一种家蝇衍生抗菌肽D-26M及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M及制备方法和应用，对家蝇抗真菌肽MAF‑1A进行氨基酸残基替换和右旋改造获得D‑26M，其序列如序列表SEQ IQ No.2所示；使用多肽合成仪进行固相合成多肽，使用反向高效液相色谱进行纯化，最后进行氨基酸分析及质谱鉴定。本发明在保证高抗菌活性的情况下，提高了D‑26M的稳定性和细胞选择性；D‑26M具有更强的阳离子性、疏水性以及渗透到病原菌双层膜的能力，具有广谱的抗菌活性及高效抗炎活性，尤其是对多重耐药性鲍曼不动杆菌，对在体内外环境中的游离态鲍曼不动杆菌及其形成的生物被膜均有很好的抗性，且能有效抑制革兰阴性菌外膜LPS的活性。

权利要求

1.一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M的制备方法，其特征在于，具体方法步骤如下：

（1）采用氨基酸残基替换法对多肽MAF‑1A进行氨基酸序列突变并右旋改造，多肽MAF‑

1A的序列如序列表SEQ ID No.1所示；具体过程为：用右旋Lys替换多肽MAF‑1A氨基酸序列中的Glu和Asp；用右旋Leu替换多肽MAF‑1A氨基酸序列中的Gln和第23位的Lys；用含有吲哚侧链的右旋Trp替代多肽MAF‑1A氨基酸序列中的第9和第15位的Lys；对多肽MAF‑1A中的余下氨基酸均采用相应的右旋氨基酸进行替换；获得长度为26的衍生抗菌肽 D‑26M，其序列如序列表SEQ ID No.2所示；

（2）采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成衍生抗菌肽；

（3）将合成的衍生抗菌肽使用反向高效液相色谱进行纯化，纯化后对多肽进行氨基酸分析及质谱鉴定，完成衍生抗菌肽的制备。

2.根据权利要求1所述的一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M的制备方法所制备得到的家蝇衍生抗菌肽D‑26M在制备治疗和/或预防病原菌感染的抑菌剂中的应用，所述家蝇衍生抗菌肽D‑26M的序列如序列表SEQ ID No.2所示，其特征在于：所述病原菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M的制备方法所制备得到的家蝇衍生抗菌肽D‑26M在制备治疗和/或预防病原菌感染的抑菌剂中的应用，所述家蝇衍生抗菌肽D‑26M的序列如序列表SEQ ID No.2所示，其特征在于：所述病原菌为鲍曼不动杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M的制备方法所制备得到的家蝇衍生抗菌肽D‑26M在制备治疗和/或预防因细菌内毒素LPS所诱发引起的炎症性疾病药物中的应用，所述家蝇衍生抗菌肽D‑26M的序列如序列表SEQ ID No.2所示。

说明书

一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M及制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗菌肽及制备方法和应用，特别涉及一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M及制备方法和应用。

背景技术

[0002] 据2016年发表的《抗菌药物评论》估计，目前全世界每年有70万人死于耐抗生素病原体引起的感染，到2050年，如果不能找到减缓耐药性出现的解决方案，每年将有1000万人面临生命危险。鲍曼不动杆菌在临床标本中的分离率和耐药率逐年上升，这已是导致医院感染的主要条件致病菌；革兰氏阴性菌感染过程中释放的内毒素(LPS)持续刺激机体免疫系统，诱发病原菌感染引起的内毒素休克、败血症、泌尿系感染、院内获得性肺炎等，尤其在重症监护病房(intensive care unit，ICU)，致死率高达52％。另外，鲍曼不动杆菌能够持续存在于外界环境中，该致病菌严重危害公共健康，使其成为人们亟待解决的问题。目前研究显示，鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药率高达66％，对被认为是临床治疗耐药性细菌感染最优手段的碳青霉烯类抗生素的耐药率已达46～66％，而在所有接受多粘菌素治疗鲍曼不动杆菌感染的患者中，约有一半患者出现急性肾损。因此，临床上亟需对抗鲍曼不动杆菌感染的新型抗菌药物，世界卫生组织也将针对鲍曼不动杆菌的新药研发列为最优先级/关键性病原体。

[0003] 抗菌肽(Antimicrobial peptiDes，AMPs)是生物体抵抗外界病原体感染的小分子多肽。相较传统抗生素，AMPs具有抗菌谱广、抗菌机理独特并且不易产生耐药性的特性，具备新型抗菌药物开发的巨大潜力，极有希望替代传统抗生素用于临床治疗。但是，AMPs又存在稳定性差、活性低等缺点，从而限制了AMPs的临床应用。因此，根据已知能够影响AMPs生物活性的因素，进行AMPs分子改造及筛选高效衍生肽来克服AMPs的不足，这已成为肽类抗菌药物开发的重要研究领域。影响AMPs生物学活性的重要因素有AMPs的氨基酸组成、肽链长度、净电荷量、α‑螺旋性等。家蝇(Musca Domestica)是呈世界性分布的媒介昆虫，由于孳生环境中病原微生物的结构和多样性复杂，其以抗菌肽为效能分子的高效抗病能力受到广泛关注。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M，该衍生抗菌肽在保有AMPs高抗菌活性的同时，可提高其稳定性和细胞选择性。

[0005] 为实现上述目的，一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M，其序列如序列表SEQ ID No.2所示。

[0006] 优选的，所述抗菌肽D‑26M具有α‑螺旋结构。

[0007] 本发明的另一目的在于提供一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M的制备方法，该制备方法成本低，所制备得到的衍生抗菌肽D‑26M可具有更强的阳离子性、疏水性以及渗透到病原菌双层膜的能力。

[0008] 为实现上述目的，一种家蝇衍生抗菌肽D‑26M的制备方法，具体方法步骤如下：

[0009] (1)采用氨基酸残基替换法对多肽MAF‑1A进行氨基酸序列突变并右旋改造，多肽MAF‑1A的序列如序列表SEQ IQ No.1所示；具体过程为：用右旋Lys替换多肽MAF‑1A氨基酸序列中的Glu和Asp；用右旋Leu替换多肽MAF‑1A氨基酸序列中的Gln和第23位的Lys；用含有吲哚侧链的右旋Trp替代新肽MAF‑1A氨基酸序列中的第9和第15位的Lys；对多肽MAF‑1A中的余下氨基酸均采用相应的右旋氨基酸进行替换；获得长度为26的衍生抗菌肽D‑26M，其序列如序列表SEQ IQ No.2所示；

[0010] (2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成衍生抗菌肽；

[0011] (3)将合成的衍生抗菌肽使用反向高效液相色谱进行纯化，纯化后对多肽进行氨基酸分析及质谱鉴定，完成衍生抗菌肽的制备。

[0012] 本发明的另一目的在于提供如上所述的家蝇衍生抗菌肽D‑26M在制备治疗和/或预防病原菌抑菌剂中的应用。

[0013] 优选的，所述病原菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

[0014] 优选的，所述病原菌为鲍曼不动杆菌。

[0015] 本发明的另一目的在于提供如上所述的家蝇衍生抗菌肽D‑26M在制备治疗和/或预防因细菌内毒素LPS所诱发引起的炎症性疾病药物中的应用。

[0016] 本发明的另一目的在于提供如上所述的家蝇衍生抗菌肽D‑26M在制备治疗和/或预防各种院内、院外感染性疾病及炎症性疾病药物中的应用。

[0017] 优选的，所述各种院内、院外感染性疾病及炎症性疾病包括肺炎、败血症、中耳炎、脑膜炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染。

[0018] 与现有技术相比，本发明在保证AMPs高抗菌活性的情况下，提高了衍生抗菌肽D‑26M的稳定性和细胞选择性。该抗菌肽具有更强的阳离子性、疏水性以及渗透到病原菌双层膜的能力，具有广谱的抗菌活性及高效抗炎活性，对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等都具有良好的杀菌功能，尤其是对多重耐药性鲍曼不动杆菌，对在体内外环境中的游离态鲍曼不动杆菌及其形成的生物被膜均有很好的抗性，且能有效抑制革兰阴性菌外膜LPS的活性，在开发为临床抗感染性及抗炎症性疾病的传统抗生素替代性药物分子具有很好的应用前景。该抗菌肽由26个氨基酸组成，肽链较短，制备成本低。

附图说明

[0019] 图1为模板多肽MAF‑1A与右旋衍生抗菌肽D‑26M的螺旋图：(A)MAF‑1A；(B)D‑26M；

[0020] 图2为抗菌肽D‑26M对鲍曼不动杆菌的时间‑杀菌曲线：(A)短时间1h；(B)长时间12h；

[0021] 图3为抗菌肽D‑26M作用于鲍曼不动杆菌后的扫描电镜结果：(A)PBS阴性对照组；(B)D‑26M实验组；(C)多粘菌素B阳性对照组；

[0022] 图4为抗菌肽D‑26M对鲍曼不动杆菌生物被膜形成影响的结果：(A)结晶紫染色测定不同浓度D‑26M及多粘菌素B对鲍曼不动杆菌生物被膜形成的影响；(B)不同浓度D‑26M及多粘菌素B对鲍曼不动杆菌生物被膜形成量的统计学分析，***P<0.001；

[0023] 图5为不同浓度抗菌肽D‑26M作用下秀丽隐杆线虫的生存曲线；

[0024] 图6为抗菌肽D‑26M对鲍曼不动杆菌感染秀丽隐杆线虫的影响：(A)经不同干预处理后感染线虫的体内带菌量图；(B)不同干预后感染线虫的生存曲线图；

[0025] 图7为抗菌肽D‑26M对LPS的拮抗效应；

[0026] 图8为抗菌肽D‑26M对LPS诱导巨噬细胞炎症因子IL‑1β和TNF‑α表达的影响：(A)ELISA检测IL‑1β细胞因子的分泌；(B)ELISA检测TNF‑α细胞因子的分泌。

具体实施方式

[0027] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

[0028] 一、实验材料与方法

[0029] 1、材料：

[0030] 菌种与虫株：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923、枯草芽孢杆菌ATCC6633、白色念珠菌ATCC10231购自美国模式培养物集存库；多重耐药鲍曼不动杆菌ATCC19606购自贵州医科大学寄生虫学教研室(从贵州省人民医院分离)、野生型秀丽隐杆线虫(WT Bristol N2)购自徐州医科大学遗传学实验室。

[0031] 药品及试剂：MHB培养基、LB培养基、沙堡葡萄糖肉汤(SDA)、胰蛋白酶和琼脂粉购于北京索莱宝公司；RPMI‑1640培养基购于美国G公司；结晶紫染液购于大连美仑有限公司；多粘菌素B、BHI培养基、胰蛋白胨大豆培养基购自北京索莱宝股份有限公司；CCK8试剂盒购自大连美仑生物有限公司；微板定量基质染色法鲎试剂购自厦门鲎试剂有限公司；Mouse IL‑1βELISAKit及Mouse TNF‑αELISA Kit购自Thermo公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；其他分析纯试剂购自北京碧云天生物有限公司。

[0032] 主要仪器：CliniBio 128Ce酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机购于德国EppenDorf公司；扫描电子显微镜购自美国FEI公司；实时荧光定量PCR系统购于瑞士罗氏公司；043BR1549蛋白电泳仪购于美国Bio‑RaD公司。

[0033] 2、方法：

[0034] 衍生抗菌肽的改造与合成：基于阳离子性、疏水性、α‑螺旋结构等影响因素，从家蝇幼虫血淋巴中分离到一抗真菌肽MAF‑1(GENBANK:HM178948)并截取其C端128～153位26个氨基酸组成多肽MAF‑1A，采用氨基酸残基替换法对多肽MAF‑1A进行氨基酸序列突变并右旋(D)改造，为了增强衍生肽的阳离子性，用右旋Lys替换MAF‑1A氨基酸序列中的Glu和Asp；为了增强衍生肽的疏水性及增大α‑螺旋结构的比例，用右旋Leu替换MAF‑1A氨基酸序列中的Gln和第23位的Lys；为了增加AMPs渗透到病原菌双层膜的能力，用含有吲哚侧链的右旋Trp替代MAF‑1A氨基酸序列中的第9和第15位的Lys；对MAF‑1A中的余下氨基酸均采用相应的右旋氨基酸进行替换；引入D‑氨基酸改造增强衍生肽的稳定性，结合生物信息学分析，设计具 有非 完美 两亲 性的 衍生 肽 ，将其 命 名为D ‑2 6M (氨 基酸 序列 为KKFKKTAKWLIKSAWLLLKSLALKMK，均为右旋氨基酸)，利用ExPASy网站软件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析衍生肽理化性质；利用Heliquest software(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi‑bin/ComputParams.py)绘制螺旋轮图；设计的衍生抗菌肽采用固相合成技术进行合成，反相高效液相色谱(RP‑HPLC)纯化(纯度＞97％)，纯化后多肽进行氨基酸分析及质谱(ESI‑MS)鉴定。

[0035] 衍生抗菌肽抗菌活性分析：参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的液体稀释法的判断标准，将白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌分别接种于平板上，制备菌悬液。衍生抗菌肽D‑26M经培养基倍比稀释后分别加入到上述制备的菌悬液中。37℃培养箱孵育24h，采用CliniBio 128Ce酶标仪测量600nm处的吸光度，以抑制菌悬液中微生物生长的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。每个抗菌肽样品设3个重复，以无菌培养基为阴性对照，同时设置多粘菌素B为药物对照，正常生长组为阳性对照。

[0036] 衍生抗菌肽对鲍曼不动杆菌抗菌稳定性分析：分别用150mmol/L NaCl、4.5mmol/L KCl、1mmol/L MgCl2、2.5mmol/L CaCl2、0.15mg/ml Trypin与0.6mg/ml Trypin溶液倍比稀释衍生肽D‑26M，使其反应终浓度依次1.024mg/ml、0.512mg/ml、0.256mg/ml、0.128mg/ml、0.064mg/ml，以MAF‑1A作为对照，测定不同环境中D‑26M对鲍曼不动杆菌的MIC值变化。

[0037] 衍生抗菌肽对鲍曼不动杆菌抗菌时间‑杀菌效应分析：配制0.5麦氏浓度的菌液，将鲍曼不动杆菌菌液与衍生抗菌肽D‑M26(反应终浓度为细菌的MIC值)混匀，37℃摇床震荡培养，分别取培养后第0h、5min、10min、15min、20min、40min、60min、2h、4h、6h、8h、10h、12h的菌液稀释后划线涂板，37℃培养24h后菌落计数。另设无菌PBS为阴性对照组，设置多粘菌素B为阳性对照组，每组重复实验3次。以不同取样时间为横坐标，各时间点对应菌落数的对数lg(cfu/ml)为纵坐标，绘制时间‑杀菌曲线。

[0038] 扫描电镜观察衍生抗菌肽对菌体的影响：取对数生长期鲍曼不动杆菌，MHB培养基6
将其稀释至1.0×10CFU/ml，以1×MIC的抗菌衍生肽为实验组、PBS为对照组、多粘菌素B为药物对照组，放置于37℃摇床，震荡培养1h，低温离心2000r/min 10min，弃上清，无菌水洗涤3次，2％多聚甲醛和3％戊二醛固定过夜。0.1％PBS洗涤3次，1‑2％的四氧化锇浸没1h染色，蒸馏水漂洗3次，按70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇的顺序脱水、干燥、粘台、镀膜后用S‑3400N扫描电镜上机检测。

[0039] 衍生抗菌肽抗鲍曼不动杆菌生物被膜活性分析：使用制备的菌液稀释衍生肽使终浓度依次为1/4×MIC、1/2×MIC、MIC。另设PBS为阴性对照、多粘菌素B为阳性对照组，37℃恒温培养24h；PBS缓慢洗涤3次，加入99％甲醇固定15min；加入0.1％的结晶紫染液5min，无菌双蒸水冲洗并风干；加入95％乙醇，摇床上室温放置30min，酶标仪于600nm处测量吸光度，每个浓度3个孔，每个实验重复3次。

[0040] 秀丽隐杆线虫感染模型评估衍生抗菌肽在体抗菌活性

[0041] 衍生抗菌肽对秀丽隐杆线虫的毒性测定：将线虫培养至L3期，用M9缓冲液冲洗并转移线虫至无菌的NGM固体培养皿上；将制备的线虫挑至含有不同浓度衍生抗菌肽(8×MIC、4×MIC、2×MIC、MIC)的BHI培养基中，使每孔含有约25条线虫，另设不含抗菌肽组为生长对照组。20℃恒温培养，每隔24h用体视显微镜观察记录线虫的死亡和存活数，连续计数7天。

[0042] 秀丽隐杆线虫‑鲍曼不动杆菌感染模型建立及抗菌肽作用分析：

[0043] (1)感染鲍曼不动杆菌线虫经抗菌肽作用后存活时间分析：将鲍曼不动杆菌涂布到胰酪大豆胨琼脂培养基上，37℃恒温培养18h；将同步化的线虫培养至L3期，M9缓冲液重悬后转移至上述培养基上，25℃感染6h后收集虫体；25℃恒温培养，每隔24h观察并记录线虫的存活和死亡数，连续观察7日。

[0044] (2)感染鲍曼不动杆菌线虫经抗菌肽作用后体内带菌数分析：分别设置高浓度(4×MIC)、中浓度(2×MIC)、低浓度(MIC)的抗菌肽处理组；感染并收集虫体，于25℃培养24h时后，取各孔内线虫，经M9缓冲液洗涤三次后研磨；对研磨液进行适当稀释后涂板置于37℃恒温培养箱孵育24h后计数。

[0045] 鲎试验检测衍生肽对LPS的中和作用：按照商品化鲎试验细菌LPS检测试剂盒使用说明书检测抗菌肽与LPS的结合情况，以相对于未处理样品的变化百分比统计结合率。

[0046] 分析衍生抗菌肽对LPS诱导促炎因子表达的影响：常规方法培养小鼠RAW264.7巨噬细胞，预先按1:100加入终浓度为MIC的衍生抗菌肽1h，再加入终浓度100ng/ml LPS。ELISA检测上清IL‑1β、TNF‑α的含量。

[0047] 二、实验结果

[0048] 多肽的性质：改造后全右旋多肽氨基酸序列及特性如表1所示，其分子量为3103Da，较母肽略有增加；正电荷为+9，疏水氨基酸占53.85％，α‑螺旋占50％，比母肽略有下调，最终获得一个非完美两亲结构的衍生肽D‑26M，如图1，浅色背景为疏水性氨基酸；深色背景为亲水性氨基酸；右旋氨基酸替换位置用圆圈标注。

[0049] 表1多肽的性质

[0050]

[0051] 注：D‑氨基酸用斜体标注。

[0052] 衍生抗菌肽抗菌活性分析：结果如表2所示，与模板肽MAF‑1A相比，改造后的衍生抗菌肽D‑26M显著提高了抗菌活性和扩大了抗菌谱，其中对革兰阴性菌效果更显著，抑菌效果接近临床传统抗生素多粘菌素B抗菌水平。

[0053] 表2多肽对不同病原菌MIC测定

[0054]

[0055] “‑”：未测量

[0056] 衍生抗菌肽在盐离子和酶环境中的稳定性检测：D‑26M在不同离子和酶环境中的抗菌活性结果如表3所示，在不同离子环境(150mM NaCl、4.5mM KCl、1mM MgCl2、2.5mM CaCl2)中，在150mM NaCl条件下MIC值完全不受影响，仅在4.5mM KCl、1mmol/L MgCl2及2.5mmol/L CaCl2条件下MIC值升高了1倍，涨幅不大，因此，D‑26M对鲍曼不动杆菌的MIC值几乎未受影响。在不同浓度的胰酶(0.15mg/ml Trypsin、0.6mg/ml Trypsin)环境中，D‑26M对鲍曼不动杆菌的MIC值未受影响。表明D‑26M在生理环境下对鲍曼不动杆菌的抑制效应具有良好稳定性。

[0057] 表3不同生理环境下D‑26M对鲍曼不动杆菌的MIC值检测

[0058]

[0059] 衍生抗菌肽对鲍曼不动杆菌抗菌时间‑杀菌效应测定：动态监测MIC浓度下衍生抗菌肽D‑M26在短时间(1h)和长时间(12h)内对鲍曼不动杆菌的杀菌效果，结果如图2，不加药物的正常对照组鲍曼不动杆菌正常生长；MIC浓度下，D‑26M作用10min时即开始对鲍曼不动杆菌起杀菌作用，这一速度明显快于阳性对照多粘菌素B；同时D‑26M在12h内具有与多粘菌素B同样长效的抑菌效果。

[0060] 扫描电镜观察衍生抗菌肽对菌体的影响：扫描电镜观察经不同处理1h后鲍曼不动杆菌形态变化。结果如图3所示：PBS阴性对照组(A)鲍曼不动杆菌菌体饱满、形态正常、表面平整光滑；MIC浓度的D‑26M处理鲍曼不动杆菌后(B)，菌体崩解、内容物释放，菌体失去原有的细胞结构，阳性对照多粘菌素B处理组(C)，细胞膜较平滑，仅在部分位置形成孔洞。由此表明D‑26M通过破坏鲍曼不动杆菌细胞膜而发挥其杀菌效应，且破膜效应更强于多粘菌素B。

[0061] 衍生抗菌肽对鲍曼不动杆菌生物被膜的影响：结晶紫染色结果如图4(A)所示，1/4×MIC、1/2×MIC、MIC浓度的多肽或阳性对照药物多粘菌素B存在时，被染成深色的细菌生物被膜逐渐变淡；图4(B)统计分析显示，三种浓度D‑26M处理后的鲍曼不动杆菌，其生物被膜生成量平均依次为69.27％、42.34％、20.66％。以上结果表明，环境中多肽的浓度越高，细菌生物被膜的形成量越少。

[0062] 衍生抗菌肽对秀丽隐杆线虫的毒性分析：如图5所示，正常饲养的秀丽隐杆线虫在培养7天后的生存率接近90％( 组)；当线虫的培养环境中分别含有浓度为MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC的D‑26M时，与不加抗菌肽处理组线虫生存曲线比较并无差异。说明在测试浓度下，多肽对线虫无毒性。

[0063] 衍生抗菌肽对鲍曼不动杆菌感染秀丽隐杆线虫的影响：分别对感染鲍曼不动杆菌的秀丽隐杆线虫给予高(4×MIC)、中(2×MIC)、低(MIC)浓度的多肽干预，结果如图6(A)，多肽处理后线虫体内带菌量明显减少，同时，感染组线虫在感染2天后全部死亡，而多肽能够显著延长感染线虫的存活时间，且延长时间与浓度呈剂量依赖性，如图6(B)。结果表明衍生抗菌肽对鲍曼不动杆菌感染均有良好的治疗效果。

[0064] 衍生抗菌肽对细菌内毒素LPS的影响：将MIC、2×MIC浓度的多肽与0.25EU的LPS孵育1h并使用鲎试剂检测LPS的相对活性，结果如图7，LPS在与MIC、2×MIC浓度的多肽混合1h后，其活性仅为LPS组的61.42％、47.97％。表明多肽能够影响LPS活性，且浓度越高对LPS活性影响越大。

[0065] 衍生抗菌肽对LPS诱发炎症反应的影响：如图8ELISA结果所示，D‑26M能显著抑制LPS诱发RAW264.7巨噬细胞炎症因子IL‑1β和TNF‑α分泌的能力。

[0066] 以上实验结果证明，改造后的衍生抗菌肽D‑26M具有广谱抗菌活性，尤其对耐药性鲍曼不动杆菌抑菌性最强。其对革兰氏阴性菌：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌ATCC19606的最小抑菌生长浓度(MIC)分别为2.5μM、2.5μM、5μM、2.5μM；对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC25923、枯草芽孢杆菌ATCC6633的MIC值分别为80μM、20μM；对真菌白色念珠菌ATCC10231的MIC值为40μM。因此本发明所提供的抗菌肽D‑26M可应用于治疗或预防病原菌尤其是革兰阴性菌的药物中，且在不同生理环境下的稳定性较模板肽显著提高。

[0067] 抗菌机理研究显示，D‑26M具有快速、持久杀伤鲍曼不动杆菌的优点，作用10min即能杀菌并能有效维持12h，明显快于临床药物多粘菌素B。对细菌生物被膜形成的抑制效果显著；使用秀丽隐杆线虫作为体内实验模式动物模型发现，D‑26M体内低毒且抗菌活性稳定。同时，D‑26M能够有效拮抗细菌内毒素LPS活性，并发挥抑制LPS诱发炎症反应的功能。本发明所提供的D‑26M具有良好的体内外抗鲍曼不动杆菌活性及抗LPS活性，能够应用于因鲍曼不动杆菌感染而引起的疾病的药物中，同时，也能够应用于治疗或预防因细菌内毒素LPS所诱发引起的炎症性疾病的药物中，对包括肺炎、败血症、中耳炎、脑膜炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染等各种院内、外感染性及炎症性疾病具有很好的应用前景。