IL21R基因人源化非人动物及其构建方法和应用

摘要

本发明提供了一种IL21R基因人源化改造的非人动物的构建方法、一种人源化IL21R蛋白、一种人源化IL21R基因、一种IL21R基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将部分编码人IL21R蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该非人动物体内能正常表达人源化IL21R蛋白，可以用于人IL21R信号机理研究、炎症、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

权利要求

1.一种IL21R基因人源化改造的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的构建方法包括用SEQ ID NO：5所示核苷酸序列替换至非人动物IL21R基因座上，所述的替换至非人动物IL21R基因座为替换非人动物IL21R基因中编码SEQ ID NO：1第24至211位的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在非人动物体内通过内源调控元件进行调控，所述的非人动物的内源IL21R蛋白表达降低或缺失，所述的非人动物体内表达人源化IL21R蛋白，所述的人源化IL21R蛋白包括人IL21R蛋白的胞外区，所述的人源化IL21R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述的非人动物为小鼠。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂和3’臂，所述的5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：

4所示。

3.权利要求1‑2任一构建方法构建的非人动物在IL21R基因或蛋白相关研究中的应用，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法，所述的应用包括：A）涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造或筛选人类抗体中的应用；

B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；

C）涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究中的应用；

D）在体内研究人IL21R信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价；或者，

E）研究IL21R基因功能，研究人IL21R抗体，研究针对人IL21R靶位点的药物、药效，研究免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或炎症药物方面的用途。

说明书

IL21R基因人源化非人动物及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IL21R基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

[0002] IL21R全名是interleukin 21 receptor。它是一种I型跨膜受体蛋白，主要表达在脾、胸腺、淋巴结及外周血液淋巴细胞。IL21R是由IL‑21R亚单位和γc组成的复合物, 其中
IL‑21R亚单位为配体识别结合部位，γc为信号传导单位。IL‑21R具有广泛的生物学功能，
在结合其配体IL‑21后，通过激活JAKs‑STATs信号通路，刺激T细胞和NK细胞增殖、调节B细
胞和树突状细胞存活和分化，从而参与机体的固有免疫和适应性免疫。作为新型的免疫调
节因子，IL‑21R及其配体参与了多种自身免疫性疾病的发生发展，通过调节IL‑21R的表达
水平或阻断其信号传导通路为自身免疫性疾病及其他相关疾病的治疗提供了新的研究方
向。

[0003] 随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因
人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基
因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但
本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模
型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为
仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选
提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因（即遗传因
子）的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战
（Scheer N, Snaith M, Wolf CR,  Seibler J. Generation and utility  of 
genetically humanized mouse models, Drug Discov Today; 18(23‑24):1200‑11, 
2013）。

[0004] 目前关于IL21R基因的动物模型主要为基因敲除鼠，而且主要用于肿瘤相关疾病机制研究。鉴于IL21R在肿瘤、自身免疫性疾病等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶
向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领
域仍急需开发人源化IL21R信号通路相关的非人动物模型。

发明内容

[0005] 本发明的第一方面，提供了一种IL21R基因人源化改造的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包括编码SEQ ID NO：2第24至211位氨基酸的核苷酸序列，所述的
构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2第24至211位氨基酸的核苷酸序列替换至非人动物
IL21R基因座。

[0006] 优选的，所述的非人动物的基因组中包括SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列替换至非人动物IL21R基因座。

[0007] 优选的，所述的插入或替换至非人动物IL21R基因座为插入或替换非人动物IL21R基因中编码SEQ ID NO：1第24至211位的核苷酸序列，或者插入或替换SEQ ID NO：24所示序
列相同的核苷酸序列。

[0008] 优选的，所述的构建方法包括插入、翻转、敲除或替换。

[0009] 优选的，所述的非人动物的基因组中包含人IL21R核苷酸序列的3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，进一步优选的，包含3‑4号内含子和/或5‑6
号内含子，更优选的，包含3‑6号外显子之间的任一内含子；其中，所述人IL21R核苷酸序列
的3号外显子的部分至少包含从编码人IL21R蛋白胞外区N端1‑5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸
的核苷酸序列开始至3号外显子最后1个核苷酸序列为止，6号外显子的部分至少包含从6号
外显子第一个核苷酸开始至6号外显子编码的氨基酸C端1‑20（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）个氨基酸的核苷酸序列为止。

[0010] 优选的，所述的构建方法包括用包含人IL21R核苷酸序列的3号至6号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换到非人动物IL21R基因座上，进一步优选的，用包含人
IL21R核苷酸序列的3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分核苷酸
序列插入或替换到非人动物IL21R基因座上，更优选的，包含3‑4号内含子和/或5‑6号内含
子，更进一步优选的，包含3‑6号外显子之间的任一内含子；其中，所述人IL21R基因的3号外
显子的部分至少包含从编码人IL21R蛋白胞外区N端1‑5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷
酸序列开始至3号外显子最后1个核苷酸序列为止，6号外显子的部分至少包含从6号外显子
第一个核苷酸开始至6号外显子编码的氨基酸C端1‑20（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20）个氨基酸的核苷酸序列为止。

[0011] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2第24至211位氨基酸的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列替换至非人动物
IL21R基因的相应区域。

[0012] 优选的，所述的构建方法包括用包含人IL21R核苷酸序列的3号至6号外显子全部或部分替换非人动物IL21R核苷酸序列的3号至6号外显子的全部或部分；其中，所述非人动
物IL21R核苷酸序列包含编码非人动物3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部、6号外显
子的部分核苷酸序列，优选的，包含3‑4号内含子和/或5‑6号内含子，进一步优选的，包含3‑
6号外显子之间的任一内含子，其中，所述非人动物IL21R核苷酸序列的3号外显子的部分至
少包含从编码IL21R蛋白胞外区N端1‑5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列开始至3号
外显子最后1个核苷酸为止，6号外显子的部分至少包含从6号外显子第一个核苷酸开始至6
号外显子编码的氨基酸C端1‑20（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20）个氨基酸的核苷酸序列为止。

[0013] 优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化IL21R基因的核苷酸序列插入或替换到非人动物IL21R基因座上。

[0014] 优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述人源化IL21R蛋白的核苷酸序列插入或替换到非人动物IL21R基因座上。

[0015] 优选的，所述的插入或替换位点为IL21R基因的内源调控元件之后。

[0016] 优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源IL21R基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可在内源IL21R基因处造成移码突变又可以实现插入人源序
列的步骤。

[0017] 优选的，所述的非人动物中人源化IL21R基因是纯合或杂合的。

[0018] 优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化IL21R基因。

[0019] 优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化IL21R蛋白。

[0020] 优选的，使用基因编辑技术进行IL21R基因人源化改造的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、
转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

[0021] 本发明所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

[0022] 优选的，使用靶向载体进行IL21R基因人源化改造的非人动物的构建，所述靶向载体包含编码SEQ ID NO：2第24至211位氨基酸的核苷酸序列或SEQ ID NO：5所示核苷酸序
列，任选地，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，和/或，
所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，进一步优选的，所
述的5’臂选自非人动物IL21R基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸；优选的，所述的
5’臂与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂
序列与SEQ ID NO：3至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂选
自非人动物IL21R基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI
登录号为NC_000073.7至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ 
ID NO：4至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO：4所示。

[0023] 优选的，所述的靶向载体包含人IL21R的3号至6号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外显子的部分，更
优选的，包含3‑4号内含子和/或5‑6号内含子，更进一步优选的，包含3‑6号外显子之间的任
一内含子，其中，所述人IL21R的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从编码人IL21R蛋
白胞外区N端1‑5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列开始至3号外显子最后一个核苷
酸为止，6号外显子的部分至少包含从6号外显子第一个核苷酸开始至6号外显子编码的氨
基酸C端1‑20（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）个氨基酸的
核苷酸序列为止。

[0024] 优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL21R基因座上。进一步优选的，位于非人动物IL21R基因的3号外显子至6号外显子上。

[0025] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞（优选为胚胎干细胞），然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物
输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得非人动物。

[0026] 优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL21R蛋白,所述的人源化IL21R蛋白包含人IL21R蛋白的胞外区，任选地，包含与SEQ ID NO：2第24至211位或SEQ ID NO：23具
有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：2第24
至211位或SEQ ID NO：23所示氨基酸序列一致的氨基酸序列，同时内源IL21R蛋白的表达降
低或缺失。

[0027] 优选的，所述的人源化IL21R蛋白包含人IL21R蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含胞外区的部分，更优选的，所述的胞外区的部分包含N端去除0‑5（例如1、2、
3、4、5）个氨基酸和/或C端去除0‑25（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25）个氨基酸的人IL21R蛋白胞外区。

[0028] 优选的，所述的人源化IL21R蛋白还包含非人动物IL21R蛋白的部分，优选为非人动物IL21R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区。

[0029] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL21R蛋白包含下列组中的一种：

[0030] a）SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示氨基酸序列的部分或全部；

[0031] b）与SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；

[0032] c）与SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

[0033] d）具有SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

[0034] 优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL21R基因，所述的人源化IL21R基因编码人源化IL21R蛋白。

[0035] 优选的，所述的人源化IL21R基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列,进一步优选的，所述的非人动物中包含的IL21R基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸
序列。

[0036] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL21R基因包含下列组中的一种：

[0037] a）人源化IL21R基因的mRNA序列为SEQ ID NO：8所示的序列的部分或全部；

[0038] b）人源化IL21R基因的mRNA序列与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；

[0039] c）人源化IL21R基因的mRNA序列与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

[0040] d）人源化IL21R基因的mRNA序列具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

[0041] 本发明的第二方面，提供了一种IL21R基因人源化改造的非人动物，所述的非人动物采用上述构建方法获得。

[0042] 本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人IL21R核苷酸序列的部分，优选的，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：2第24至211位氨基酸的核苷酸序
列或者SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，任选地，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’
端同源的DNA片段，即5’臂，和/或，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的
DNA片段，即3’臂，优选的，所述的5’臂选自非人动物IL21R基因基因组DNA的100‑10000个长
度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90%同源性的核苷
酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：3至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO：3
所示；优选的，所述的3’臂选自非人动物IL21R基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷
酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90%同源性的核苷酸；进一步
优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：4至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO：4所示。

[0043] 优选的，所述的人IL21R核苷酸序列的部分包含人IL21R的3号至6号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号至5号外显子的全部和6号外
显子的部分，更优选的，包含3‑4号内含子和/或5‑6号内含子，更进一步优选的，包含3‑6号
外显子之间的任一内含子，其中，所述人IL21R的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含
从编码人IL21R蛋白胞外区N端1‑5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序列开始至3号外显
子最后一个核苷酸为止，6号外显子的部分至少包含从6号外显子第一个核苷酸开始至6号
外显子编码的氨基酸C端1‑20（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20）个氨基酸的核苷酸序列为止。

[0044] 优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL21R基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IL21R基因3号至6号外显子上。

[0045] 本发明所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

[0046] 优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基
因（DTA）。

[0047] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

[0048] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，所述的
特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

[0049] 本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。

[0050] 本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在IL21R基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于翻转、敲除、插入或替换。

[0051] 本发明的第六方面，涉及一种IL21R基因改造的人源化细胞，所述的人源化IL21R基因改造细胞的基因组中包括人IL21R基因的3号外显子至6号外显子。优选的，所述的人
IL21R基因编码SEQ ID NO：2第24至211位氨基酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO：5所示核
苷酸序列，其通过内源性IL21R调控元件调控；该人源化IL21R基因改造细胞体内表达人或
人源化IL21R蛋白，同时内源IL21R蛋白的表达降低或缺失。优选的，所述的人IL21R基因通
过内源性IL21R调控元件调控。

[0052] 本发明的第七方面，涉及一种IL21R基因缺失的细胞，所述的IL21R基因缺失的细胞缺失内源IL21R基因的3号外显子至6号外显子。

[0053] 本发明的第八方面，涉及一种荷瘤动物模型的制备方法，所述的动物模型的制备方法包括通过上述的人源化IL21R基因改造非人动物制备荷瘤动物模型的步骤。

[0054] 优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述人源化基因改造非人动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。

[0055] 本发明的第九方面，提供了一种上述的制备方法获得的荷瘤动物模型。

[0056] 本发明的第十方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物或上述的荷瘤动物模型。

[0057] 本发明的第十一方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物或上述的荷瘤动物模型。

[0058] 优选的，所述的组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。

[0059] 本发明的第十二方面，提供了一种人源化IL21R蛋白，所述的人源化IL21R蛋白包含人IL21R蛋白的全部或部分，所述的人源化IL21R蛋白包含人IL21R蛋白的胞外区，任选
地，包含与SEQ ID NO：2第24至211位或SEQ ID NO：23具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至
少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：2第24至211位或SEQ ID NO：23所示氨基
酸序列一致的氨基酸序列。

[0060] 优选的，所述的人源化IL21R蛋白包含人IL21R蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含胞外区的部分，更优选的，所述的胞外区的部分包含N端去除0‑5（例如1、2、
3、4、5）个氨基酸和/或C端去除0‑25（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25）个氨基酸的人IL21R蛋白胞外区。

[0061] 优选的，所述的人源化IL21R蛋白还包含非人动物IL21R蛋白的部分，优选为非人动物IL21R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区、胞质区。

[0062] 优选的，所述的人源化IL21R蛋白包含人IL21R基因的3号外显子至6号外显子编码的氨基酸序列，和非人动物IL21R蛋白的氨基酸序列。

[0063] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL21R蛋白包含下列组中的一种：

[0064] a）SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示氨基酸序列的部分或全部；

[0065] b）与SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；

[0066] c）与SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

[0067] d）具有SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：2第24至211位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

[0068] 本发明的第十三方面，提供了一种编码上述人源化IL21R蛋白的人源化IL21R基因，所述的人源化IL21R基因包含人IL21R基因的3号外显子至6号外显子，和非人动物IL21R
基因的核苷酸序列。

[0069] 优选的，所述的人源化IL21R基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

[0070] 优选的，所述的人源化IL21R基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

[0071] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL21R基因中包含的人IL21R核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：

[0072] （A）包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

[0073] （B）包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列；

[0074] （C）包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；

[0075] （D）具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

[0076] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL21R基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：

[0077] （a）包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的全部或部分；

[0078] （b）包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列；

[0079] （c）包含与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或

[0080] （d）包含SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

[0081] 本发明的第十四方面，涉及一种表达上述的人源化IL21R蛋白的构建体。

[0082] 本发明的第十五方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。

[0083] 本发明的第十六方面，涉及一种包含上述细胞的组织。

[0084] 本发明的第十七方面，涉及了一种上述的非人动物、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化IL21R蛋白
或上述的人源化IL21R基因在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

[0085] 本发明的第十八方面，涉及一种上述的非人动物、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化IL21R蛋白或
上述的人源化IL21R基因在IL21R基因或蛋白中相关研究中的应用，所述的应用包括：

[0086] A）涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造或筛选人类抗体中的应用；

[0087] B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；

[0088] C）涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究、用于开发诊断策略或用于开发治疗策略中的应用；

[0089] D）在体内研究人IL21R信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价；或者，

[0090] E）研究IL21R基因功能，研究人IL21R抗体，研究针对人IL21R靶位点的药物、药效，研究免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或炎症药物方面的用途。

[0091] 优选的，所述应用包括在制备药物组合物或者检测试剂盒中的用途。

[0092] 优选的，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法。

[0093] 本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃
癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、
头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。
其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性
白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所
述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、
滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋
白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂
肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤
选自B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括B或T细胞急性淋巴细胞白血病
(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)、鼻咽癌、肺
癌。

[0094] 本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免
疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的
一个具体实施方式中。所述的免疫相关疾病为类风湿性关节炎。

[0095] 本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）、增
生性炎症、特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。

[0096] 本发明所述的IL21R基因人源化的非人动物体内可以正常表达人或人源化IL21R蛋白。可用于针对人IL21R靶位点的药物筛选、药效评估、免疫相关疾病和肿瘤治疗，可以加
快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究IL21R蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有
效的保障。

[0097] 本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

[0098] 本发明所述的“人源化IL21R蛋白”，包含来源于人IL21R蛋白的部分和非人IL21R蛋白的部分。其中，所述的“人IL21R蛋白”同“人IL21R蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人
IL21R蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人IL21R蛋白的部分”，为连续或间隔的5‑538个
（优选为10‑188个）氨基酸序列与人IL21R蛋白的氨基酸序列一致或与人IL21R蛋白的氨基
酸序列具有70%以上同源性。

[0099] 本发明所述的“人IL21R蛋白的胞外区的全部”，代表其氨基酸序列分别与人IL21R蛋白的胞外区的全长氨基酸序列一致。

[0100] 本发明所述的“人IL21R蛋白的胞外区的部分”，为连续或间隔5‑213个（优选为5‑188个）氨基酸序列与人IL21R蛋白的胞外区氨基酸序列一致，或与人IL21R蛋白的胞外区氨
基酸序列具有70%以上同源性。

[0101] 本发明所述的“人源化IL21R基因”，包含来源于人IL21R核苷酸序列的部分和非人IL21R基因的部分。其中，所述的“人IL21R核苷酸序列”同“人IL21R核苷酸序列的全部”，即
其核苷酸序列与人IL21R核苷酸序列的全长核苷酸序列一致。所述的“人IL21R核苷酸序列
的部分”为连续或间隔的20‑49882bp（优选为20‑10301bp或20‑564bp）个核苷酸序列与人
IL21R核苷酸序列一致或与人IL21R核苷酸序列具有70%以上同源性。

[0102] 本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“3号至6号外显子”包含3号外显子、3‑4号内
含子、4号外显子、4‑5号内含子、5号外显子、5‑6号内含子、6号外显子的全部核苷酸序列。

[0103] 本发明所述的“x‑xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“3‑4号内含子”表示3号外显子与4号外显子之间的内含子。

[0104] 本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人IL21R核苷酸序列的3号外显子的部分，包含连续
或间隔的5‑103bp个，优选10‑83bp个核苷酸序列与人IL21R核苷酸序列的3号外显子核苷酸
序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化IL21R基因”中包含的“3号外显
子的部分”至少包括从3号外显子编码胞外区N端1‑5（例如1、2、3、4、5）个氨基酸的核苷酸序
列开始至3号外显子的最后一个核苷酸序列为止。

[0105] 本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的
“IL21R基因座”表示IL21R基因1号至9号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为1号外显
子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子、9号
外显子或其期间的内含子中的任一个或两个或多个的组合，或一个或两个或多个的全部或
部分，更优选为IL21R基因的3号至6号外显子上。

[0106] 本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre‑mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、
sgRNA、tRNA。

[0107] 本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重
性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗
（treating）”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干
预。

[0108] 本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有
（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，
19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，
38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，
57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，
94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%
的同一性。

[0109] 本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

[0110] 在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在
一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物
选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科（例如小鼠样仓
鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠
毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如
多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述
基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方
式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。
在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物
是小鼠。

[0111] 在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、
NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、
C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、
CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

[0112] 除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解
释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，
FritschandManiatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，
Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gaited.，
1984)；Mullisetal. U.S. Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization 
(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation (B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical 
Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY (J.Abelson 
and M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols. 154 
and 155 (Wuetal.eds.) and Vol.185，″Gene Expression Technology″ (D.Goeddel，
ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Caloseds.，
1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And 
Molecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook 
Of Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；
and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold 
Spring Harbor，N.Y.，1986)。

[0113] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

[0114] 本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

[0115] 下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

[0116] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

[0117] 图1：人和小鼠IL21R基因结构对比示意图（非按比例）；

[0118] 图2：人源化IL21R基因座示意图（非按比例）；

[0119] 图3：IL21R基因打靶策略示意图（非按比例）

[0120] 图4：重组后ES细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照；

[0121] 图5：人源化IL21R小鼠FRT重组过程示意图（非按比例）

[0122] 图6：F1代小鼠PCR结果，其中WT为野生型对照，H2O为水对照，PC为阳性对照；

[0123] 图7：人IL21R和鼠IL21R的流式检测结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IL21R人源化纯合子小鼠。

具体实施方式

[0124] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人
员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进
行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0125] 在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

[0126] PerCP/Cy5.5 anti‑mouse TCR β chainAntibody购自Biolegend，货号：553174；

[0127] Brilliant Violet 510™ anti‑mouse CD45Antibody购自Biolegend，货号：103138；

[0128] PE anti‑mouse IL‑21R Antibody购自Biolegend，货号：131905；

[0129] APC anti‑human CD360 (IL‑21R) Antibody购自Biolegend，货号：347807；

[0130] FITC anti‑Mouse CD19Antibody购自Biolegend，货号：115506；

[0131] Zombie NIR™ Fixable Viability Kit购自Biolegend，货号：423106；

[0132] PE Rat IgG2b, k isotype CtrlAntibody购自Biolegend，货号：101302。

[0133] 实施例1 IL21R基因人源化小鼠的制备

[0134] 本实施例对非人动物（如小鼠）进行改造，使该非人动物体内包含编码人源化IL21R蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人源化IL21R蛋白。小鼠
IL21R基因（NCBI Gene ID：60504，Primary source：MGI:1890475，UniProt ID：Q9JHX3，位
于7号染色体NC_000073.7的第125202424位至第125232742位，基于转录本NM_021887.2及
其编码蛋白NP_ 068687.1（SEQ ID NO：1））和人IL21R基因（NCBI Gene ID：50615，Primary 
source：HGNC：6006，UniProt ID：Q9HBE5，位于16号染色体NC_000073.7的第27402162‑ 
27452043位，基于转录本NM_181078.3及其编码蛋白NP_851564.1（SEQ ID NO：2））。对比示
意图如图1所示。

[0135] 为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL21R基因座引入编码人IL21R蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL21R蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内
源IL21R基因座上用人IL21R基因的核苷酸序列（例如DNA序列、cDNA序列等）替换小鼠相应
序列，如将至少包含小鼠IL21R基因的3号外显子的部分序列至6号外显子的部分序列用对
应的人DNA序列替换，得到人源化IL21R基因座（示意图如图2所示），实现对小鼠IL21R基因
的人源化改造。

[0136] 进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠IL21R基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人IL21RDNA序列的A片段。其中，上游同源臂序列
（5’同源臂，SEQ ID NO：3）与NCBI登录号为NC_000073.7第125219443至125224456位核苷酸
序列相同，下游同源臂序列（3’同源臂，SEQ ID NO：4）与NCBI登录号为NC_000073.7第
125230780至125235238位核苷酸序列相同；人IL21R DNA序列（SEQ ID NO：5）与NCBI登录号
为NC_000016.10的第27434367至27444667位核苷酸序列相同。

[0137] 靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo
盒（Neo cassette）。其中，Neo盒5’端与鼠的连接设计为5’‑tctagctcaagaccacacagctaagg
agtgactccaggtcaGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGGTCT‑3’（SEQ 
ID NO：6），其中，序列“caggtca”的最后一个“a”是鼠的最后一个核苷酸，序列“GATATC”的第
一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠的连接设计为5’‑CTCTAGAAAGTATAGGAAC
TTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCGATATCggggtagagagatgtagtggttctgagatgttctacgggg
tgatctctgccaat‑3’（SEQ ID NO：7）内，其中序列“GATATC”的“C”是Neo盒的最后一个核苷
酸，序列“ggggta”的第一个“g”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构
建了具有负筛选标记的编码基因（白喉毒素A亚基的编码基因（DTA））。改造后的人源化小鼠
IL21R的mRNA序列如SEQ ID NO：8所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：23所示。

[0138] 靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入
C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用
PCR（PCR引物详见表1）和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正
确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot（分别用BglII或SacI或
AseI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表2所示）检测，
Southern Blot检测结果如图4所示，表明6个经PCR验证为阳性的胚胎干细胞（ES‑01、ES‑
02、ES‑03、ES‑04、ES‑05和ES‑06）均为阳性的克隆，且无随机插入。

[0139] 表1 PCR检测引物序列及目的片段长度

[0140]

[0141] 表2 Southern Blot酶和探针表

[0142]

[0143] Southern Blot检测包括如下探针引物：

[0144] 5’探针（5’Probe）：

[0145] 5’Probe‑F：5’‑TGTGCCTATGACTGTTGCAGGTGTT ‑3’（SEQ ID NO：13），

[0146] 5’Probe‑R：5’‑ CCTCGCTATCCTAACATGCCAGCTC‑3’（SEQ ID NO：14）；

[0147] 3’探针（3’Probe）：

[0148] 3’Probe‑F：5’‑ AATGAATAGGGTGTGCAGGGTGCAT‑3’（SEQ ID NO：15），

[0149] 3’Probe‑R：5’‑GCAGCATCCCCACAGAGAGAAACTA‑3’（SEQ ID NO：16）；

[0150] Neo探针（Neo Probe）：

[0151] Neo Probe‑F：5’‑GGATCGGCCATTGAACAAGAT ‑3’（SEQ ID NO：17），

[0152] Neo Probe‑R：5’‑CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC ‑3’（SEQ ID NO：18）。

[0153] 将筛选出的正确阳性克隆细胞（黑色鼠）按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中（白色鼠），得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠（白色鼠）的
输卵管，可生产F0代嵌合体鼠（黑白相间）。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将
F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性
克隆筛选标记基因（该过程示意图见图5）后，再通过互相交配即可得到人源化IL21R基因纯
合子小鼠。示例性的F1代小鼠鉴定结果见图6，其中，编号为F1‑01至F1‑06的小鼠均为阳性
杂合小鼠，PCR测定引物如表3所示。

[0154] 表3 PCR检测引物序列及目的片段长度

[0155]

[0156] 进一步采用流式细胞术检测IL21R基因人源化小鼠体内IL21R蛋白的表达情况。选取9周龄野生型C57BL/6小鼠和IL21R基因人源化纯合子小鼠各1只，取脾脏细胞，用抗鼠
CD45抗体Brilliant Violet 510™ anti‑mouse CD45Antibody、鼠源T细胞表面抗体
PerCP/Cy5.5 anti‑mouse TCR β chain、抗鼠IL21R抗体anti‑mouse IL‑21R Antibody, 
PE, Biolegend™（mIL21R‑PE）、( 以PE大鼠抗体IgG2a同型对照抗体Rat IgG2a, κ 
Isotype Ctrl Antibody, PE, Biolegend™（IgG2a）抗体作参照)，抗鼠CD19抗体FITC 
anti‑Mouse CD19和抗人CD360抗体anti‑human CD360  (IL‑21R) Antibody ，APC，
Biolegend™（hIL21R‑APC）（以鼠抗体Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody，APC，
Biolegend™为参照）进行染色，将染色后的细胞进行流式检测，hIL21R在B细胞中的检测结
果如图7所示，在生理状态下的野生C57BL/6小鼠（WT）B细胞中只检测到鼠IL21R蛋白，纯合
鼠（H/H，Homozygote）B细胞中只检测到人源化IL21R蛋白。以上表明本实施例成功构建出可
表达人源化IL21R蛋白的IL21R基因人源化小鼠。

[0157] 实施例2 体内药效验证

[0158] 利用本方法制得的IL21R人源化小鼠可以用于评估靶向人IL21R的调节剂的药效。例如，取IL21R人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约
3
100mm 后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人IL21R的药物X、Y、Z
等，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，可通过比较小鼠
体重变化和肿瘤大小即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。

[0159] 实施例3双基因或多基因人源化小鼠

[0160] 利用本方法或制得的IL21R基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD‑1、
PD‑L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化IL21R小
鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得IL21R与其它基因修饰
的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的IL21R小鼠纯合子或杂合子与其
它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机
率得到IL21R基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交
配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行
靶向人IL21R和其它基因调节剂的体内药效验证等。

[0161] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这
些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0162] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可
能的组合方式不再另行说明。

[0163] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。