一种纳米等离子共振芯片增强等温扩增核酸荧光检测方法

摘要

本发明涉及一种纳米等离子共振芯片增强等温扩增核酸荧光检测方法。具体而言，本发明涉及一种使用纳米等离子共振芯片对目标核酸进行等温扩增核酸荧光检测的方法。本发明还涉及一种用于检测目标核酸的等温扩增核酸荧光检测试剂盒。实施本发明可以有效提高核酸扩增速度和检测灵敏度，核酸检测下限达到或超过常规PCR核酸检测水平，可以在便携式仪器上实现快速高通量高灵敏度核酸检测。

权利要求

1.一种使用纳米等离子共振芯片对目标核酸进行等温扩增核酸荧光检测的方法，所述方法按顺序包括以下步骤：

(1)将用于扩增目标核酸的5’修饰SH的正向引物固定于纳米等离子共振芯片的表面，其中所述纳米等离子共振芯片具有金原子表面，所述芯片表面的金原子可与5’修饰SH的正向引物的巯基‑SH通过Au‑S化学键结合，从而使正向引物附着在芯片表面；

(2)用封闭试剂对纳米等离子共振芯片的表面未结合所述5’修饰SH的正向引物的位点进行封闭；

(3)使等温扩增反应体系与所述纳米等离子共振芯片接触并进行等温扩增核酸荧光检测反应，其中所述等温扩增反应体系包含游离形式的用于扩增目标核酸的反向引物、目标核酸、用于实施等温扩增核酸荧光检测反应所需的聚合酶、重组酶、核酸外切酶以及单链DNA结合蛋白、和用于检测扩增子的荧光探针；和(4)使用荧光检测仪器对由步骤(3)的反应产生的荧光信号进行实时采集和记录，其中所述方法不是疾病诊断方法；所述目标核酸是新冠病毒的orf1ab基因，所述5’修饰SH的正向引物、反向引物和探针序列如下所示：

5’修饰SH的正向引物：

5’‑(SH C6) AAAAAAAAAATACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTG‑3’；

反向引物：

5’‑GGCATTAACAATGAATAATAAGAATCTACAACAGG‑3’；

探针序列：

5’TTGTTGGTGTACTGACATTAGATAATCAAGATC[FAM‑dT]C[THF]A[BHQ‑dT]GGTAACTGGTATGATTTCG‑磷酸‑3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭试剂是硫醇类化合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭试剂是6‑巯基‑1‑己醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述等温扩增反应体系是选自RPA和ERA的等温扩增反应体系。

5.一种用于检测目标核酸的等温扩增核酸荧光检测试剂盒，所述试剂盒包含(a) 纳米等离子共振芯片，其中所述纳米等离子共振芯片具有金原子表面，所述芯片表面的金原子可与5’修饰SH的正向引物的巯基‑SH通过Au‑S化学键结合，从而使正向引物附着在芯片表面,

(b) 用于扩增目标核酸的5’修饰SH的正向引物，和(c) 等温扩增反应试剂，其包含在等温扩增反应体系中以游离形式存在的用于扩增目标核酸的反向引物、用于实施等温扩增核酸荧光检测反应所需的聚合酶、重组酶、核酸外切酶以及单链DNA结合蛋白、和用于检测扩增子的荧光探针；

所述目标核酸是新冠病毒的orf1ab基因，所述5’修饰SH的正向引物、反向引物和探针序列如下所示：

5’修饰SH的正向引物：

5’‑(SH C6) AAAAAAAAAATACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTG‑3’；

反向引物：

5’‑GGCATTAACAATGAATAATAAGAATCTACAACAGG‑3’；

探针序列：

5’TTGTTGGTGTACTGACATTAGATAATCAAGATC[FAM‑dT]C[THF]A[BHQ‑dT]GGTAACTGGTATGATTTCG‑磷酸‑3’。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含封闭试剂，其用于封闭纳米等离子共振芯片的表面未结合5’修饰SH的正向引物的位点。

说明书

一种纳米等离子共振芯片增强等温扩增核酸荧光检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及核酸扩增和检测领域。具体而言，本发明涉及一种使用纳米等离子共振芯片对目标核酸进行等温扩增核酸荧光检测的方法。本发明还涉及一种用于检测目标核
酸的等温扩增核酸荧光检测试剂盒。

背景技术

[0002] 现有等温扩增（Isothermal Amplification）核酸检测技术如LAMP， RPA和ERA的实现方案是将包括DNA样本，正向引物，反向引物，聚合酶，重组酶，荧光探针等所有的反应
成分都放入PCR扩增管内进行恒温环境下的DNA扩增反应，并通过荧光读取仪对扩增反应中
荧光信号进行实时采集和记录。

[0003] 现有技术的主要缺点有两个：1.由于反应体系非常复杂，DNA模板，引物及各类蛋白酶高度混合，多种反应在空间上同时进行和互相牵制影响，从而造成了超低浓度（<10^4 
copies/mL）样本反应的抑制，从而使得如雅培公司IDNow等几个等温扩增核酸检测产品中
使用的常规等温扩增核酸检测技术的检测下限被限制在10^4 copies/mL以上，无法像常规
热循环PCR方法那样进行接近单分子级别的高灵敏度检测。常规等温扩增 对于较高浓度样
本检测的速度也会同样受到限制。 2. 由于等温扩增反应对温度高度敏感，反应体系中温
度的稳定性和均一性控制就对检测系统的整体恒温要求特别高，否则就会出现反应速度和
检测时间重复性差的问题，尤其会影响到反应效率，延长反应时间。

发明内容

[0004] 相比于常规基于温度升降循环控制的PCR核酸扩增检测，本发明的核酸等温扩增技术只需要在恒定温度下进行核酸检测，不但扩增速度更快，而且对于设备仪器要求小，因
此尤其适合移动式快速核酸检测应用场景。本发明纳米等离共振(NanoSPR, Nano Surface 
Plasmon Resonance)芯片增强等温扩增核酸荧光检测技术则进一步的提高核酸扩增速度
和检测灵敏度，核酸检测下限达到或超过常规PCR核酸检测水平，可以在便携式仪器上实现
快速高通量高灵敏度核酸检测。

[0005] 本发明将核酸等温扩增反应固定在纳米等离子共振芯片上进行，利用芯片的光学共振增强荧光效应，热稳定效应以及引物表面固定效应，实现了对常规等温扩增核酸荧光
检测的灵敏度和速度大幅度的提升，从而达到快速高灵敏度核酸检测的目的。

[0006] 本发明的技术实现方案最主要的不同点在于采用5’修饰SH的正向引物（5’SH F Primer）预先固定于纳米等离子共振芯片的表面，并对芯片表面未结合的位点进行封闭，以
避免后续反应过程中芯片猝灭荧光基团。随后，将预混预热的如LAMP，RPA和ERA这样的等温
扩增反应体系迅速加入置有芯片的96孔板，并将其置于37℃恒温酶标仪中进行荧光信号的
实时采集和记录。

[0007] 不受理论束缚，由于事先将正向引物固定于芯片表面，此时溶液中只含有反向引物及其余扩增组分，芯片表面的修饰一定程度上减少了重组酶及相应模板与两条引物结合
的空间位阻，使FRET探针及反向(R)引物更高效率定位到互补链，间接增强反应体系的荧光
基团释放及扩增效率。随着反应的进行，部分扩增产子会一直固定于芯片表面；根据芯片本
身的特性对这部分扩增子也会产生一定信号。同时纳米结构镀金芯片还能很好的保持芯片
表面反应体系周围恒定的温度，使酶始终处于最佳反应活性。

[0008] 整个反应过程中，始终分为两相参与反应，芯片表面主要进行正向引物与模板的扩增反应，同时在下一轮反应扩增中，其中一条模板链被释放进入溶液中又被反向引物及
FRET探针作为识别的目标，继续通过R引物方向进行产生大量的扩增子，同时激活ExoⅢ切
割 FRET探针释放荧光基团，其扩增产物中的另一条链则到达芯片表面与F引物完成进一步
的扩增，整个反应不断循环，直至底物耗尽，反应基本饱和，荧光物质也会随着反应的进行
不断累积，通过采集到的荧光信号强弱判断扩增的程度。

[0009] 在一个方面，本发明涉及一种使用纳米等离子共振芯片对目标核酸进行等温扩增核酸荧光检测的方法。本发明的方法按顺序可包括以下步骤：(1)将用于扩增目标核酸的5’
修饰SH的正向引物固定于纳米等离子共振芯片的表面；(2)任选地用封闭试剂对纳米等离
子共振芯片的表面未结合所述5’修饰SH的正向引物的位点进行封闭；(3)使等温扩增反应
体系与所述纳米等离子共振芯片接触并进行等温扩增核酸反应；和(4)使用荧光检测仪器
对由步骤(3)的反应产生的荧光信号进行实时采集和记录。在方法中，步骤(1)之后可以清
洗芯片表面以去除未固定的引物。

[0010] 在一个方面，纳米等离子共振芯片可以是纳米结构镀金芯片。

[0011] 在一个方面，在步骤(2)中，可以对芯片表面未结合的位点进行封闭，以避免后续反应过程中芯片猝灭荧光基团。用于步骤(2)的封闭试剂可以是硫醇类化合物，例如具有最
多10个（例如1‑10或2‑6个）碳原子的含一个或多个巯基和任选一个或多个羟基的烃，例如
烷烃，例如直链或支链烷烃。优选地封闭试剂可以是6‑巯基‑1‑己醇。

[0012] 在一个方面，在步骤(3)中，接触和反应可以在孔板中进行，例如96孔板。可以将预混预热的如LAMP，RPA和ERA这样的等温扩增反应体系加入置有芯片的孔板中。

[0013] 在一个方面，荧光检测仪器可以是酶标仪。在步骤(4)中，可以在37℃恒温酶标仪中进行荧光信号的实时采集和记录。

[0014] 在一个方面，目标核酸可以是DNA或者RNA。目标核酸可以是单链或双链。例如，目标核酸可以来源于病原体的基因组。病毒体可以是细菌、病毒、真菌以及寄生虫。在一个方
面，目标核酸来源于新冠病毒的基因组。例如，目标核酸可以是新冠病毒的N基因或者
orf1ab基因。目标核酸也可称为扩增模板或者模板，在双链的情况下，每条链可分别被正向
引物和反向引物结合。目标核酸可包含在待检测的样品中。样品可以来自患者、受试者、环
境、产品等。来自患者或受试者的样品可以是唾液、痰、深喉或鼻腔样品、抽吸液、尿液、血
液、血清、粪便等。环境样品可以是医院、工厂、市场、食品加工厂、批发市场来源的样品。来
自产品的样品可以是来自食品、水产品、医疗用品的样品。

[0015]  在一个方面，等温扩增反应体系可包含目标核酸、用于扩增目标核酸的反向引物、实施等温扩增核酸荧光检测反应所需的酶和/或蛋白、和用于检测扩增子的荧光探针。
在一个方面，所述等温扩增反应体系可包含聚合酶、重组酶和任选的单链DNA结合蛋白和核
酸外切酶。这些反应试剂或反应物并没有固定在芯片表面。因此，它们在反应体系中通常以
游离形式存在。在等温扩增反应体系中，各种试剂或反应物以溶液的方式存在。在反应体系
与芯片接触后，5’修饰SH的正向引物仍固定于芯片表面，而其它反应试剂或反应物则在反
应液中以游离形式存在。在一个方面，用于检测扩增子的荧光探针可以是FRET探针。本领域
技术人员理解，本文中提到的正向引物和反向引物成对地使用，用于扩增同一个目标核酸，
例如某个双链DNA或者某个病毒基因。由被固定的正向引物产生的扩增子可以仍固定在芯
片表面， 而由游离的反向引物产生的扩增子则仍呈现游离状态。核酸外切酶可以是核酸外
切酶III。

[0016] 本发明的芯片上可以固定有多种5’修饰SH的正向引物，用于扩增多种不同的目标核酸。相应地，反应体系可包含多种相应的反向引物，用于扩增所述多种不同的目标核酸。

[0017]  在一个方面，等温扩增反应体系是选自LAMP， RPA和ERA的等温扩增反应体系。等温扩增核酸荧光检测使用环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）或酶促重组等
温扩增（ERA）技术进行。等温扩增核酸荧光检测还可以使用依赖核酸序列的扩增 (NASBA)、
滚环扩增(RCA)、单引物等温扩增(SPIA)、依赖解旋酶 DNA等温扩增 (HDA)、链替代扩增 
(SDA)进行。本发明的等温扩增反应体系也可以使用这些扩增的反应体系。这些扩增技术都
是本领域熟知的，其原理和使用的试剂都记载在相关技术文献中并且可由技术人员确定。

[0018] 在一个方面，本发明涉及一种用于检测目标核酸的等温扩增核酸荧光检测试剂盒。本发明的试剂盒可包含(a)纳米等离子共振芯片、(b)用于扩增目标核酸的5’修饰SH的
正向引物和(c)等温扩增反应试剂和/或反应物。在该方面中，用于扩增目标核酸的5’修饰
SH的正向引物可被固定于所述纳米等离子共振芯片的表面。等温扩增反应试剂和/或反应
物包含用于扩增目标核酸的反向引物。所述反应试剂和/或反应物还可包含实施等温扩增
核酸荧光检测反应所需的酶和/或蛋白、和用于检测扩增子的荧光探针。在一个方面，所述
反应试剂和/或反应物可包含聚合酶、重组酶和任选的单链DNA结合蛋白和核酸外切酶。这
些反应试剂或反应物并没有固定在芯片表面。因此，它们在反应体系中通常以游离形式存
在。在一个方面，用于检测扩增子的荧光探针可以是FRET探针。本领域技术人员理解，本文
中提到的正向引物和反向引物成对地使用，用于扩增同一个目标核酸，例如某个双链DNA或
者某个病毒基因。核酸外切酶可以是核酸外切酶III。

[0019]  在一个方面，本发明试剂盒中使用的反应试剂或反应物是以下等温扩增技术中使用的那些：环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、酶促重组等温扩增（ERA）、
依赖核酸序列的扩增 (NASBA)、滚环扩增 (RCA)、单引物等温扩增（SPIA）、依赖解旋酶 DNA
等温扩增 (HDA)和链替代扩增 (SDA)等，优选环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增
（RPA）和酶促重组等温扩增（ERA）。

[0020] 在一个方面，所述试剂盒还包含封闭试剂，其用于封闭纳米等离子共振芯片的表面未结合5’修饰SH的正向引物的位点。封闭试剂可以是硫醇类化合物，例如具有最多10个
（例如1‑10或2‑6个）碳原子的含一个或多个巯基和任选一个或多个羟基的烃，例如烷烃，例
如直链或支链烷烃。优选地封闭试剂可以是6‑巯基‑1‑己醇。

[0021] 在一个方面，本发明方法和试剂盒中使用的扩增反应体系、试剂和反应物可包含进行等温扩增反应和检测反应所必须的物质，例如上文提及的反应试剂和反应物。除此之
外，还可包含dNTP、酶活性所需金属离子例如镁离子、缓冲液、荧光标记和溶剂等。它们还可
包括反应所需的蛋白，例如单链核酸结合蛋白，例如单链DNA结合蛋白。实施等温扩增核酸
荧光检测反应所需的酶包括扩增反应所需的酶，例如聚合酶包括DNA或RNA聚合酶、重组酶、
逆转录酶、RNA酶、解旋酶等；和荧光检测反应所需的酶，例如核酸外切酶包括DNA核酸外切
酶。不同类型的等温扩增反应所需要的酶或蛋白可以不同，本领域技术人员可以确定相应
的酶或蛋白。

[0022] 在一个方面，本发明方法和试剂盒所检测的目标核酸来源于新冠病毒的基因组，例如选自新冠病毒N基因和ORF1ab基因。

[0023] 术语“5’修饰SH的正向引物”意指5'末端核苷酸残基上的‑OH被置换成‑SH的引物，包括5'末端核苷酸残基的磷酸基团上的‑OH被置换成‑SH的正向引物。5’修饰SH的正向引物
可以采用常规的DNA合成方法制备，例如可以由专门进行DNA合成服务供应商进行合成。修
饰SH官能团的引物合成方法是已知的，也被众多DNA合成服务商所采用。

[0024] 纳米等离子共振芯片可以涂覆有金原子层或者具有金原子表面。5’修饰SH的正向引物和/或封闭试剂的巯基（‑SH）与芯片表面的金原子结合，从而使引物/封闭试剂附着在
芯片表面。巯基与金原子的结合是稳定的，在不受理论束缚下，可以是物理附着和/或形成
各种化学键，包括共价键、离子键、氢键、范德华力等等，例如Au‑S共价键。用于固定的方法
是本领域技术人员熟知的。

[0025] 在一个方面，本发明方法中的等温扩增核酸荧光检测反应可以在约30℃至45℃下进行，例如31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、43
℃或44℃，优选37℃。

[0026]  在一个方面，用于扩增新冠病毒N基因和ORF1ab基因的引物和探针如下表所示。这些引物和/或探针可以在本发明的方法中使用或包含在试剂盒中。

[0027] 表1

[0028] 。

附图说明

[0029] 图1显示本发明使用纳米等离子共振芯片对目标核酸进行等温扩增核酸荧光检测的方法和使用的试剂。图2详细描述了本发明方法中进行的扩增的原理和使用的试剂。

[0030] 图3和图4显示用本发明的方法扩增和检测新冠病毒N基因的效果。图3是扩增1小时含各个基因（N基因）拷贝数的样品的荧光强度。图4是扩增20分钟含各个基因（N基因）拷
贝数的样品的荧光强度。

[0031] 图5和图6显示用本发明方法扩增和检测新冠病毒orf1ab基因的效果。图5是扩增1小时含各个基因（orf1ab基因）拷贝数的样品的荧光强度。图6是扩增20分钟含各个基因
（orf1ab基因）拷贝数的样品的荧光强度。

[0032] 图7显示本发明的等温扩增检测荧光强度与样品中核酸模板拷贝数的关系。

具体实施方式

实施例

[0033] 实验方法：

[0034] 1. 修饰芯片表面：

[0035] 将F‑SH 引物固定在芯片表面，并清洗芯片表面去除未固定的引物。该步骤对应于图1中的“正向引物（SH）修饰纳米等离子芯片”。

[0036]  2. 封闭芯片表面：

[0037] 将封闭基团溶液（封闭试剂）加入修饰芯片表面孵育，后清洗芯片，去除所有残余溶液。该步骤对应于图1中的“6‑巯基‑1‑己醇（MCH）”和“MCH封闭修饰的纳米等离子体芯片
未结合位点”。

[0038] 。

[0039] 聚合酶、重组酶、单链DNA 结合蛋白和核酸外切酶以及dNTP等试剂以混合冻干粉的形式保存。反应前用溶解剂溶解所述混合冻干粉。用于检测N基因和orf1ab基因的正向‑
SH 引物、反向引物和荧光探针如表1所示。等温扩增检测反应是在37℃下进行。按上述比例
加入各反应量后，充分混匀，短暂离心，打开8联管盖子倒扣于桌面，将激活剂加入盖子中
央，短暂离心，充分混匀后置于37℃恒温水浴锅中预热5min，取出后立即加入集成正向引物
修饰的纳米等离共振芯片的的微孔板芯片孔中，避免气泡；迅速放入已提前预热的荧光酶
标仪中，采用荧光模式进行采集相应的荧光信号。这些步骤对应于图1中的“酶促重组扩增
（ERA）反应体系”、“ExoIII切割FRET探针释放荧光基团”、“ERA指示扩增反应达到平衡”以及
显示器显示结果。

[0040] 图1用图示的方式描述了上述实验过程。

[0041] 图2表明在上述实验过程的扩增过程中各种分子相互之间的作用和反应情况。由于5'SH正向引物被固定在芯片表面，此时溶液中只含有反向引物及其余扩增组分，芯片表
面的修饰一定程度上减少了重组酶及相应模板与两条引物结合的空间位阻，使FRET探针及
反向(R)引物更高效率定位到互补链，间接增强反应体系的荧光基团(例如FAM和BHQ1)释放
及扩增效率。随着反应的进行，部分扩增产子会一直固定于芯片表面；根据芯片本身的特性
对这部分扩增子也会产生一定信号。同时纳米结构镀金芯片还能很好的保持芯片表面反应
体系周围恒定的温度，使酶始终处于最佳反应活性。

[0042]  在本实施例中，检测的DNA样本包含各个不同拷贝数的N基因、orf1ab基因。

[0043] 实验结果和评述

[0044] 实验结果如图3至7所示。Copies表示拷贝数，NTC表示阴性对照，min表示分钟。

[0045] 采用本发明中的技术方案后，对于同样的检测试剂组成，等温扩增核酸检测的灵敏度可以提高2‑3个数量级，检测下限可以从10^4个病毒/mL下降到20个病毒/mL, 对于同
一浓度的DNA样本检测时间缩短为常规检测的1/3以内。采用本发明技术方案的NanoSPR芯
片增强等温扩增核酸检测试剂盒产品如新冠病毒核酸检测试剂盒能够满足15分钟内检测<
100 copies/mL低浓度病毒样本的要求，而这是包括雅培IDNow (4000 copies/mL)和
Lucira（检测下限900copies/mL）在内的基于传统等温扩增技术的新冠病毒核酸检测试剂
盒所无法达到的。

[0046] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱
离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所
提交的权利要求书确定专利保护范围。