一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物及试剂盒转让专利
申请号 : CN202110153611.X
文献号 : CN112501349B
文献日 : 2021-11-09
发明人 : 董晓艳 , 熊永清 , 王洪
申请人 : 爱科睿特生物医疗科技(南京)有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的引物探针组合物,其特征在于:包括:毛霉菌的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物序列如SEQ ID NO.2所示,探针序列如SEQ ID NO.3所示;白色假丝酵母菌的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示,下游引物序列如SEQ ID NO.5,探针序列如SEQ ID NO.6所示;隐孢子虫上游引物序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物序列如SEQ ID NO.8所示,探针序列如SEQ ID NO.9所示;环孢子虫上游引物序列如SEQ ID NO.10所示,下游引物序列如SEQ ID NO.11所示,探针序列如SEQ ID NO.12所示;溶组织内阿米巴上游引物序列如SEQ ID NO.13所示,下游引物序列如SEQ ID NO.14所示,探针序列如SEQ ID NO.15所示;蓝氏贾第鞭毛虫上游引物序列如SEQ ID NO.16所示,下游引物序列如SEQ ID NO.17所示,探针序列如SEQ ID NO.18所示;曲霉菌上游引物序列如SEQ ID NO.19所示,下游引物序列如SEQ ID NO.20所示,探针序列如SEQ ID NO.21所示;人芽囊原虫上游引物序列如SEQ ID NO.22所示,下游引物序列如SEQ ID NO.23所示,探针序列如SEQ ID NO.24所示;管家基因上游引物序列如SEQ ID NO.25所示,下游引物序列如SEQ ID NO.26所示,探针序列如SEQ ID NO.27所示。
2.根据权利要求1所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的组合物,其特征在于:所述毛霉菌探针的5’端标记有FAM发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1 ;所述白色假丝酵母菌探针的5’端标记有FAM发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1;所述隐孢子虫探针的5’端标记有ROX发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2;所述环孢子虫探针的5’端标记有ROX发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2;所述溶组织内阿米巴探针的5’端标记有HEX发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1;所述蓝氏贾第鞭毛虫探针的5’端标记有FAM发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1;曲霉菌探针的5’端标记有FAM发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1;人芽囊原虫探针的5’端标记有HEX发光基团,
3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1;管家基因探针的5’端标记有CY5发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
3.一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物探针组合物、病原体标志物标准品、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水和Taq酶;PCR扩增反应的条件为:55℃逆转录15min;95℃预变性30s;95℃变性10s;60℃退火30s;40个循环。
4.根据权利要求3所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒,其特征在于:所述引物探针组合物中引物在扩增体系中的终浓度为100‑1000nM;所述引物探针组合物中TaqMan探针在扩增体系中的终浓度为50‑500nM。
5.根据权利要求3所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒的检测样本为粪便。
6.根据权利要求3所述的同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体的试
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剂盒,其特征在于,所述病原体标志物标准品为10 copies/ml。
说明书 :
一种同步检测8种儿童消化道感染真菌及寄生虫相关病原体
的引物探针组合物及试剂盒
技术领域
背景技术
导致。全年均可发病,真菌中常见的是毛霉菌(Muc)、白色假丝酵母菌(MoA)、隐孢子虫
(Cryp)、环孢子虫(Cyc)、溶组织内阿米巴(EnHS)、蓝氏贾第鞭毛虫(Gial)。曲霉菌(As)、人
芽囊原虫(BH)等,部分具有传染性,通常引起腹泻等临床病症。这些消化道真菌及寄生虫大
都具有感染力强、治疗期长等特点。随着科技发展,越来越多的新的致病性消化道病原体被
发现,给临床相关疾病的诊断和治疗造成极大的困难。
关注和高度重视。
体免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验,该法具有直观、技术成熟、特异性好的优点,但
耗时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值。
但实际应用过程中该技术多是针对单项或几项病原体,想要同步检测多种病原体就需要多
种检测试剂盒搭配,操作不便且成本较高。针对消化道感染病原体的特点,建立起高效、快
速、简便、特异的检测方法,以适应疫情筛查和临床检测的需求,是当前消化道感染性疾病
防治工作的重点,因而多重荧光定量PCR技术应运而生。
步检测同一标本内几十种乃至上百种关联病原体,有利于精确判断病情,实现疾病的早期、
快速、精准治疗。多重PCR技术的成功实施需要解决以下几个关键技术问题:(1)由于需要使
用多组引物/探针组合,设计时需要避免不同引物/探针之间互相产生交联。(2)避免每组引
物/探针对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性,以防止产生假阳性结果。(3)每种扩
增子的最佳扩增条件不同,需要优化反应条件,保证在单一扩增条件下各扩增子都能成功
扩增。(4)需要有内对照作为参考以排除来自核酸提取等方面的干扰。
消化道感染真菌及寄生虫相关病原体检测产品。
发明内容
括毛霉菌(Muc)、白色假丝酵母菌(MoA)、隐孢子虫(Cryp)、环孢子虫(Cyc)、溶组织内阿米巴
(EnHS)、蓝氏贾第鞭毛虫(Gial)。曲霉菌(As)、人芽囊原虫(BH)。
关的特定病原体诊断研究尚有不足的技术问题。
检测特异性不强的技术问题。
示,探针序列如SEQ ID NO.3所示;白色假丝酵母菌(MoA)的上游引物序列如SEQ ID NO.4所
示,下游引物序列如SEQ ID NO.5,探针序列如SEQ ID NO.6所示;隐孢子虫(Cryp)上游引物
序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物序列如SEQ ID NO.8所示,探针序列如SEQ ID NO.9所
示;环孢子虫(Cyc)上游引物序列如SEQ ID NO.10所示,下游引物序列如SEQ ID NO.11所
示,探针序列如SEQ ID NO.12所示;溶组织内阿米巴(EnHS)上游引物序列如SEQ ID NO.13
所示,下游引物序列如SEQ ID NO.14所示,探针序列如SEQ ID NO.15所示;蓝氏贾第鞭毛虫
(Gial)上游引物序列如SEQ ID NO.16所示,下游引物序列如SEQ ID NO.17所示,探针序列
如SEQ ID NO.18所示;曲霉菌(As)上游引物序列如SEQ ID NO.19所示,下游引物序列如SEQ
ID NO.20所示,探针序列如SEQ ID NO.21所示;人芽囊原虫(BH) 上游引物序列如SEQ ID
NO.22所示,下游引物序列如SEQ ID NO.23所示,探针序列如SEQ ID NO.24所示;管家基因
(IC)(BH) 上游引物序列如SEQ ID NO.25所示,下游引物序列如SEQ ID NO.26所示,探针序
列如SEQ ID NO.27所示。
基团BHQ1;所述隐孢子虫(Cryp)探针的5’端标记有ROX发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团
BHQ2;所述环孢子虫(Cyc)探针的5’端标记有ROX发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2;
所述溶组织内阿米巴(EnHS)探针的5’端标记有HEX发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团
BHQ1;所述蓝氏贾第鞭毛虫(Gial)探针的5’端标记有FAM发光基团,3’端标记有荧光淬灭基
团BHQ1;曲霉菌(As)探针的5’端标记有FAM发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1;人芽
囊原虫(BH)探针的5’端标记有HEX发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。管家基因(IC)
探针的5’端标记有CY5发光基团,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
酶。所述的病原体标志物标准品包括真菌病原体标志物标准品和寄生虫病原体标志物标准
品。
可以作为标志物用于消化道真菌或寄生虫感染的风险预估与检测,具有灵敏度高、准确性
强的优点,为消化道感染诊断提供了一定的应用价值,对我国儿童消化道感染的筛查、预防
及治疗有较大的帮助。
真菌和5种寄生虫,是目前最全面的儿童消化道感染真菌及寄生虫类病原体检测方法,检测
快速、准确,应用广泛,检测结果可用于临床诊断和治疗。
附图说明
品的扩增曲线,其中,在图1中,从左至右依次为5×10 copies/ml、5×10 copies/ml、5×
5 4 3 2
10 copies/ml、5×10copies/ml、5×10copies/ml、5×10 copies/ml的参考品的扩增曲
线。
品的扩增曲线,其中,在图2中,从左至右依次为5×10 copies/ml、5×10 copies/ml、5×
5 4 3 2
10 copies/ml、5×10copies/ml、5×10copies/ml、5×10 copies/ml的参考品的扩增曲
线。
品的扩增曲线其中,在图3中,从左至右依次为5×10 copies/ml、5×10 copies/ml、5×
5 4 3 2
10 copies/ml、5×10copies/ml、5×10copies/ml、5×10 copies/ml的参考品的扩增曲
线。
具体实施方式
Start Taq酶、逆转录酶和UNG酶;阳性质控品中含有对应消化道病原体的扩增基因序列的
质粒或RAN颗粒。
物探针混合液2μL,配成体系,盖好管盖,放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测。
10 copies/ml、5×10copies/ml、5×10copies/ml、5×10 copies/ml)对试剂的线性进
行验证。检测结果见图1、2、3。
线性良好,最低检测下限达到5×10 copies/ml。
1号反应管 白色假丝酵母菌 隐孢子虫 人芽囊原虫 管家基因
2号反应管 毛霉菌 蓝氏贾第鞭毛虫 环孢子虫 管家基因
3号反应管 曲霉菌 溶组织内阿米巴 管家基因
隐孢子虫 ROX TGGTGATTCATAATAACTTTACGGAT AATACCCTACCGTCTAAAGCTG TGACATATCATTCAAGTTTCTGACC
人芽囊原虫 HEX ATAATAATTGAAGGCTTTCGT ATAAATCCGAGAATTTCACCT GGAACAGTTGGGGGTATTCA
管家基因 CY5 CGGGACCTGACTGACTACCT GCTTCTCCTTAATGTCACGCA CGGCTACAGCTTCACCACCA
毛霉菌 FAM CCACGCAATCAGGAATTTCA CTTTAGGCAATCCCTCAAAACG CGTCCATGTTACTGTGTAACTGCCTT
蓝氏贾第鞭毛虫 ROX GAACCTCAAGACGCGCTA TTTATTTTCTTAACTTGGGCTC CGGCGGAACCCTTTTTTGCGC
环孢子虫 HEX GGGCATTCGTATTTAACTGTCA TTTCCCTATCTCTAGTCGGCAT GTTAAAGACGAACTACTGCGAAAG
管家基因 CY5 CGGGACCTGACTGACTACCT GCTTCTCCTTAATGTCACGCA CGGCTACAGCTTCACCACCA
曲霉菌 FAM CATGCCTGTCCGAGCGTCA CGAGGTCACCTTAAGAAGTGGGT CCTCAAGCACGGCTTGTGTGT
溶组织内阿米巴 ROX GATCAGATACCGTCGTAGTCCT TTAAGTTTCAGCCTTGTGACCA CGATGTCAACCAAGGATTGGATG
管家基因 CY5 CGGGACCTGACTGACTACCT GCTTCTCCTTAATGTCACGCA CGGCTACAGCTTCACCACCA