0010] 其中，20×浓缩复溶液的成分是含50％DMF，0.01mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.0。

[0011] 其中，底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB。

[0012] 其中，终止液为2mol/L H2SO4。

[0013] 进一步地，尼卡巴嗪半抗原结构式为

[0014]

[0015] 由以下步骤制备得到，制备路线图图1所示。

[0016] 1)产物Ⅰ的合成

[0017] 称取4‑硝基苯胺5.52g、4‑溴丁酸叔丁酯10g、碳酸钾6g置于80mL DMF中，在65℃的油浴中搅拌4h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.7，向反应液加去离子水80mL，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用去离子水洗1次，饱和食盐水洗1次，再用无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，得油状物过柱纯化，DCM:MeOH＝100:1，得无色液体产物Ⅰ8.4g。

[0018] 2)产物Ⅱ的合成

[0019] 称取产物Ⅰ5.04g置于40mL甲醇中，加入10％的Pd/C 0.2g，并在H2的氛围中反应8h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1，过滤除去Pd/C，然后减压除去甲醇，得产物Ⅱ
4.0g。

[0020] 3)产物Ⅲ的合成

[0021] 将产物Ⅱ2.2g用30mL甲苯溶解，在冰水冷却下，滴加4‑硝基苯基异氰酸酯1.64g，搅拌2h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1，有大量白色固体析出，减压抽滤，得固体产物Ⅲ3.1g。

[0022] 4)产物Ⅳ的合成，即尼卡巴嗪半抗原

[0023] 称取产物Ⅲ1.92g置于10mL甲醇中，加入2mol/LNaOH溶液10mL，室温搅拌5h,点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.2，减压除去甲醇，所得溶液用1mol/L的HCl调pH至2‑3,向反应液加去离子水20mL，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用去离子水洗2次，饱和食盐水洗1次，无水Na2SO4干燥,减压除去溶剂，得油状物过柱纯化，DCM:MeOH＝100:1，得白色固体产物(Ⅳ)1.2g，即为尼卡巴嗪半抗原。

[0024] 所述尼卡巴嗪抗体由尼卡巴嗪半抗原‑KLH偶联物作为免疫原制备得到。免疫原制备步骤如下：

[0025] 1)称取12mg尼卡巴嗪半抗原溶解于1mL DMF中；

[0026] 2)称取15mgEDC和10mgNHS溶解于0.2mL去离子水中；

[0027] 3)将步骤2)溶液加入步骤1)溶液中，室温搅拌反应30min；

[0028] 4)称取KLH 50mg溶解于3.8mL PBS中，向其中加入步骤3)得到的溶液，室温搅拌反应16h；

[0029] 5)用0.01mol/L PBS透析，截留分子质量8000～14000u，4℃透析3天，每天换透析液，得到免疫原。

[0030] 本发明的另一个目的，还提供了一种将尼卡巴嗪检测试剂盒用于检测鸡肉中尼卡巴嗪残留的用途，其检测具体包括以下步骤：鸡肉样本的处理；用本发明尼卡巴嗪检测试剂盒检测；分析检测结果。

[0031] 本发明有益效果：

[0032] 本发明尼卡巴嗪检测试剂盒将抗原包被于酶标微孔板，用酶标记抗体与样本反应竞争包被物，通过底物显色，进行分析测定尼卡巴嗪标识物残留量，建立了直接竞争ELISA方法。本发明尼卡巴嗪检测试剂盒对尼卡巴嗪标识物的检测灵敏度高达0.025μg/L，板内变异系数在2.6‑4.6％之间，板间变异系数在4.1‑6.4％之间，回收率在90‑110.5％之间。本发明尼卡巴嗪检测试剂盒结构简单，检测灵敏度高，准确度、精密度检测数据均较好，且检测成本低，对检测人员要求不高，检测产品便携性好，适用于大批量样本的现场快速检测，是理想的尼卡巴嗪残留的检测产品。

附图说明

[0033] 图1尼卡巴嗪半抗原合成路线图

[0034] 图2试剂盒标准曲线图

具体实施方式

[0035] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂，均可由市场购买得到。

[0036] 实施例一

[0037] 1、尼卡巴嗪检测试剂盒包含组分：

[0038] (1)96孔酶标板，酶标板上包被有尼卡巴嗪半抗原‑OVA偶联物；

[0039] (2)酶标记抗体工作液，具体为辣根过氧化物酶标记尼卡巴嗪单克隆抗体，7mL/瓶。酶标记抗体工作液中加入了8％甘油、0.1％EDTA、5％海藻糖，0.01％Proclin300作为抗体稳定剂，百分数为质量百分数。

[0040] (3)尼卡巴嗪标识物标准品0μg/L，0.025μg/L，0.075μg/L，0.225μg/L，0.675μg/L，2.025μg/L，1mL/瓶。

[0041] (4)20×浓缩洗涤液，成分含1％聚乙二醇400单油酸酯，0.1mol/L MES缓冲液，pH 6.0，30mL/瓶，使用时用去离子水按1:19的比例进行稀释。

[0042] (5)20×浓缩复溶液，成分为含50％DMF，0.01mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.0，10mL/瓶，使用时用甲醇按1:19的比例进行稀释。

[0043] (6)底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB，均为7mL/瓶。

[0044] (7)终止液为2mol/L H2SO4，7mL/瓶。

[0045] 所述百分比为质量体积比。

[0046] 2、主要组分制备：

[0047] 2.1、尼卡巴嗪半抗原的合成

[0048] 1)称取4‑硝基苯胺(5.52g，44mmoL)、4‑溴丁酸叔丁酯(10g，44mmoL)和碳酸钾(6g，48mmoL)于80mLDMF中，在65℃的油浴中搅拌4h，点板反应完成(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.7)，向反应液加水80mL，并用二氯甲烷萃取(800mLX3)，合并有机相，有机相用水洗1次，饱和食盐水洗1次，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，减压除去溶剂，得油状物过柱纯化(DCM:MeOH＝
100:1)，得无色液体产物。

[0049] 2)称取步骤1)产物5.04g于40mL甲醇中，加入10％的Pd/C 0.2g，并在H2的氛围中反应8h，点板反应(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1)，过滤除去Pd/C，然后减压除去甲醇，得产物。

[0050] 3)将步骤2)产物2.2g用30mL甲苯溶解，在冰水冷却下，滴加4‑硝基苯基异氰酸酯1.64g，搅拌2h，点板反应(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1)，有大量白色固体析出，减压抽滤，得固体产物。

[0051] 4)称取步骤3)产物1.92g于10mL甲醇中，加入2mol/LNaOH溶液10mL，室温搅拌5h，点板反应(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.2)，减压除去甲醇，所得溶液用1mol/L的HCl调pH至2‑3，向反应液加去离子水20mL，并用二氯甲烷萃取(50mLX3)，合并有机相，有机相用去离子水洗2次，饱和食盐水洗1次，再用无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，所得油状物过柱纯化(DCM:
MeOH＝100:1)，得白色固体，即尼卡巴嗪半抗原。

[0052] 2.2、免疫原与包被原合成

[0053] 免疫原为尼卡巴嗪半抗原‑KLH，包被原为尼卡巴嗪半抗原‑OVA，制备过程如下：

[0054] 称取尼卡巴嗪半抗原12mg溶解于1mL DMF中，得半抗原稀释液；称取15mgEDC和10mgNHS溶解于0.2mL去离子水中，然后将其加入半抗原稀释液中，室温环境下搅拌30min，得活化半抗原稀释液；称取载体蛋白KLH或OVA50mg，使其充分溶解在3.8mLPBS中；将活化半抗原稀释液逐滴缓慢滴加到配置的载体蛋白溶液中，室温搅拌反应10h，用0.01mol/L的PBS透析，截留分子质量8000～14000u，4℃透析3天，每天换透析液3次，制备完成后分装保存于‑20℃。

[0055] 2.3、尼卡巴嗪单克隆抗体制备

[0056] 2.3.1动物免疫

[0057] 挑选8周龄的Balb/c小鼠，用含有佛氏完全佐剂的尼卡巴嗪半抗原‑KLH偶联物进行皮下注射，免疫剂量为150μg/只，第2，4和8周加强免疫，最后一次免疫在第12周，使其产生多克隆抗体血清。

[0058] 2.3.2骨髓瘤细胞和脾细胞的制备

[0059] SP2/0骨髓瘤细胞采用RPMI‑1640培养液培养，使细胞处于对数生长期，制成SP2/0骨髓瘤细胞细胞悬液；取经免疫的小鼠脾脏，破碎，过200目的不锈钢纱布过滤制成脾细胞悬液，计数后备用。

[0060] 2.3.3细胞融合和单克隆化

[0061] 将1×108SP2/0骨髓瘤细胞和4×108脾细胞在PEG4000作用下进行融合，对于分泌抗体培养孔，采用间接竞争ELISA测定以筛选阳性孔。采用有限稀释法对阳性孔进行单克隆化，直到得到稳定分泌尼卡巴嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0062] 2.3.4细胞冻存和复苏

[0063] 将尼卡巴嗪单克隆杂交瘤细胞株成3×106个/mL的细胞悬液，每个冻存管500μL，液氮中保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，转入锥形瓶中，加入15mL完全培养液中，使用CO2培养箱进行培养。

[0064] 2.3.5单克隆抗体的大量生产与纯化

[0065] 取健康的Balb/c雌鼠，腹腔注石蜡油0.5mL/只，10天后腹腔注射尼卡巴嗪单克隆6
杂交瘤细胞株10 个/只，隔天观察，7‑10天后采集腹水。将腹水4000rpm离心10min，收集上清。纯化后抗体‑20℃保存。

[0066] 2.3.6尼卡巴嗪单克隆抗体的特异性

[0067] 抗体特异性指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力，用交叉反应率表示。交叉反应率小，可证明抗体的特异性高。通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度(即IC50)。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率：

[0068] 交叉反应率(％)＝(尼卡巴嗪标识物IC50/尼卡巴嗪标识物类似物IC50)×100％[0069] 测得本发明尼卡巴嗪检测试剂盒对尼卡巴嗪标识物的交叉反应率为100％，对鸡肉中常测药，如新霉素、庆大霉素、硝基咪唑类、地克珠利、盐霉素、磺胺类药物等均无交叉反应，能特异性检测鸡肉组织中残留的尼卡巴嗪标识物。

[0070] 2.4、酶标记抗体的制备

[0071] 酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的尼卡巴嗪单克隆抗体。将辣根过氧化物酶与尼卡巴嗪单克隆抗体采用过碘酸钠法进行反应得到。

[0072] 2.5、酶标板

[0073] 用0.05mol/L，pH7.2磷酸盐包被液将尼卡巴嗪半抗原‑OVA稀释成0.10‑0.15μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，用洗涤液洗涤2次，拍干，然后再每孔中加入含有1％明胶的0.05mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液300μL进行封闭，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。封闭液为含1％蛋白胨、0.1％EDTA、0.1％PEG4000、5％海藻糖，0.02mol/L的PBS液，pH7.4，百分数为质量分数。封闭液不仅起到降低试剂孔背景干扰的作用，还能保证大分子蛋白活性、防降解，提高酶标板的稳定性。

[0074] 经包被处理后的酶标板，与本发明其它试剂放在37℃恒温箱中进行老化试验，进行到第28天，测定吸光度值，仍在正常值范围内。

[0075] 组装后的试剂盒，还可以包括说明书、盖板膜、自封袋、合格证，试剂盒在2～8℃条件下，试剂盒保存期在3年以上。

[0076] 3、尼卡巴嗪检测试剂盒检测原理：

[0077] 利用尼卡巴嗪抗体与尼卡巴嗪标识物可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被抗原，再加入标准品或样本和尼卡巴嗪抗体，尼卡巴嗪标识物与固定在酶标板上的抗原竞争尼卡巴嗪抗体，最后再加入底物催化显色，此时显色深度与标准品或样本中尼卡巴嗪的含量成反比。

[0078] 4、试剂盒具体检测步骤

[0079] (1)取出需要数量的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品的位置，为减小检测值波动，做双孔平行实验。

[0080] (2)加入标准品/样品50μL到对应的微孔中，然后加入酶标记抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡5s混匀，盖板后置25℃避光环境中反应15min。

[0081] (3)揭开盖板膜，甩干孔内液体，加入洗涤液250μL/孔，洗涤2次，倒掉洗涤液，用吸水纸拍干。

[0082] (4)加入底物显色A液过氧化氢50μL/孔，再加入底物显色B液四甲基联苯胺50μL/孔，混匀，盖板后置于25℃避光环境中反应10min。

[0083] (5)加入终止液50μL/孔，混匀，设定酶标仪于450nm处，测定OD值。

[0084] 5、检测结果分析

[0085] 设各标准品(或样品)的吸光度平均值为B，零标准,即浓度为0μg/L的标准品，吸光度平均值B0以(B/B0)×100％为各标准品(或样品)对应的吸光度的百分比：使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线。将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，最后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中检测物含量。

[0086] 实施例2鸡肉样本中尼卡巴嗪标识物的检测

[0087] 1、鸡肉样本前处理方法

[0088] 称取1±0.05g样本于10mL离心管中，加入3mL无水乙醇，涡动5min；5000rpm室温离心5min；取25μL上层清亮液体，加入975μL复溶工作液，振荡混合30s；取50μL用于分析。

[0089] 2、标准曲线拟合

[0090] 标准曲线由6个浓度组成(0μg/L，0.025μg/L，0.075μg/L，0.225μg/L，0.675μg/L，2.025μg/L)，对6个标准点各测定次数2次，以确定工作浓度范围。以尼卡巴嗪标识物标准品浓度对数值为横坐标，各对应浓度的抑制率(B/B0％)为纵坐标，制作标准曲线。结果见图2。

[0091] 3、样品精密度和准确度试验

[0092] 准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。用尼卡巴嗪标识物对鸡肉样品进行添加回收，使终浓度为20μg/kg。每个浓度五个平行，抽取三批试剂盒，每批试剂盒测定同一份样品3次，分别计算测定样品回收率和变异系数。结果见下表。

[0093]

[0094] 结果显示，添加20μg/kg尼卡巴嗪标识物，鸡肉样本的添加回收率在90‑110.5％之间，板内变异系数在2.6‑4.6％之间，板间变异系数在4.1‑6.4％之间。

[0095] 实施例三

[0096] (1)96孔酶标板，酶标板上包被有尼卡巴嗪半抗原‑HSA偶联物；

[0097] (2)酶标记抗体工作液，具体为辣根过氧化物酶标记尼卡巴嗪多克隆抗体，7mL/瓶。

[0098] (3)尼卡巴嗪标识物标准品0μg/L，0.025μg/L，0.075μg/L，0.225μg/L，0.675μg/L，2.025μg/L，1mL/瓶。

[0099] (4)20×浓缩洗涤液，成分为含1％聚乙二醇400单油酸酯，0.1mol/L MES缓冲液，pH6.0，30mL/瓶。

[0100] (5)20×浓缩复溶液，成分为含50％DMF，0.01mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.0，10mL/瓶。

[0101] (6)底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB，均为7mL/瓶。

[0102] (7)终止液为2mol/L H2SO4，7mL/瓶。

[0103] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。