抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

摘要

本发明提供一种抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT‑PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗IMP型碳青霉烯酶抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定；获得的抗IMP型碳青霉烯酶抗体能够用于检测IMP型碳青霉烯酶，效价达到了1:640000以上，将其制备成体外诊断试剂盒或微流体芯片，能够用于耐药菌株的早期分型，指导用药，辅助临床感染控制和治疗，对提高我国的医疗卫生水平具有重要意义。

权利要求

1.一种抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为1AA4，保藏编号为CGMCC No.20288；或命名为AH9，保藏编号为CGMCC No.20287。

2.一种抗IMP型碳青霉烯酶抗体，其特征在于：抗体1AA4，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3，重链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3；

或者，

抗体AH9，轻链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDR1、SEQ ID NO:12所示的CDR2和SEQ ID NO:13所示的CDR3，重链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDR1、SEQ ID NO:15所示的CDR2和SEQ ID NO:16所示的CDR3。

3.根据权利要求2所述的抗IMP型碳青霉烯酶抗体，其特征在于：抗体1AA4轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；

或者，

抗体AH9轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示。

4.根据权利要求2或3所述的抗IMP型碳青霉烯酶抗体，其特征在于：抗体1AA4由保藏编号为CGMCC No.20288的抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株产生；

抗体AH9由保藏编号为CGMCC No.20287的抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株产生。

5.一种核酸分子，其特征在于：包含编码权利要求2或3所述的抗IMP型碳青霉烯酶抗体的核苷酸。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码抗体1AA4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述核酸分子编码抗体1AA4的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

或者，

所述核酸分子编码抗体AH9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述核酸分子编码抗体AH9的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

7.权利要求2‑4中任一所述的抗IMP型碳青霉烯酶抗体在制备检测IMP型碳青霉烯酶抗原试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的抗IMP型碳青霉烯酶抗体在制备检测IMP型碳青霉烯酶抗原试剂中的应用，其特征在于：将抗IMP型碳青霉烯酶抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片，所述体外诊断试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

9.根据权利要求7所述的抗IMP型碳青霉烯酶抗体在制备检测IMP型碳青霉烯酶抗原试剂中的应用，其特征在于：制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，抗体1AA4为包被抗体，抗体AH9为金标抗体；

或者，抗体AH9为包被抗体，抗体1AA4为金标抗体。

说明书

抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗体制备技术领域，尤其是涉及一种抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。

背景技术

[0002] 碳青霉烯类抗生素是控制临床致病菌感染最有效的药物之一，产碳青霉烯酶生物（CPO）和耐碳青霉烯肠杆菌因其广谱耐药性成为了一个全球公共卫生问题，患者的治疗方
法非常有限。肠杆菌科细菌是院内感染和社区获得性感染的重要病原菌。近年来由于头孢
菌素的广泛应用，肠杆菌科中产超广谱β－内酰胺酶（extended spectmbeta‑lactamases, 
ESBLs）及Amp C酶的菌株比例呈明显上升趋势，治疗此类菌株感染的首选药物是碳青霉稀
类抗菌药物。但是，伴随着亚胺培南和美罗培南在临床上的大量使用，耐碳青霉炼类肠杆菌
科细菌（Carbapenem‑resistanctenterobacteriaceae，CRE）数量也呈逐年上升趋势。临床
研究表明CRE菌株对多种抗菌药物耐药，因此临床治疗药物的可选择范围明显受到限制。此
外，感染患者往往伴有并发疾病，给临床感染控制和治疗带来极大困难。

[0003] IMP型酶是获得性MBLs中非常常见的一种，属Bush分类3a亚群，能水解几乎所有β‑内酰胺类抗菌药物，其水解活性不被β‑内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦等抑
制，但碳青霉烯可被金属螯合物如EDTA、巯基化合物等抑制，在缺乏其他共存的耐药机制
时，产IMP型碳青霉烯酶的菌株仍对单环类抗菌药物（ATM等）敏感。

[0004] 实验室检测碳青霉烯酶的方法众多。主要包括改良Hodge试验、Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）、酶抑制剂增强
试验、免疫金标试验以及分子生物学方法等。免疫诊断试剂是体外诊断试剂中发展最快的
的细分领域，利用抗原与抗体之间的特异性结合进行定性或定量检测。

发明内容

[0005] 本发明提供一种抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。

[0006] 本发明采用的技术方案是：一种抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，命名为1AA4，保藏编号为CGMCC No.20288；或者命名为AH9，保藏编号为CGMCC No.20287。

[0007] 一种抗IMP型碳青霉烯酶抗体，命名为抗体1AA4，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区序列的CDR区中包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的三个序
列，重链可变区序列的CDR区中包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的三
个序列；

[0008] SEQ ID NO:1

[0009] RSSQSLLDSGGKTYLN（CDRL1）

[0010] SEQ ID NO:2

[0011] YLVSKL（CDRL2）

[0012] SEQ ID NO:3

[0013] FQYTHFPQCT（CDRL3）

[0014] SEQ ID NO:4

[0015] AASGFTFSDYYMY（CDRH1）

[0016] SEQ ID NO:5

[0017] VAIISDGGSYTYYPDSVKG（CDRH2）

[0018] SEQ ID NO:6

[0019] VRGSFDV

[0020] 或者，

[0021] 一种抗IMP型碳青霉烯酶抗体，命名为抗体AH9，轻链可变区序列的CDR区中包括如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的三个序列，重链可变区序列的CDR区中
包括如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的三个序列；

[0022] SEQ ID NO:11

[0023] KSSQSLLNSGHQKNYLA（CDRL1）

[0024] SEQ ID NO:12

[0025] YGASTRK（CDRL2）

[0026] SEQ ID NO:13

[0027] QNDHRYPLT（CDRL3）

[0028] SEQ ID NO:14

[0029] KASGYTFTDYNMD（CDRH1）

[0030] SEQ ID NO:15

[0031] IGDINPNYDSTRYNQKFKG（CDRH2）

[0032] SEQ ID NO:16

[0033] ARDGRYAMDY（CDRH3）

[0034] 优选地，抗体1AA4轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；

[0035] SEQ ID NO:7 轻链可变区氨基酸序列

[0036] DIVMTQSPLTLSVTLGQPASISCRSSQSLLDSGGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQYTHFPQCTFGGGTTLEIKRA

[0037] SEQ ID NO:9 重链可变区氨基酸序列

[0038] VQLVVSGGGLVNPDGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAIISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSGLRSEDTAMYYCVRGSFDVWGAGTTVTVSA

[0039] 或者，

[0040] 抗体AH9轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；

[0041] SEQ ID NO:17 轻链可变区氨基酸序列

[0042] DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTLTCKSSQSLLNSGHQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRKSGIPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHRYPLTFGAGTKLELKRA

[0043] SEQ ID NO:19 重链可变区氨基酸序列

[0044] VKLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNYDSTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARDGRYAMDYWGQGTSVTVSS

[0045] 优选地，由保藏编号为CGMCC No.20287和CGMCC No.20288的抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株产生。

[0046] 一种核酸分子，包含编码抗IMP型碳青霉烯酶抗体的核苷酸序列。

[0047] 优选地，核酸分子编码抗体1AA4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，核酸分子编码抗体1AA4的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

[0048] SEQ ID NO:8 轻链可变区碱基序列

[0049] GACATTGTCATGACCCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCCTTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGGTGGAAAGACATATTTGAATTGGTTTTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCC
AAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAG
ATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTGCTTCCAATATACACATTTTCCT
CAGTGTACGTTCGGAGGGGGGACCACGCTGGAAATCAAACGGGCT

[0050] SEQ ID NO:10 重链可变区碱基序列

[0051] GTGCAGTTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAACCCTGACGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCTAT
AATTAGTGATGGTGGTTCTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCA
AGAATAATTTGTACCTGCAAATGAGCGGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTGTAAGAGGGTCATTC
GATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGC

[0052] 或者，

[0053] 核酸分子编码抗体AH9的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，核酸分子编码抗体AH9的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；

[0054] SEQ ID NO:18 轻链可变区碱基序列

[0055] GACATTGTCATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTTTGACCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGACATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCC
TCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGATCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAA
CCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATCGTTAT
CCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGA

[0056] SEQ ID NO:20 重链可变区碱基序列

[0057] GTGAAGCTTCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGA
TATTAATCCTAACTATGATAGTACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCT
CCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGACGGCCGC
TATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCTTCA

[0058] 抗IMP型碳青霉烯酶抗体在检测IMP型碳青霉烯酶抗原中的应用。

[0059] 优选地，将抗IMP型碳青霉烯酶抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片，体外诊断试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免
疫试剂盒。

[0060] 优选地，制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，抗体1AA4为包被抗体，抗体AH9为金标抗体；或者，抗体AH9为包被抗体，抗体1AA4为金标抗体。

[0061] 本发明具有的优点和积极效果是：提供一种抗IMP型碳青霉烯酶抗体，能够用于检测IMP型碳青霉烯酶，效价达到了1:640000以上；将其制备成体外诊断试剂盒或微流体芯
片，能够用于耐药菌株的早期分型，指导用药，辅助临床感染控制和治疗。

附图说明

[0062] 图1是IMP型碳青霉烯酶蛋白电泳图；

[0063] 图2是抗IMP型碳青霉烯酶抗体蛋白电泳图；

[0064] 图3是胶体金法IMP型碳青霉烯酶检测卡检测结果。

[0065] 生物材料：1AA4，保藏日期为2020年8月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号是CGMCC No. 20288；

[0066] 生物材料：AH9，保藏日期为2020年8月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号是CGMCC No. 20287。

具体实施方式

[0067] 下面对本发明的实施例做出说明。

[0068] 本发明涉及抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，生物材料命名为1AA4，属杂交瘤细胞，其保藏编号是CGMCC No.20288；保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
中心，其保藏日期为2020年8月27日，检测为存活。另有一株抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞
株，生物材料命名为AH9，属杂交瘤细胞，其保藏编号是CGMCC No.20287；保藏地为中国微生
物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2020年8月27日，检测为存活。

[0069] 本发明涉及抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT‑PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗IMP型碳青霉烯酶抗体的杂交瘤细胞株及其
可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定。

[0070] 抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株生产的1AA4抗体，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区序列的CDR区中包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的三
个序列；

[0071] SEQ ID NO:1

[0072] RSSQSLLDSGGKTYLN（CDRL1）

[0073] SEQ ID NO:2

[0074] YLVSKL（CDRL2）

[0075] SEQ ID NO:3

[0076] FQYTHFPQCT（CDRL3）

[0077] 重链可变区序列的CDR区中包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的三个序列；

[0078] SEQ ID NO:4

[0079] AASGFTFSDYYMY（CDRH1）

[0080] SEQ ID NO:5

[0081] VAIISDGGSYTYYPDSVKG（CDRH2）

[0082] SEQ ID NO:6

[0083] VRGSFDV

[0084] 轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，

[0085] SEQ ID NO:7

[0086] DIVMTQSPLTLSVTLGQPASISCRSSQSLLDSGGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGIYYCFQYTHFPQCTFGGGTTLEIKRA

[0087] 重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；

[0088] SEQ ID NO:9

[0089] VQLVVSGGGLVNPDGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAIISDGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSGLRSEDTAMYYCVRGSFDVWGAGTTVTVSA

[0090] 编码抗IMP型碳青霉烯酶抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

[0091] SEQ ID NO:8

[0092] GACATTGTCATGACCCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCCTTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGGTGGAAAGACATATTTGAATTGGTTTTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCC
AAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAG
ATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTGCTTCCAATATACACATTTTCCT
CAGTGTACGTTCGGAGGGGGGACCACGCTGGAAATCAAACGGGCT

[0093] 编码抗IMP型碳青霉烯酶抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

[0094] SEQ ID NO:10

[0095] GTGCAGTTGGTGGTGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAACCCTGACGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCTAT
AATTAGTGATGGTGGTTCTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCA
AGAATAATTTGTACCTGCAAATGAGCGGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTGTAAGAGGGTCATTC
GATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGC

[0096] AH9抗IMP型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株生产的抗IMP型碳青霉烯酶抗体，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区序列的CDR区中包括如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和
SEQ ID NO:13所示的三个序列；

[0097] SEQ ID NO:11

[0098] KSSQSLLNSGHQKNYLA（CDRL1）

[0099] SEQ ID NO:12

[0100] YGASTRK（CDRL2）

[0101] SEQ ID NO:13

[0102] QNDHRYPLT（CDRL3）

[0103] 重链可变区序列的CDR区中包括如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的三个序列；

[0104] SEQ ID NO:14

[0105] KASGYTFTDYNMD（CDRH1）

[0106] SEQ ID NO:15

[0107] IGDINPNYDSTRYNQKFKG（CDRH2）

[0108] SEQ ID NO:16

[0109] ARDGRYAMDY（CDRH3）

[0110] 轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示；

[0111] SEQ ID NO:17 轻链可变区氨基酸序列

[0112] DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTLTCKSSQSLLNSGHQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRKSGIPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHRYPLTFGAGTKLELKRA

[0113] 重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；

[0114] SEQ ID NO:19 重链可变区氨基酸序列

[0115] VKLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNYDSTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARDGRYAMDYWGQGTSVTVSS

[0116] 编码抗IMP型碳青霉烯酶抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

[0117] SEQ ID NO:18

[0118] GACATTGTCATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTTTGACCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGACATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCC
TCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGATCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAA
CCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATCGTTAT
CCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGA

[0119] 编码抗IMP型碳青霉烯酶抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；

[0120] SEQ ID NO:20

[0121] GTGAAGCTTCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGA
TATTAATCCTAACTATGATAGTACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCT
CCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGACGGCCGC
TATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCTTCA

[0122] 1AA4杂交瘤细胞株和AH9杂交瘤细胞株所生产的抗IMP型碳青霉烯酶抗体可用于检测IMP型碳青霉烯酶抗原，抗IMP型碳青霉烯酶单克隆抗体在各方面均有较佳表现，从而
适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒，体外诊断试剂盒可为胶体金免疫试剂
盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒；又或者可将抗
IMP型碳青霉烯酶抗体制成微流体芯片，用于检测IMP型碳青霉烯酶抗原。

[0123] 开发胶体金法的IMP型碳青霉烯酶诊断试剂，首先需要提取产IMP型碳青霉烯酶的抗原，获得高纯度的抗原后，在小鼠体内激起良好的免疫反应，进而采用杂交瘤技术，筛选
高亲和力和特异性的抗体，用于相关体外诊断试剂的开发。本方案所涉及的两种抗体尤其
适合搭配制成双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，其中抗体1AA4为包被抗体，抗体AH9为金标
抗体，制得的双抗体夹心法免疫胶体金试纸条灵敏性更高，同时，也可将抗体1AA4做为金标
抗体，抗体AH9为包被抗体。下面通过具体实施例对本发明做出进一步说明。其中，未具体说
明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材
如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

[0124] 实施例1：抗IMP型碳青霉烯酶抗体的制备

[0125] 1.1 抗原制备

[0126] 从NCBI中获得IMP‑4型基因序列，进行全基因合成并连接到pet‑28a 载体上，将含有目的基因的载体质粒 pet‑28a‑ IMP‑4 转化到表达宿主Rosseta (DE3) 中，诱导条件为
当菌液OD值在0.4 0.6 之间时，加入IPTG 终浓度为1mM，37℃培养3小时，离心收集菌体，约
~
1g 菌体加入30mL PBS 重悬菌体后超声破碎，功率为400 W，超声3 s，间隔5 s，约30分钟
后，菌液不黏稠且澄清后，离心去掉菌体碎片，上清过0.45 μm 滤膜，上样到提前填好填料
并用平衡缓冲液平衡过的镍柱中，上样结束后进行咪唑浓度梯度洗脱，洗涤洗脱液咪唑浓
度依次为20 mM、50 mM、100 mM、150 mM、250 mM、500mM，当咪唑浓度为250mM 和500mM 洗脱
时可获得纯度较高目的蛋白，分子量和预计29.6kD相符，SDS‑PAGE见图1，用BCA法定量后分
装。

[0127] 1.2 小鼠免疫

[0128] 用纯化的IMP型碳青霉烯酶免疫6周龄左右的雌性Balb/c小鼠，进行抗体制备，蛋白含量为0.1mg/ml，按照免疫剂量分为2组，每组5只小鼠；按照蛋白含量计算，第一组免疫
剂量为25ug/只，第二组免疫剂量为50ug/只，首免，取适量IMP型碳青霉烯酶经蒸馏水稀释
至300ul，加入等量弗氏完全佐剂300ul乳化均匀，皮下多点注射免疫小鼠；两周后，取相同
剂量进行二免，二免为腹腔注射免疫小鼠，两周后再追加免疫一次，亦为腹腔注射免疫小
鼠，7天后鼠尾采血，ELISA测定小鼠血清效价。具体步骤为：IMP 0.2ug/ml，100ul/孔，4℃过
夜包被ELISA板，甩干，PBST洗涤3次。5%脱脂乳粉，200ul/孔，37℃封闭2h。小鼠鼠尾采血，
3000转/min，离心后收集血清，从1:1000开始用PBS进行倍比稀释至1:512000，备用。甩干，
PBST洗涤3次，1:1000倍起加入PBS稀释的一抗，100ul/孔，37℃，1h。甩干，PBST洗涤3次，加 
PBS 1:6000倍稀释的羊抗鼠二抗，100ul/孔，37℃，45min。甩干，PBST洗涤5次，加100ulTMB/
孔，37℃，显色10min，终止，读值。

[0129] 1.3 细胞融合

[0130] 融合前三天进行小鼠加强免疫，接种量同前次免疫，不加佐剂，腹腔注射。融合前一天准备饲养层细胞，取6‑8周龄小鼠Balb/c 1只，取眼球放血后颈椎脱位致死，放于75％
酒精中消毒5min，固定于盘上，在超净台中无菌剪开腹部皮肤。用无菌注射器吸取HAT选择
培养液10ml注入小鼠腹腔，用酒精棉球轻揉腹部，抽回培养基。加入40ml HAT培养液中，铺
入到4块96孔细胞培养板中，100μL/ 孔，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。融合前一周复苏
骨髓瘤细胞（Sp2/0细胞），用含10%胎牛血清的PRMI‑1640培养基培养，37℃，5％CO2培养箱
7
中传代培养。将处于对数生长期的细胞收集至离心管中，细胞计数，把细胞稀释为10个/ml
备用。取加强免疫3天的Balb/c小鼠，摘眼球放血制备阳性血清，脱颈椎处死，75％酒精消毒
5min，在超净工作台无菌取出脾脏，在无菌平皿中冼涤数次，剥离结缔组织。将脾脏放在微
孔铜网上，加入新鲜的RPMI‑1640培养液，先用注射器吸取培养液由脾脏一段注入，吹下脾
细胞，反复数次之后，用注射器的内塞轻轻将剩余脾脏研磨，直到无明显的红色组织块。将
平皿中脾细胞悬液轻轻吹打后转移到50ml离心管中，1000r/min离心5min，收集脾细胞，计
数后备用。将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞按细胞数量10:1混合，加入50ml的离心管内，
1000r/min离心5min，弃上清，在手心轻轻摩擦使两种细胞充分混匀，将离心管至于100mL蓝
盖瓶内，蓝盖瓶内装有37℃热水，将预热好的1ml DMSO/PEG在1min内逐滴加入融合管内，先
慢后快，边加边轻轻旋转离心管。然后立即加入无抗无血RPMI‑1640培养液终止反应，第一
分钟加1ml，第二分钟加2ml，第三分钟加3ml，第四分钟加4ml。37℃水浴5min，后800r/min离
心5min，弃上清，将沉淀以HAT悬起，混匀到40ml含37℃预热的20％小牛血清的HAT选择培养
液中，铺入已加有饲养细胞的96孔细胞板中，100μL/孔，将培养板放入37℃，5％CO2培养箱
培养。7d后将用新鲜的HAT培养基对细胞板半换液，10天后用HT培养基全换液。将96孔板中
检测阳性的细胞采用有限稀释法进行亚克隆：首先按照上述方法制备饲养层细胞，取待克
隆杂交瘤细胞进行细胞计数，用HT培养基将细胞稀释至5‑8个细胞/ml，加入到已铺饲养细
胞的96孔细胞板中100μL/孔，每株杂交瘤细胞克隆一块96孔细胞板，37℃、5％CO2细胞培养
箱中培养。约5天后数出细胞孔里的克隆数，标记，7天时并换新的培养基，待细胞铺满整个
孔底的1/3～1/2时检测。经过2‑3次克隆化，待96孔板所有细胞孔均为阳性时，即可进行扩
大培养，定株，冻存。将检测阳性确定定株的杂交瘤细胞扩大培养并冻存。具体过程如下：将
生长旺盛、状态良好的杂交瘤细胞用无抗无血DMEM轻轻从细胞瓶上吹下，1000 r/min离心
5min，弃去上清。加入冻存液（含40%RPMI‑1640培养液、50%胎牛血清、10%DMSO），将细胞吹散
后分装到细胞冻存管中。将冻存管放入冻存盒置于‑70℃冰箱中，一天后将冻存管转移入液
氮中，做好记录。

[0131] 1.4 腹水制备

[0132] 取10‑12周龄雌性Balb/c小鼠，腹腔注射无菌液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹腔注射6
培养至对数期的杂交瘤细胞，5×10个细胞/只。每天注意观察，约7‑10天，待小鼠腹部出现
明显隆起后，用75％酒精棉球消毒下腹部皮肤，用16号针头刺入腹腔，收集腹水。待腹水再
生积聚后，再次收集。将收集的腹水3000 r/min离心10min，取中间澄清部分，用滤纸过滤
后，分装，‑70℃保存。

[0133] 1.5 抗体纯化

[0134] 用Protein‑G柱子进行腹水纯化，步骤如下：取腹水2ml（n），10000g离心，取澄清部分，加入2ml（1:1）洗涤缓冲液，混匀，柱子用20%乙醇流尽后用8mL洗涤液平衡，样本过柱子，
流速为8S/滴沉，反复上样3次，然后用15mL洗涤缓冲液进行洗涤淀，流速为8S/滴沉，洗涤完
毕后用10mL的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱完毕会用1M Tris PH=9调PH至7.4，然后用浓缩注
进行浓缩，于50kd透析袋，PBS，4℃透析过夜。获得1AA4抗体和AH9抗体。

[0135] 实施例2：抗IMP型碳青霉烯酶抗体的鉴定

[0136] 2.1抗体亚类鉴定

[0137] 按照SIGMA试剂盒说明书，以捕获ELISA的方法进行单抗的亚类鉴定，具体如下：

[0138] 将单抗亚类鉴定试剂1:1000稀释后，加入酶标孔中，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗三次，拍干；将抗体1:1000倍稀释后加样，100 μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗三次，拍干；HRP
酶标羊抗鼠IgG二抗以1:6000稀释后加样， 100μL/孔，室温孵育30min；显色10～20min。以
OD450读值明显高于其他孔所加亚类试剂为单抗所属亚类类型。鉴定1AA4抗体和AH9抗体的
抗体亚型为IgG1。

[0139] 2.2抗体效价测定

[0140] 采用间接ELISA法进行纯化后抗体效价测定，步骤如下：IMP‑4碳青霉烯酶分别稀释至0.2ug/mL，100ul/孔，同时设立不包被对照，4℃过夜包被，甩干，PBST洗涤3次；5%脱脂
乳粉，200ul/孔，37度封闭2h；甩干，PBST洗涤3次，加入从1:1000倍开始进行倍比稀释的抗
体（浓度为1mg/ml），共计12个梯度，同时设立不包被对照100ul/孔， 37℃，1h。甩干，PBST洗
涤3次,加 PBS 1:6000倍稀释的羊抗鼠二抗，100ul/孔，37℃，45min。甩干，PBST洗涤5次,加
100ulTMB/孔，37℃，显色10min，终止，读值。纯化后抗体稀释至1mg/ml，两组抗体效价均能
够达到1:640000以上。

[0141] 2.3 抗体纯度及分子量鉴定

[0142] 采用SDS‑PAGE法进行抗体分子量及纯度鉴定；制胶，分离胶为12%，浓缩胶为5%；制样，20ul样品+20ul buffer，混匀，煮沸3min；每孔上样20ul，同时设立蛋白预染Marker对
照； 80伏30min，120伏2h；电泳完毕后，放入考马斯亮蓝溶液进行染色；脱色，去离子水煮沸
脱色，每次5min，共计3次；纯化后的单克隆抗体经SDS‑PAGE鉴定，条带清晰，无杂带，如图2
所示，两组抗体在50KDa和25KDa处各有清晰的条带。

[0143] 实施例3：抗IMP型碳青霉烯酶抗体的基因验证

[0144] 通过RT‑PCR法克隆Ig可变区基因。提取总RNA，合成单链cDNA，用Trizol法（试剂盒购自Invitrogen）分别提取1AA4和AH9杂交瘤细胞株的总RNA，用M‑MLV逆转录酶（购自
Invitrogen）将总RNA逆转为cDNA文库。

[0145] 重链骨架区上游引物

[0146] P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’

[0147] 重链可变区下游引物

[0148] P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’

[0149] 轻链前导肽上游引物

[0150] P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’

[0151] 轻链可变区下游引物

[0152] P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’

[0153] 配制PCR反应体系（50μl）如下：

[0154] cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfu DNA聚合酶(5U/μl):1μl；10 X pfu Buffer Ⅱ:5μl；ddH2O:补足至50μl。

[0155] 反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。

[0156] 琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19‑T (simple)载体（Takara公司）进行连接，连接体系如下：

[0157] VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，

[0158] pMD19‑T(simple) 载体1μl，

[0159] Solution I连接反应液5μl；

[0160] ddH2O补足至10μl，

[0161] 4℃连接过夜。

[0162] 连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系（25μl）如
下：

[0163] 菌液：1μl，

[0164] 上游引物(10μM)：1μl；

[0165] 下游引物(10 μM) ：1μl；

[0166] dNTP Mixture (各2.5 Mm) 2 μl；

[0167] Taq DNA聚合酶 (5U/μl)：0.5 μl；

[0168] 10×Taq Buffer (Mg2+ plus)：2.5 μl；

[0169] 补水至25μl。

[0170] 反应条件同前。

[0171] 选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒（Takara公司）提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为
止。成功克隆得到抗体1AA4、AH9的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列
特征。

[0172] 实施例4：IMP型碳青霉烯酶检测试剂盒的制备

[0173] 使用胶体金法制备IMP型碳青霉烯酶测卡，制备双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，制备方法如下：

[0174] 步骤一向胶体金溶液中边搅拌边加入0.1M K2CO3溶液，调节pH值后加入抗IMP型碳青霉烯酶单克隆抗体AH9，搅拌后加入10%的牛血清白蛋白溶液，2%PEG20000，搅拌后低速离
心取上清，再高速离心后取沉淀，用胶体金重悬液定容形成金标抗体；

[0175] 步骤二将金标抗体喷于玻璃纤维素膜，烘干制成金标垫；

[0176] 步骤三向抗IMP型碳青霉烯酶单克隆抗体1AA4中加入1%的硫柳汞钠溶液，混匀后形成检测线包被液，再向羊抗鼠IgG中加入PBS和1%的硫柳汞钠溶液，混匀后形成质控线包
被液，将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜上，烘干后获得包被膜；

[0177] 步骤四将包被膜贴在底板上，将金标垫和吸水纸搭上包被膜，层压后切割获得胶体金法IMP型碳青霉烯酶检测卡。

[0178] 取通过上述方法制备得到的胶体金法IMP型碳青霉烯酶检测卡，分别取空白样、IMP型碳青霉烯酶和IMP型碳青霉烯酶阳性样本点样于检测卡。结果如图3所示，从左到右依
次为空白样、IMP型碳青霉烯酶和IMP型碳青霉烯酶阳性样本，能够看出，空白样点样的检测
卡检测结果呈阴性，IMP型碳青霉烯酶和IMP型碳青霉烯酶阳性样本点样结果均为阳性，证
明通过本方案制备得到的胶体金法IMP型碳青霉烯酶检测卡能够检测IMP型碳青霉烯酶及
相应阳性样本。

[0179] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，
均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。