一种浓度梯度芯片及对细菌进行药敏性检测的方法

摘要

本发明公开了一种浓度梯度芯片及对细菌进行药敏性检测的方法。本发明对流阻性梯度芯片进行了创新型设计，简化了常规梯度芯片形成梯度的控制，可自动产生药物浓度并进行细菌药敏性检测。该芯片设计有若干独立的截留腔室，可形成独立的微液滴用于检测细菌药敏性，还便于实时观察细菌在不同药物浓度梯度下的生长情况，从而确定菌株的最小抑制浓度和药敏性评级。该药敏性检测方法通过截留腔室的芯片设计使得受测菌株在不同浓度药物下独立生长，有效避免了交叉污染。该芯片设计还具有良好的可拓展性；通过调节截留腔室的数量，可灵活控制产生更密集或稀疏的浓度梯度。本发明制造简便，简化了控制操作和设备集成，节约了成本。

权利要求

1.一种浓度梯度芯片，其特征在于，包括主通道，在主通道两端分别开有入口和出口，在主通道上由前端至后端依次开有储液孔和若干均匀交错分布于主通道两侧的截留腔室，所述入口、出口、储液孔、截留腔室均与主通道连通，各截留腔室上均开有排气孔；所述芯片在使用时首先在储液孔储存药物溶液，利用注射泵将菌液从入口处注入到芯片主通道内，当菌液流经储液孔时，药物溶液扩散到菌液中，随着菌液的继续流入，截留腔室内将依次充满含有递减浓度药物的菌液，然后通过注射泵的抽取模式移除主通道内的菌液，各截留腔室内的菌液则被截留，培养后测定各截留腔室OD值观测细菌在不同浓度药物作用下的生长情况，从而确定菌株的最小抑制浓度和药敏性评级。

2.根据权利要求1所述的浓度梯度芯片，其特征在于，所述的排气孔孔径小于所述出口孔径。

3.根据权利要求1所述的浓度梯度芯片，其特征在于，所述截留腔室以及其入口宽度应满足能够让流体顺利流入截留腔室，也能在移除主通道溶液时在截留腔室内截留足量的样品溶液。

4. 根据权利要求3所述的浓度梯度芯片，其特征在于，所述截留腔室的优化参数如下：所述截留腔室半径为2 mm，同侧相邻两截留腔室中心间距为 10 mm，截留腔室的入口宽度为1 mm。

说明书

一种浓度梯度芯片及对细菌进行药敏性检测的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测技术领域，涉及一种细菌药敏性检测的方法，尤其是涉及一种浓度梯度芯片及对细菌进行药敏性检测的方法。

背景技术

[0002] 基于传统平板的纸片法检测细菌药敏性是经典的药敏检测方法，但是需要大量的[1]
人工操作，且通常需要24‑48h才能得到检测结果 。微流控芯片技术具有易集成，试剂用量
小，高通量等优势，现也被广泛应用于细菌药敏检测中，基于微流控芯片的药敏性检测通常
结合光学或电学的检测原理，以此来评估细菌的生长状态，从而确定细菌是否具有耐药
[2]
性 。微流控芯片可以通过设计树状结构，自动产生浓度梯度，通常，该设计有两个入口，一
个入口通入高浓度药物，另一个入口通入稀释溶液，两种溶液在每一个交叉点汇合，从而产
生另一种浓度的支流，其中最终产生的浓度梯度可通过流量大小进行计算。该方法芯片设
计简单，易于产生可计算的浓度梯度，因此是细胞培养和抗生素药敏性实验中常用的方法
[3]
之一 。但该设计因其占地面积大和易于阻塞而受到限制。在细菌药敏检测方面，扩散法是
最为常用的一种梯度产生方式，通常微流控芯片设计有一侧的药物通道和另一侧的扩散通
道，抗生素药物可通过琼脂等易于扩散的水基介质从源通道向另一侧进行扩散，从而形成
[4]
一定的浓度梯度 。尽管此芯片以简单的结构而被广泛应用，但由于长时间的扩散不稳定
性，并不能直观的得到最低抑制浓度。微液滴芯片是一种可进行高通量产生或捕获微液滴
的装置，即可通过油包水原理生产具有不同抗生素浓度的微液滴，也可通过流阻原理设计
捕获流体的特殊结构。其中通过设计液滴捕获装置，可将微液滴固定在芯片设定的腔室内，
[5]
液滴间相互独立，避免了交叉污染 。但产生大量均匀的微液滴需要对流体的精准控制，对
设备间的配合和精度要求较高。

[0003] 参考文献：

[0004] 1.Matuschek,E.,et al.,Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine 
microbiology laboratories.2016,20(4):p.O255‑O266.

[0005] 2.Khan Z A,Siddiqui M F,Park S.Progress in antibiotic susceptibility tests:a comparative review with special emphasis  on microfluidic 
methods.Biotechnology Letters,2019.

[0006] 3.Zhou,B.,et al.,Preparation of orthogonal physicochemical gradients on PDMS surface using microfluidic concentration gradient generator.Applied 
Surface Science,2019.471:p.213‑221.

[0007] 4.Kim,S.C.,et al.,Miniaturized Antimicrobial Susceptibility Test by Combining  Concentration  Gradient  Generation  and  Rapid  Cell 
Culturing.Antibiotics(Basel),2015.4(4):p.455‑66.

[0008] 5.Kim,S.,et al.,Microfluidic‑based observation of local bacterial density under antimicrobial concentration gradient for rapid antibiotic 
susceptibility testing.Biomicrofluidics,2019.13(1):p.014108.

发明内容

[0009] 现有应用在细菌药敏性检测中的常用的两种浓度梯度芯片通常为树状芯片和扩散型芯片。树状芯片版面大，且容易阻塞，并且需要至少两个注射泵精密控制；扩散芯片的
长时间不稳定性，且不能独立观察有交叉污染的风险；本发明的目的在于针对现有技术的
不足，提供一种浓度梯度芯片及对细菌进行药敏性检测的方法。

[0010] 本发明采用的技术方案如下：

[0011] 一种浓度梯度芯片，包括主通道，在主通道两端分别开有入口和出口，在主通道上由前端至后端依次开有储液孔和若干均匀交错分布于主通道两侧的截留腔室，所述入口、
出口、储液孔、截留腔室均与主通道连通，各截留腔室上均开有排气孔。

[0012] 上述技术方案中，进一步的，所述的排气孔孔径应小于所述出口孔径，设置排气孔可以实现：当流体由主通道流向截留腔室时，避免腔内较大压力，从而让流体顺利充满截留
腔室，控制排气孔孔径小于所述出口孔径可以起到阻碍流体流动的作用，这样待流体充满
截留腔室后又能进一步的阻碍流体继续流动从而更好的实现截留的目的。

[0013] 进一步的，所述截留腔室以及其入口宽度应满足能够让流体顺利流入截留腔室，也能在移除主通道溶液时在截留腔室内截留足量的样品溶液；所述截留腔室的优化参数如
下：所述截留腔室半径为2mm，同侧相邻两截留腔室中心间距为10mm，截留腔室的入口宽度
为1mm。其中可根据实验需要设计截留腔室的数量，以得到不同的浓度梯度；但截留腔室的
尺寸设计和各截留腔室入口宽度会极大影响截留效果，确定截留腔室尺寸后优化其入口宽
度，当宽度大于1.0mm时，腔室内的流体形成独立的微液滴需要更大的压力，因而会导致截
流腔室内的溶液体积较小，当截留腔室入口宽度小于1.0mm，由于流阻作用影响增大，流体
不易顺利流入腔室内。

[0014] 基于上述的芯片可实现对细菌药敏性的检测，首先在储液孔储存药物溶液，利用注射泵将菌液从入口处注入到芯片主通道内，当菌液流经储液孔时，药物溶液扩散到菌液
中，随着菌液的继续流入，截留腔室内将依次充满含有递减浓度药物的菌液，然后通过注射
泵的抽取模式移除主通道内的菌液，各截留腔室内的菌液则被截留，培养后测定各截留腔
室OD值观测细菌在不同浓度药物作用下的生长情况，从而确定菌株的最小抑制浓度和药敏
性评级。

[0015] 本发明借鉴微液滴形成原理，创新性设计了基于流阻原理的可产生浓度梯度的微液滴芯片，并利用其进行细菌的药敏性检测。该梯度产生芯片设计灵活、操作方便且可高通
量产生相互独立的微液滴。因此该基于流阻式的独立液滴微流控芯片可避免实验交叉污
染，简化设备集成等，对提高药敏性检测的精准性，简化实验操作等具有重要意义。相较于
树状芯片、扩散性芯片以及传统微液滴芯片，有益效果如下：

[0016] (1)腔室内的菌液独立反应，避免交叉污染：芯片内设计的截流腔室能够有效截流菌液，形成独立的反应。

[0017] (2)形成的药物浓度梯度具有良好的可调节性：可通过设计芯片中截留腔室的数量，调节得到更密集或稀疏的浓度梯度。

[0018] (3)该芯片设计灵活小巧，避免占据较大的版面：该梯度芯片不需要设计多个流体交汇点进行溶液的稀释和浓度梯度的形成(如树状芯片)，截留腔室均匀分布在主通道的两
侧，节约了占用面积。

[0019] (4)简化了控制操作和设备集成：该芯片设计了储液孔，可将药物液滴预先存储，因而只需要准确控制样品溶液的输入，从而简化了操作，节约了成本。

附图说明

[0020] 图1：基于光固化打印机制造的细菌药敏检测浓度梯度芯片；

[0021] 图2：梯度芯片实物图；

[0022] 图3：不同浓度的罗丹明模拟B和H值间的线性关系；

[0023] 图4：罗丹明B模拟抗生素的浓度梯度形成过程；

[0024] 图5：截留腔室入口宽度的优化设计示意图；

[0025] 图6：E.coliMG1655在芯片里的生长；

[0026] 图中：

[0027] 11：光源，12：玻片，13：薄膜，14：支撑平台，15：紫外光，16：样品支撑台，17：模具，21：入口，22：储液孔，23：截留腔室，24：排气孔，25：出口。

具体实施方式

[0028] 下面结合附图和具体实例对本发明的技术方案做进一步的解释说明。

[0029] 本发明的浓度梯度芯片是对流阻性梯度芯片的进一步创新型设计，简化了常规梯度芯片形成梯度的控制，可自动产生药物浓度并进行细菌药敏性检测，通常包括主通道，在
主通道两端分别开有入口和出口，在主通道上由前端至后端依次开有储液孔和若干均匀交
错分布于主通道两侧的截留腔室，所述入口、出口、储液孔、截留腔室均与主通道连通，各截
留腔室上均开有排气孔。如图1、2所示，本实例的整个芯片尺寸为45mmx22mmx3mm在主通道
的两侧均匀依次分布六个截留腔室，每个截留腔室半径为2mm，同侧相邻两腔室中心间距为
10mm。排气孔半径为0.3mm，储液孔半径为0.4mm。其制备可以采用：将设计好的模型存储为
STL格式，用光固化打印机进行打印，然后用配好的PDMS进行浇筑，80℃热固化一小时后，将
PMDS取出，用等离子清洗机对PDMS表面进行30s等离子清洗；最后和玻璃进行键合，得到浓
度梯度芯片。

[0030] 储液孔用来预先存储少量高浓度药物溶液液滴(由于表面作用液滴会贮留于储液孔中)，利用注射泵将菌液从入口处注入到芯片主通道内，当菌液流经储液孔时，药物溶液
液滴于菌液接触从而扩散到菌液中，随着菌液的继续流入，截留腔室内将依次充满含有递
减浓度药物的菌液，然后通过注射泵的抽取模式移除主通道内的菌液，各截留腔室内的菌
液则被截留，形成浓度梯度(如图4)；截留腔室的入口宽度经优化设计，取1.0mm最为合适，
如图5所示，其达到的截留效果最佳；

[0031] 下面以细菌对抗生素药敏性为例利用上述设计的芯片进行检测：

[0032] 首先，用光固化打印机打印出用于制作芯片的模具；然后，以1:1的比例混合PDMS单体和固化剂，倾倒在模具中，热固化完成后，从模具中取下PDMS和玻璃键合，得到能够自
动产生浓度梯度的PDMS芯片。

[0033] 1.利用罗丹明模拟确定截留腔室内最终抗生素浓度

[0034] 配置不同罗丹明B溶液(0.5‑0.0039mg/mL)，得到色相值H和浓度之间的关系，如图3所示，R＝0.9878说明可以用色相值H表示罗丹明B的浓度。取2μL浓度为10mg/mL的罗丹明B
水溶液注入到储液孔中，然后从入口处注入水溶液，后根据最终截留腔室中罗丹明B颜色的
H值来判断每个截留腔室内的罗丹明B浓度。如图3；

[0035] 2.利用该梯度芯片进行细菌药敏性检测

[0036] 将微量高浓度抗生素溶液存贮在入口附近的储液孔中；接着，取过夜培养的大肠7
杆菌E.coli MG1655，用LB液体培养基稀释至～10CFU/mL,取浓度为5mg/mL的卡那霉素预
7
先注入到储液孔中，后泵入浓度为～10CFU/mL的菌液充满整个芯片，随后移除主通道内的
菌液，将芯片放置恒温培养箱，16h后取截留腔室内的2μL菌液，用Nanodrop检测每个腔室内
的OD值以观察细菌的生长状况并确定细菌敏感度和最低抑制浓度(MIC值)(表1)。此外，取5
μL菌液加入1μL细菌死活染色液，对菌体进行染色，用荧光显微镜观察细菌形态和生长状
态，图6为E.coliMG1655在本发明芯片里的生长情况。

[0037] 表1利用该浓度梯度芯片得到MG1655对卡那霉素的敏感度和最低抑制浓度(S：敏感，I：中性，R：耐药)

[0038]