一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针

摘要

本发明提供一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针，包括：（1）磁珠，（2）适配体三核酸骨架链，（3）单链DNA靶标。本发明以适配体序列为识别元件、三核酸为分子转换元件，磁珠为分离纯化元件，构建了具有三重功能的磁性适配体三核酸DNA纳米探针，实现了配体与单链DNA的等量转换。将不易检测的配体转换为容易测定的单链DNA靶标，解决了目前配体不易直接定性定量同时测定的难题。

权利要求

1.一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针，其特征在于，包括：（1）磁珠，（2）适配体三核酸骨架链，（3）单链DNA靶标；

所述探针具有靶标识别、分子转换、分离纯化三重功能；

适配体三核酸骨架链5’端固定在磁珠上；

其中，所述适配体三核酸骨架链序列5’至3’依次为：三核酸序列A、适配体序列B、三核酸序列C；

其中，三核酸序列A为：5’‑TTTTTCTCTCCCTTT‑3’；

三核酸序列C为：5’‑TTTCCCTCTC‑3’；

所 述 单 链 D N A靶 标 为 单 链 核 酸 序 列 D ，单 链 核 酸 序 列 D 为 ：5’‑GAGAGAGAGAGAGAGAGGGAAAAGGAAAGG‑3’。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的适配体三核酸骨架链与所述的单链DNA靶标之间自组装形成茎环结构，环部分是适配体序列B，茎部分是三核酸。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的环部分当配体存在时会识别并结合配体，适配体三核酸骨架链构象发生改变，茎部分的三核酸结构崩解，释放单链DNA靶标；通过外部磁场，将单链DNA靶标分离，上清液中单链DNA靶标与配体的量呈正相关。

4.一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针，其特征在于，包括：（1）磁珠，（2）适配体三核酸骨架链，（3）单链DNA靶标；

所述适配体三核酸骨架链为序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

所述单链DNA靶标为序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

所述探针具有靶标识别、分子转换、分离纯化三重功能；

适配体三核酸骨架链5’端固定在磁珠上。

5.权利要求1‑4任一项所述探针在非治疗或诊断目的的识别和靶标转换方面中的应用。

说明书

一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针。

背景技术

[0002] 三核酸属于功能核酸中的一类，是构建新型生物传感器的工具之一。三核酸是在双链核苷酸双螺旋结构的大沟中，以胡斯特氢键或反胡斯特氢键的形式结合了第三条链的
三链核苷酸。三核酸的形成与核酸序列、碱基组成、离子环境、pH值等条件密切相关。由于其
结构的可逆性，三核酸可以作为生物传感器中的“开关”，常用于靶标物质转化。

[0003] 目前普遍应用的外泌体或其他配体的检测方法很难实现配体物质的同时定性又定量的检测，而核酸的检测技术已经较为成熟，因此将不易测定的配体转化为较易检测的
单链核酸靶标具有重大意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针。

[0005] 本发明的另一目的是提供一种将配体物质等量转换为单链核酸靶标的方法。

[0006] 为了实现本发明目的，发明人根据配体物质的特异性适配体，以及三核酸形成的特殊要求，设计了中间含有适配体序列的适配体三核酸骨架链，通过与单链DNA靶标之间自
组装形成茎环结构，再通过相互作用将磁珠固定在茎环结构末端，构建了一种具有三重功
能的磁性适配体三核酸纳米探针。

[0007] 第一方面，本发明提供一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针，包括：（1）磁珠，（2）适配体三核酸骨架链，（3）单链DNA靶标。

[0008] 所述探针具有靶标识别、分子转换、分离纯化三重功能。

[0009] 其中，所述适配体三核酸骨架链包括：5’端核酸序列A、适配体序列B、3’端核酸序列C；所述单链DNA靶标包括：单链核酸序列D；所述适配体序列B位于所述5’端核酸序列A和
3’端核酸序列C之间；所述适配体序列B包括可与配体物质特异性结合的核酸序列；所述单
链核酸序列D可以和5’端核酸序列A和3’端核酸序列C自组装形成三核酸。

[0010] 所述的适配体三核酸骨架链与所述的单链DNA靶标之间自组装形成茎环结构，环部分是适配体序列B，茎部分是三核酸。

[0011] 所述的磁珠通过相互作用固定在所述茎环结构中适配体三核酸骨架链的5’端。

[0012] 所述探针的环部分当配体存在时会识别并结合配体，适配体三核酸骨架链构象发生改变，茎部分的三核酸结构崩解，释放单链DNA靶标。通过外部磁场，将单链DNA靶标分离，
上清液中单链DNA靶标与配体的量呈正相关。

[0013] 具体的，所述探针还包括下述1）‑3）中的至少一种：

[0014] 1）所述适配体三核酸骨架链包括：将序列表中SEQ ID №：3与SEQ ID №：5所示的核苷酸序列通过序列表中SEQ ID №：4所示的核苷酸序列连接后得到的核酸链；

[0015] 2）所述适配体三核酸骨架链包括：将序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列
具有相同功能的核苷酸序列；

[0016] 3）所述单链DNA靶标包括：将序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列具有相同
功能的核苷酸序列。

[0017] 所述A、B、C、D只用于区别不同的序列，不用于排序。

[0018] 本发明还提供前述探针在配体物质与单链核酸靶标转换方面的应用，所述转换可表现为等量转换。

[0019] 第二方面，本发明提供了一种利用前述探针将配体物质与单链核酸靶标进行等量转换的方法，包括如下步骤：

[0020] S1、将所述适配体三核酸骨架链与单链DNA靶标混合孵育，获得适配体三核酸纳米探针储备液；

[0021] S2、将所述的磁珠与适配体三核酸纳米探针偶联，得到磁性适配体三核酸纳米探针；

[0022] S3、将得到的磁性适配体三核酸纳米探针与配体混合孵育，磁分离，得到转换的单链 DNA靶标溶液。

[0023] S1具体如下：将适配体三核酸骨架链与单链DNA靶标按1：1‑1.5的比例混合，于避光、35‑40℃条件下孵育0.5‑1.5h，获得适配体三核酸纳米探针储备液。

[0024] 还具体的，将适配体三核酸骨架链与单链DNA靶标按1：1‑1.1的比例混合，于避光、37℃条件下孵育1h，获得适配体三核酸纳米探针储备液。

[0025] S2具体如下：在磁珠中加入80‑120μL适配体三核酸纳米探针储备液，混合均匀，于室温在旋转缓慢震荡条件下孵育0.5‑1.5h，得到磁性适配体三核酸纳米探针。

[0026] 还具体的，在磁珠中加入100μL适配体三核酸纳米探针储备液，混合均匀，于室温在旋转缓慢震荡条件下孵育1h，得到磁性适配体三核酸纳米探针。

[0027] S3具体如下：取得到的磁性适配体三核酸纳米探针溶液40‑60µL，加入10‑20µL配体溶液，于35‑40℃、避光条件下孵育1‑3h，磁分离，得到含有游离单链DNA靶标的上清溶液。

[0028] 还具体的，取得到的磁性适配体三核酸纳米探针溶液50µL，加入15µL配体溶液，于37℃、避光条件下孵育2h，磁分离，得到含有游离单链DNA靶标的上清溶液。

[0029] 本发明提供一种将配体物质等量转换为单链核酸靶标的方法，包括如下步骤：

[0030] 首先将适配体三核酸骨架链与单链DNA靶标按1：1‑1.5的比例混合，于避光、35‑40℃条件下孵育0.5‑1.5h，获得适配体三核酸纳米探针储备液。在磁珠中加入80‑120μL适配
体三核酸纳米探针储备液，混合均匀，于室温在旋转缓慢震荡条件下孵育0.5‑1.5h，得到磁
性适配体三核酸纳米探针。取得到的磁性适配体三核酸纳米探针溶液40‑60µL，加入10‑20µ
L配体溶液，于35‑40℃、避光条件下孵育1‑3h，磁分离，得到含有游离单链DNA靶标的上清溶
液，游离单链DNA靶标的量与配体的量相同。

[0031] 所述适配体三核酸骨架链包括：5’端核酸序列A、适配体序列B、3’端核酸序列C；所述单链DNA靶标可以与适配体三核酸骨架链的5’端核酸序列A和3’端核酸序列C自组装形成
三核酸；所述适配体为与其配体物质特异性结合。

[0032] 优选的，所述三核酸中T‑A:T比例为50%。

[0033] 优选的，前述的方法，适配体三核酸骨架链、单链DNA靶标碱基序列如下：

[0034] 适配体三核酸骨架链：5’‑ TTTTTCTCTCCCTTTCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTCCCTCTC‑3’

[0035] 单链DNA靶标：5’‑GAGAGAGAGAGAGAGAGGGAAAAGGAAAGG‑3’

[0036] 其中，下划线部分表示适配体序列。

[0037] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0038] 本发明以适配体序列为识别元件、三核酸为分子转换元件，磁珠为分离纯化元件，构建了具有三重功能的磁性适配体三核酸纳米探针，用于将配体物质与单链核酸靶标进行
等量转换，将不易测定的配体转化为较易检测的单链核酸靶标，可以克服目前难以实现对
配体物质同时定性又定量检测的难题。

[0039] （一）纳米探针为茎环结构，环部分是适配体序列，可用于识别并结合配体物质；茎部分是三核酸，可固定单链DNA靶标，作为“分子开关”，进行靶标分子的转换；末端磁珠在外
部磁场作用下可进行分离纯化；得到的上清液中单链DNA靶标与配体物质的量呈正相关，可
直接用于后续的检测。

[0040] （二）探针构建简单、通用，只需替换适配体三核酸骨架链中的特异性适配体序列，就可以实现各种配体物质与单链DNA靶标之间的转换。

[0041] （三）将不易测定的配体物质转化为较易检测的单链核酸靶标，有利于实现配体物质的同时定性和定量测定。

附图说明

[0042] 图1为本发明的磁性适配体三核酸纳米探针靶标转换的原理

[0043] 图2为本发明实施例1中用荧光法验证适配体三核酸纳米探针组装成功的结果；其中黑色曲线表示体系中只含有5’端和3’端分别标记了荧光基团和淬灭基团的适配体三核
酸骨架链，红色曲线表示体系中同时含有骨架链和单链DNA靶标。

[0044] 图3为本发明实施例1中用荧光法验证适配体三核酸纳米探针的靶标转换功能的结果；其中，红色曲线表示体系中只含有茎环结构的适配体三核酸纳米探针，蓝色曲线表示
向含有茎环结构的适配体三核酸纳米探针体系中加入了外泌体。

[0045] 图4为本发明实施例1中用Zeta电位表征磁性适配体三核酸纳米探针的成功组装。

具体实施方式

[0046] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0047] 本发明中，工作缓冲液配方为：10mM HEPES、150mM NaCl、pH 5.5。

[0048] 实施例1 一种三功能的磁性适配体三核酸纳米探针的构建

[0049] 1、实验材料

[0050] HEPES和氯化钠购自阿拉丁，磁珠购自中科雷鸣（北京）科技有限公司。实验用水均来自Milli‑Q纯水系统。

[0051] 序列设计如下（SEQ ID NO:1‑2）：

[0052]

[0053] 注：下划线部分表示外泌体表面CD63蛋白的适配体序列；

[0054] 加粗部分表示形成三核酸的序列。

[0055] 2、适配体三核酸纳米探针的构建和表征

[0056] 将5’端和3’端分别标记了荧光基团和淬灭基团的适配体三核酸骨架链与单链DNA靶标按1：1.1比例混合，于避光、37℃条件下孵育1h，获得浓度为200nM的适配体三核酸纳米
探针储备液；用酶标仪于激发光488nm，发射光500‑600nm条件下检测荧光强度。单独的适配
体三核酸骨架链溶液具有较强的荧光，加入单链DNA靶标后，由于三核酸茎环结构的形成，
荧光基团与淬灭基团靠近，发生荧光淬灭，荧光强度显著降低；说明茎环结构的适配体三核
酸纳米探针成功构建（图2）；荧光淬灭率接近60%，说明探针的自组装率约为 60%。

[0057] 3、适配体三核酸纳米探针的靶标转换功能验证

[0058] 将5’端和3’端分别标记了荧光基团和淬灭基团的适配体三核酸骨架链与单链DNA靶标按1：1.1比例混合，于避光、37℃条件下孵育1h，获得浓度为200nM的适配体三核酸纳米
探针储备液；取所得储备液50µL，加入15µL外泌体溶液作为实验组，取所得储备液50µL，加
入15µL工作缓冲液作为对照组，于37℃、避光条件下孵育2h；用酶标仪于激发光488nm，发射
光500‑600nm条件下检测荧光强度。单独的适配体三核酸纳米探针溶液具有较弱的荧光，加
入外泌体之后，因环部分的适配体序列与外泌体表面蛋白CD63结合，核酸构象发生改变，茎
环结构崩解，单链DNA靶标释放，荧光基团与淬灭基团彼此远离，荧光得到恢复；证明了适配
体三核酸纳米探针的靶标分子转换功能（图3）。

[0059] 4、磁性适配体三核酸纳米探针的组装表征

[0060] 采用Zetasizer Nano ZS分析仪对制备的磁性适配体三核酸纳米探针进行Zeta电位表征。未修饰DNA前，磁珠表面电位为‑2.68mV，当其表面结合了DNA时，电位出现显著下
降，而结合适配体三核酸纳米探针比结合适配体三核酸骨架链电位下降更多，说明磁性适
配体三核酸纳米探针的成功组装（图4）。

[0061] 实施例2 有效靶标转换效率验证

[0062] 将5’端和3’端分别标记了荧光基团和淬灭基团的适配体三核酸骨架链与单链DNA靶标按1：1.1比例混合，于避光、37℃条件下孵育1h，获得浓度为200nM的适配体三核酸纳米
探针储备液；用酶标仪于激发光488nm，发射光500‑600nm条件下检测荧光强度，保存记录
后，将最大发射光532nm时的荧光强度记为I1，对照组的荧光强度记为I2，计算荧光淬灭率
Q，计算公式为：Q=(I2‑I1)/I2×100%。

[0063] 取所得储备液50µL，加入15µL外泌体溶液作为实验组；取所得储备液50µL，加入15µL工作缓冲液作为对照组，于37℃、避光条件下孵育2h；所得实验组与对照组溶液，用酶标
仪于激发光488nm，发射光500‑600nm条件下检测荧光强度，保存记录后，将最大发射光
532nm时的实验组荧光强度记为I3，对照组荧光强度记为I4，计算荧光增强率F，计算公式
为：F=(I3‑I4)/I3×100%。

[0064] 得到Q为79.21%，F为78.65%，有效靶标转换率（Q与F的乘积）达62.30％。