新型冠状病毒(SARS-COV-2)刺突蛋白结合分子及其应用转让专利
申请号 : CN202080002271.4
文献号 : CN112513076B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 张军方
申请人 : 深圳市因诺赛生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:能特异性结合SARS‑COV‑2刺突蛋白且包含一个免疫球蛋白单一可变结构域,所述免疫球蛋白单一可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3为:
SEQ ID NO:13所示的CDR1,SEQ ID NO:14所示的CDR2和SEQ ID NO:15所示的CDR3;
所述免疫球蛋白单一可变域为单域抗体。
2.如权利要求1所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述单域抗体包含与SEQ ID NO:68序列具有至少80%的序列相同性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述单域抗体包含与SEQ ID NO:68序列具有至少90%的序列相同性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述单域抗体包含与SEQ ID NO:68序列具有至少99%的序列相同性的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述单域抗体包含SEQ ID NO:68氨基酸序列。
6.如权利要求1‑5任一项所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:还包含免疫球蛋白Fc区。
7.如权利要求6所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述免疫球蛋白Fc区是人免疫球蛋白Fc区。
8.如权利要求7所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1的Fc区。
9.如权利要求8所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列为SEQ ID NO:85。
10.如权利要求9所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,其特征在于:所述结合分子包含SEQ ID NO:90氨基酸序列。
11.编码权利要求1‑10任一项所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子的核酸分子。
12.包含权利要求11所述的核酸分子及其表达调控原件的表达载体。
13.包含权利要求11所述的核酸分子并进行表达的宿主细胞。
14.获得权利要求1‑10中任一项所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子的方法,其特征在于,包括:
a、在允许所述SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子表达的条件下培养权利要求13所述的宿主细胞;
b、从步骤a的培养物中收集由所述宿主细胞表达的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子。
15.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1‑10任一项所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,以及药学上可接受的载体。
16.权利要求15所述的药物组合物在制备治疗或预防新型冠状病毒病肺炎药物中的应用。
17.一种用于检测SARS‑COV‑2的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1‑10任一项所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子。
说明书 :
新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)刺突蛋白结合分子及其应用
技术领域
背景技术
2并无特异性,治疗效果受限,难以成为COVID‑19的特效药。
发明内容
结合分子及其应用。
CDR3选自如下组合中的任意一组:
体细胞ACE2受体的结合,进而阻断SARS‑COV‑2对细胞的感染过程,抑制SARS‑COV‑2的传染
和扩增。且本发明提供的SARS‑COV‑2‑Spike蛋白结合分子还具有与SARS‑COV‑2‑Spike蛋白
结合的特异性好,生物活性和稳定性高以及无毒副作用的特点。同时本发明提供的SARS‑
COV‑2‑Spike蛋白结合分子可以在体内发挥长效抑制SARS‑COV‑2的作用,有效避免SARS‑
COV‑2在活体内复发或复阳。
免疫球蛋白,例如,IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。
得。
件(启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因等)。针对在特定宿
主细胞中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。
子的分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
需要还可以包括其它佐剂和辅料等。
外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径,可将活性化合物即结合分子、免
疫缀合物包裹于一种材料中,以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件
的作用,为本领域技术人员公知。
使检测样品和对照样品接触上述任一项所述的SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子,检测复合物
的形成;通过所述检测样品与对照样品之间复合物形成的差异判断样品中SARS‑COV‑2的存
在。
附图说明
具体实施方式
限定本发明。
操作均可以且已经以本身已知的方式进行,该方式将为本领域技术人员所了解。
区”组成的免疫球蛋白结构域,其中所述框架区由本领域所称的“互补决定区1”或“CDR1”、
“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。
因此,免疫球蛋白单一可变结构域的一般结构或序列可如下表示为:FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑
FR3‑CDR3‑FR4。免疫球蛋白单一可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异
性。
antibody,sdAb),是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体,因其分子量小,也被称
为纳米抗体(Nanobody)。单域抗体特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域。单域抗体
为由免疫球蛋白单一可变结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
JBiol Chem.,287(2012)13713–13721;Deffar et al.,African Journal of Biotech
nology Vol.8(12),pp.2645‑2652,17June,2009和WO94/04678。
域中是已知的。
分子的亲和力和/或亲合力确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所
表示的亲和力,是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度:KD值越小,表
位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者,亲和力也可表示为缔合常数(KA),其为1/
KD)。如本领域技术人员将了解,取决于具体感兴趣的抗原,可以以已知方式测定亲和力。亲
合力为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变结构域或含有其的多
肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与以下两者有关:与其抗原结合分子上的抗原
结合位点之间的亲和力,以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。
可以包括针对SARS‑COV‑2刺突蛋白的如本发明定义的单域抗体或其缀合物。SARS‑COV‑2刺
突蛋白结合分子还涵盖所谓的“SM IP”(“小模块免疫药物”),或者免疫球蛋白超家族抗体
(IgSF)或CDR移植分子。
COV‑2刺突蛋白结合分子”可以包含两个结合SARS‑COV‑2刺突蛋白的免疫球蛋白单一可变
结构域如单域抗体。含有一个以上的免疫球蛋白单一可变结构域的SARS‑COV‑2刺突蛋白结
合分子亦称为“格式化的”SAR S‑COV‑2刺突蛋白结合分子。格式化的SARS‑COV‑2刺突蛋白
结合分子除结合SARS‑COV‑2刺突蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域外也可包含接头和/或
具有效应器功能的部分,例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变
结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如P EG)和/或Fc区。本发
明的“SARS‑COV‑2刺突蛋白结合分子”还涵盖双特异性抗体,其含有结合不同抗原的免疫球
蛋白单一可变结构域。
测量的优选10 至10 摩尔/升(M)、更优选10 至10 摩尔/升、甚至更优选10 至10 、甚
‑11 ‑12 ‑4
至更优选10 至10 或更低的解离常数(KD)。任何大于10 M的KD值一般都视为指示非特异
性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定,包
括例如本文所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、和/或竞争性结合测定(例如酶免疫测
定(EIA)及夹心式竞争性测定。
组(1)‑(5)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代:(1)较小脂族非极性或弱
极性残基:Ala、Ser、Thr、Pro及Gly;(2)极性带负电残基及其(不带电)酰胺:Asp、Asn、Glu及
Gln;(3)极性带正电残基:His、Ar g及Lys;(4)较大脂族非极性残基:Met、Leu、Ile、Val及
Cys;及(5)芳族残基:Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下:Ala被Gly或Ser取
代;Arg被Lys取代;Asn被Gln或His取代;Asp被Glu取代;Cys被Ser取代;Gln被Asn取代;Glu
被Asp取代;Gly被Ala或Pro取代;His被Asn或Gln取代;Ile被Leu或Val取代;Leu被Ile或Val
取代;Lys被Arg、Gln或Glu取代;Met被Leu、Tyr或Ile取代;Phe被Met、Leu或Tyr取代;Ser被T
hr取代;Thr被Ser取代;Trp被Tyr取代;Tyr被Trp或Phe取代;Val被Ile或Leu取代。
列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如,可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同
性。对于序列相同性的确定,可以参见例如:Sequence Analysis in Molecular Biology,
von Heinje,G.,Academic Press,1987和Se quence Analysis Primer,Gribskov,M.and
Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,NewYo rk,1991。
另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离时,多肽或核
酸分子视为“基本上分离的”。特别地,多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10
倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上分离的”。经适合的技
术(例如适合色谱技术,如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定,“基本上分离的”多肽或核酸分子优
选基本上为均质的。
说明提取的RNA没有明显降解,纯度较好;总RNA浓度为937.5ng/μL。用提取的总RNA进行琼
脂糖凝胶电泳,结果如图1所示,可以看到28S和18S两条条带。
Primer Rev‑1:5′‑GGTACGTGCTGTTGAACTG TTCC‑3′(SEQ ID NO:109)。
为Step 2的DNA模板;
110);Primer Rev‑2:5′‑GATGTGCAGC TGCAGGAGTCTGGRGGAGG‑3′(SEQ ID NO:111)。
度为458ng/μL。
针对SARS‑COV‑2‑Spike蛋白的单域抗体基因文库,命名为S2‑Lib。共转化15次,混合后均匀
涂布于6块Ф150mm的培养皿(含氨苄青霉素的LB固体培养基)中。
9
板为准计数),如表1所示,计算库容量为1.425×10cfu。
插入率为100%,文库实际库容量为
13
体,即得噬菌体展示文库,命名为S2‑PDL,滴度为3.5×10 cfu/mL。可直接用于后续特异性
噬菌体的亲和筛选。
1wt%脱脂奶粉室温封闭2h,加入100μl噬菌体(8×10 tfu,来自1.1.6所构建的噬菌体展示
文库S2‑PDL),在室温下作用1h。之后用PBST(PBS中含有0.05vt%吐温20)洗脱5遍,以洗掉
不结合的噬菌体;用三乙基胺(100mM)将与Spike‑RBD蛋白特异性结合的噬菌体解离下,并
感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1,产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程
重复3轮。由此,阳性的克隆被富集,达到了利用噬菌体展示文库筛取抗体库中Spike‑RBD蛋
白特异抗体的目的。并将获得的阳性的噬菌体进行测序,获得抗体基因序列。
行ELISA测定。获得可特异性结合Spike‑RBD蛋白的抗体。
异性结合Spike‑RBD蛋白的单域抗体株,单域抗体序列如SEQ ID NO:64‑84,分别携带SEQ
ID NO:1‑63中的21组CDR1‑3序列,具体如表2所示。
主菌BL1(DE3)(天根生化科技,产品号:CB105‑02)中,将其涂布在含有100μg/mL的氨苄青霉
素的LB平板上,37℃过夜。挑选单菌落接种、培养过夜,第二天将过夜菌种转接扩增,37℃摇
床培养至OD值达到0.5‑1时,加入0.5mM IPTG诱导,28℃摇床培养过夜。第二天,离心收集菌
体,并将收集的菌体破碎获得抗体粗提液。然后纯化21株单域抗体蛋白,使其纯度达到90%
以上。
抗体,对照组2的孔中不加入生物素化的ACE2蛋白,室温下反应2h。之后加入SA‑HRP(购自
Sigma公司),室温反应1小时后加入显色液,450nm波长读取吸收值。当样品OD值比对照OD值
<0.8时,则认为单域抗体有阻断效果。
株单域抗体分别加入到培养体系中,具体操作为:将10 /孔VERO细胞加到96孔板,24小时
后,用PBS洗细胞2次,将21株单域抗体分别与病毒混合加入96孔板,抗体初始浓度为10μg/
mL,再分别2倍稀释10个梯度,5个复孔,37℃孵育2小时,第5天检测VERO细胞是否感染病毒
(若细胞不发生病变说明单域抗体具有中和病毒并阻断病毒感染VERO细胞的过程)。
过程。根据表5中得到的IC50(μg/ml)数据说明所获得的21株单域抗体能够阻断病毒感染细
胞的过程,为有效的中和抗体。
IgG1‑Fc的核酸片段(核酸序列如SEQ ID NO:107),再通过overlapping PCR得到SARS‑COV‑
2‑Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白的编码核酸片段,并重组至载体pCDNA4
(Invitrogen,Cat V86220)。
释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液,将质粒/PEI混合物分别加入HEK293细胞
悬液中,放置在37℃,10%的CO2,100rpm的摇床中培养;补加50μg/LIGF‑1。4h后补加EX293
培养基、2mM谷氨酰胺和50μg/LIGF‑1,120rpm摇培。24h后加3.8mMVPA。培养5天后,收集表达
培养上清液,通过ProteinA亲和层析法,纯化得到SARS‑COV‑2‑Spike蛋白单域抗体与Fc的
融合蛋白。获得的21个SARS‑COV‑2‑Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白的序列如SEQ ID
NO:86‑106。
融合蛋白针对spike‑RBD的结合动力学通过表面等离振子共振(SRP)方法,使用
BIAcoreX100仪器测量,将spike‑RBD蛋白直接包被于CM5生物传感器芯片上以获得大约
1000应答单位(response units,RU)。对于动力学测量,将SARS‑COV‑2‑Spike蛋白单域抗体
与Fc的融合蛋白用HBS‑EP+1×缓冲液(GE,cat#BR‑1006‑69)三倍连续稀释(1.37nm至
1000nm),在25℃进样120s,解离时间为30min,加入10mM甘氨酸‑HCl(pH2.0)再生120s。使用
简单一对一Languir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算出融合
蛋白与SARS‑COV‑2‑Spike蛋白的结合速率(kon)、解离速率(koff)和平衡解离常数(kD)(以
比率koff/kon计算)。计算结果如表6所示。
快速的结合SARS‑COV‑2‑Spike蛋白并很难解离下来,进一步说明SARS‑COV‑2‑Spike蛋白单
域抗体与Fc融合蛋白作为一个阻断型抗体,具有极佳的阻断效果。
蛋白,对照组2中不加入ACE2‑Biotin,室温下反应2h。洗涤之后加入SA‑HRP(购自Sigma公
司),室温反应1小时,洗涤之后加入显色液,450nm波长读取吸收值。结果如表7所示。
对照组1 2.414
对照组2 0.019
1 0.015
2 0.023
3 0.014
4 0.014
5 0.016
6 0.011
7 0.013
8 0.001
9 0.014
10 0.008
11 0.019
12 0.014
13 0.017
14 0.016
15 0.012
16 0.025
17 0.011
18 0.018
19 0.014
20 0.019
21 0.013
的质粒(pCDNA4,Invitrogen,Cat V86220),并于膜上瞬时表达Spike蛋白。该质粒使得
Spike蛋白C端融合EGFP蛋白,从而可以通过绿色荧光强度来考察膜上Spike蛋白的表达水
平。将构建好的细胞重悬于0.5%的PBS‑BSA Buffer中,加入SARS‑COV‑2‑Spike蛋白单域抗
体与Fc融合蛋白,同时设置阴性对照,冰上孵育20min。洗涤后加入eBioscience二抗anti‑
hIg‑PE,冰上20min。洗涤后将细胞重悬于500μl的0.5%PBS‑BSABuffer中,流式细胞仪进行
检测。结果显示,21株SARS‑COV‑2‑Spike蛋白单域抗体‑Fc融合蛋白只特异性结合SARS‑
COV‑2‑Spike蛋白,而不与其他冠状病毒的Spike蛋白结合。
融合蛋白100μg/恒河猴)进行给药治疗,另外6只(对照组)不进行给药治疗。在治疗后的6天
内,每天进行一次呼吸道病毒载量的检测。经检测,治疗组的6只恒河猴呼吸道中新冠病毒
的平均载量相比对照组显著降低,如图5所示。继续对治疗组的6只恒河猴进行观察,每隔一
周对其症状和呼吸道病毒载量进行检测。持续观察2周后,检测不出其呼吸道中的病毒载
量,也未出现相应的发病症状。持续观察3个月,治疗组的6只恒河猴体内的病毒均无复发的
情况,说明上述SARS‑COV‑2‑Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白可在体内发挥长效作用,且
可以避免感染新型冠状病毒的活体治愈后出现复阳。其中新冠病毒的载量的检测过程为:
分别采取给药治疗的恒河猴(治疗组)和未进行给药治疗的恒河猴(对照组)的咽拭子,提取
咽拭子中的病毒的核酸进行检测,检测过程为:采用RNA提取试剂盒(Qiagen)按照说明书操
作提取SARS‑COV‑2的RNA,将获得的RNA溶解在50μL洗脱buffer并作为模板进行RT‑PCR扩
增。用引物RBD‑qF1(5′‑CAATGGTTTAACAGGCACAGG‑3′,SEQ ID NO:112)和RBD‑qR1(5′‑
CTCAAGTGTCTGTGGATCACG‑3′,SEQ ID NO:113)扩增病毒S区基因。采用HiScriptR II One
Step qRT‑PCR SYBRRGreen Kit(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒,根据试剂盒说明书进
行操作,设置PCR扩增条件为;50℃3min,95℃10s,60℃30s,40个循环,所用PCR扩增仪为ABI
定量PCR仪。
果,且经过治疗后的恒河猴的复阳率为0。