制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒转让专利
申请号 : CN202011007025.6
文献号 : CN112522202B
文献日 : 2022-04-05
发明人 : 牛冬 , 汪滔 , 马翔 , 曾为俊 , 王磊 , 程锐 , 赵泽英
申请人 : 南京启真基因工程有限公司
摘要 :
本发明公开了一种制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种制备ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因这四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。本发明还提供了sgRNA组合，由SEQ ID NO：11所示sgRNAADA‑g7、SEQ ID NO：21所示sgRNADQA‑gn2、SEQ ID NO：28所示sgRNADRA‑g1和SEQ ID NO：40所示sgRNAIL2RG‑g7组成。sgRNA组合可用于：制备重组细胞；制备免疫缺陷动物模型。本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。
权利要求 :
1.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将携带sgRNAADA‑g7基因的质粒、携带sgRNADQA‑gn2基因的质粒、携带sgRNADRA‑g1基因的质粒、携带sgRNAIL2RG‑g7基因的质粒和质粒pKG‑GE3共转染猪细胞，得到ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均发生突变的重组细胞；
将sgRNAADA‑g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNAADA‑g7基因的质粒；所述sgRNAADA‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1‑20位核苷酸所示；
将sgRNADQA‑gn2的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNADQA‑gn2基因的质粒；所述sgRNADQA‑gn2的靶序列结合区如SEQ ID NO：21中第1‑20位核苷酸所示；
将sgRNADRA‑g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNADRA‑g1基因的质粒；所述sgRNADRA‑g1的靶序列结合区如SEQ ID NO：28中第1‑20位核苷酸所示；
将sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNAIL2RG‑g7基因的质粒；所述sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：40中第1‑20位核苷酸所示；
所述pKG‑U6gRNA载体如SEQ ID NO：3所示；
所述质粒pKG‑GE3如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述方法制备得到的重组细胞。
3.权利要求2所述重组细胞在制备免疫缺陷动物模型中的应用。
4.sgRNA组合，由sgRNAADA‑g7、sgRNADQA‑gn2、sgRNADRA‑g1和sgRNAIL2RG‑g7组成；
所述sgRNAADA‑g7如SEQ ID NO：11所示；
所述sgRNADQA‑gn2如SEQ ID NO：21所示；
所述sgRNADRA‑g1如SEQ ID NO：28所示；
所述sgRNAIL2RG‑g7如SEQ ID NO：40所示。
5.质粒组合，由携带sgRNAADA‑g7基因的质粒、携带sgRNADQA‑gn2基因的质粒、携带sgRNADRA‑g1基因的质粒和携带sgRNAIL2RG‑g7基因的质粒组成；
将sgRNAADA‑g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNAADA‑g7基因的质粒；所述sgRNAADA‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1‑20位核苷酸所示；
将sgRNADQA‑gn2的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNADQA‑gn2基因的质粒；所述sgRNADQA‑gn2的靶序列结合区如SEQ ID NO：21中第1‑20位核苷酸所示；
将sgRNADRA‑g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNADRA‑g1基因的质粒；所述sgRNADRA‑g1的靶序列结合区如SEQ ID NO：28中第1‑20位核苷酸所示；
将sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体，得到携带sgRNAIL2RG‑g7基因的质粒；所述sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：40中第1‑20位核苷酸所示。
6.一种试剂盒，包括权利要求4所述的sgRNA组合或权利要求5所述的质粒组合；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质粒pKG‑GE3；所述质粒pKG‑GE3如SEQ ID NO：2所示。
8.权利要求4所述sgRNA组合或权利要求5所述质粒组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
9.权利要求5所述质粒组合和质粒pKG‑GE3在制备试剂盒中的应用；所述质粒pKG‑GE3如SEQ ID NO：2所示；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
10.权利要求4所述sgRNA组合或权利要求5所述质粒组合或权利要求6所述试剂盒或权利要求7所述试剂盒的应用，为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。
说明书 :
制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的
方法及其专用试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种制备ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因这四个基因
联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。
联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。
背景技术
[0002] 重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)是原发性免疫缺陷病中最严重的表型，是指由于遗传、发育或感染等因素导致的T细胞、B细胞和NK细胞同时
出现发育、分化、增值、代谢或功能障碍。1950年，Glanzmann和Riniker首次报道了人类婴儿
中的SCID病。在全球，SCID的新生儿发病率约为1/50000，该病发病年龄早，临床表现重，且
死亡率高。多数SCID是由于免疫相关基因的异常造成的，而SCID的主要遗传方式包括X连锁
隐性遗传和常染色体隐性遗传两种。该病发病具有一定的区域性和血缘性，且由于存在X连
锁隐性遗传的特性，该病多见于男性患者。
出现发育、分化、增值、代谢或功能障碍。1950年，Glanzmann和Riniker首次报道了人类婴儿
中的SCID病。在全球，SCID的新生儿发病率约为1/50000，该病发病年龄早，临床表现重，且
死亡率高。多数SCID是由于免疫相关基因的异常造成的，而SCID的主要遗传方式包括X连锁
隐性遗传和常染色体隐性遗传两种。该病发病具有一定的区域性和血缘性，且由于存在X连
锁隐性遗传的特性，该病多见于男性患者。
[0003] 目前，针对于SCID的治疗手段主要包括骨髓或造血干细胞移植和基因治疗。骨髓或干细胞移植是治疗SCID的最佳方案，但是寻找与患者合适配型的供体相当困难。
[0004] 由常染色体隐性遗传导致的SCID，又分为核苷酸代谢相关酶缺陷和主要组织相容性复合体分子缺陷(major histocompatibility complex,MHC)引起的SCID。核苷酸代谢相
关酶中的嘌呤核苷酸化酶相关基因ADA的缺陷会导致细胞内核苷酸代谢产物dATP或dGTP的
大量富集，这些产物对淋巴细胞具有选择毒性作用，从而造成淋巴细胞的功能障碍、受损或
死亡，进而引发SCID。主要组织相容性复合体分子缺陷导致的SCID是因6号染色体短臂的
MHC异常所致，其又分为MHC I类和MHC II类缺陷。I类为TAP基因缺陷造成MHC I类分子结构
不稳定所致；II类为SLA‑DQA、SLA‑DRA等基因缺陷造成MHC II类分子不表达或低表达所致。
MHC分子的功能故障会导致T细胞无法识别抗原信号，从而引起其相关的免疫应答缺失，进
而引发SCID。
关酶中的嘌呤核苷酸化酶相关基因ADA的缺陷会导致细胞内核苷酸代谢产物dATP或dGTP的
大量富集，这些产物对淋巴细胞具有选择毒性作用，从而造成淋巴细胞的功能障碍、受损或
死亡，进而引发SCID。主要组织相容性复合体分子缺陷导致的SCID是因6号染色体短臂的
MHC异常所致，其又分为MHC I类和MHC II类缺陷。I类为TAP基因缺陷造成MHC I类分子结构
不稳定所致；II类为SLA‑DQA、SLA‑DRA等基因缺陷造成MHC II类分子不表达或低表达所致。
MHC分子的功能故障会导致T细胞无法识别抗原信号，从而引起其相关的免疫应答缺失，进
而引发SCID。
[0005] X连锁隐性遗传导致的SCID是最常见的一种类型，其致病突变为编码IL‑2Rγ链的IL2RG基因发生突变，从而导致IL‑2Rγ链功能发生障碍。而IL‑2Rγ链也被称为共有γ链
(common gamma chain)，是IL‑2、IL‑4和IL‑7等多种参与调控免疫细胞分化、发育、成熟过
程的细胞因子受体与其相应配体结合后，向免疫细胞内部转导信号时所共同使用的信号转
导分子。因此，共有γ链的功能障碍会导致免疫细胞的功能或发育异常，从而引发SCID。
(common gamma chain)，是IL‑2、IL‑4和IL‑7等多种参与调控免疫细胞分化、发育、成熟过
程的细胞因子受体与其相应配体结合后，向免疫细胞内部转导信号时所共同使用的信号转
导分子。因此，共有γ链的功能障碍会导致免疫细胞的功能或发育异常，从而引发SCID。
[0006] 作为大动物，猪是人类长期以来主要的肉食来源动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面的要求较低，同时猪体型大小和器官功能与人类近似，是理
想的人类疾病模型动物。另外，在进行研究生物活性大分子或细胞治疗的效果时，用异源动
物进行试验将会产生免疫排斥，从而无法进行有效的动物试验。而用重症联合免疫缺陷模
式动物则可避免异种间的免疫排斥问题。因此，研发出人类SCID猪模型用于进行药物(特别
是生物活性分子)筛选、药效检测、疾病病理、基因及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床
应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类SCID疾病提供有力的实验手段。
想的人类疾病模型动物。另外，在进行研究生物活性大分子或细胞治疗的效果时，用异源动
物进行试验将会产生免疫排斥，从而无法进行有效的动物试验。而用重症联合免疫缺陷模
式动物则可避免异种间的免疫排斥问题。因此，研发出人类SCID猪模型用于进行药物(特别
是生物活性分子)筛选、药效检测、疾病病理、基因及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床
应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类SCID疾病提供有力的实验手段。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种制备ADDI四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种制备ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因这
四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。
四个基因联合敲除的重症免疫缺陷猪源重组细胞的方法、sgRNA组合、质粒组合和试剂盒。
[0008] 本发明提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将质粒pKG‑T6gRNA(ADA‑g7)、质粒pKG‑T6gRNA(DQA‑gn2)、质粒pKG‑T6gRNA(DRA‑g1)、质粒pKG‑T6gRNA(IL2RG‑g7)和
质粒pKG‑GE3共转染猪细胞，得到ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均发生突变的重
组细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具
体可为从江香猪。
质粒pKG‑GE3共转染猪细胞，得到ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均发生突变的重
组细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具
体可为从江香猪。
[0009] 所述方法制备得到的重组细胞也属于本发明的保护范围。
[0010] 具体来说，所述重组细胞可为如下任一：表1至表4中编号为6、12、29、31、45、52的单克隆细胞株。
[0011] 本发明还保护所述重组细胞在制备免疫缺陷动物模型中的应用。制备免疫缺陷动物模型时，将所述重组细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺
陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模
型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模
型。
陷动物模型。还可以用免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模
型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞模型。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模
型。
[0012] 本发明还提供了sgRNA组合，由sgRNAADA‑g7、sgRNADQA‑gn2、sgRNADRA‑g1和sgRNAIL2RG‑g7组成。
[0013] 本发明还提供了质粒组合，由质粒pKG‑T6gRNA(ADA‑g7)、质粒pKG‑T6gRNA(DQA‑gn2)、质粒pKG‑T6gRNA(DRA‑g1)和质粒pKG‑T6gRNA(IL2RG‑g7)组成。
[0014] 本发明还提供了一种试剂盒，包括所述sgRNA组合。
[0015] 本发明还提供了一种试剂盒，包括所述质粒组合。所述试剂盒还包括质粒pKG‑GE3。
[0016] 本发明还保护所述sgRNA组合在制备试剂盒中的应用。
[0017] 本发明还保护所述质粒组合在制备试剂盒中的应用。
[0018] 本发明还保护所述质粒组合和质粒pKG‑GE3在制备试剂盒中的应用。
[0019] 以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)：(a)制备重组细胞；(b)制备免疫缺陷动物模型。制备免疫缺陷动物模型时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组细胞作为供
体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动
物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞
模型。所述动物具体可为猪。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模型。所述重
组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维
细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用免疫缺陷动
物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免疫缺陷细胞
模型。所述动物具体可为猪。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模型。所述重
组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维
细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
[0020] 本发明还保护以上任一所述sgRNA组合或以上任一所述质粒组合或以上任一所述试剂盒在制备重组细胞中的应用。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体
细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所
述猪具体可为从江香猪。
细胞为猪细胞。所述猪细胞可为猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所
述猪具体可为从江香猪。
[0021] 本发明还保护以上任一所述sgRNA组合或以上任一所述质粒组合或以上任一所述试剂盒在制备免疫缺陷动物模型中的应用。应用时，先制备所述重组细胞，然后将所述重组
细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用
免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免
疫缺陷细胞模型。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模型。所述动物具体可为
猪。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为
猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
细胞作为供体细胞采用体细胞克隆技术得到克隆动物，即为免疫缺陷动物模型。还可以用
免疫缺陷动物模型制备免疫缺陷细胞模型，即分离免疫缺陷动物模型的相应细胞，作为免
疫缺陷细胞模型。所述动物模型为猪模型。所述细胞模型为猪细胞模型。所述动物具体可为
猪。所述重组细胞为猪重组细胞。所述重组细胞的转化受体细胞为猪细胞。所述猪细胞可为
猪成纤维细胞。所述猪细胞具体可为猪原代成纤维细胞。所述猪具体可为从江香猪。
[0022] 以上任一所述重组细胞为ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均缺陷的细胞。
[0023] 以上任一所述重组细胞为ADA基因、DQA基因、DRA基因和IL2RG基因均发生突变的重组细胞。所述突变可为杂合突变(对应基因型为杂合突变型)或纯合突变(对应的基因型
为双等位基因相同突变型或双等位基因不同突变型)。
为双等位基因相同突变型或双等位基因不同突变型)。
[0024] sgRNAADA‑g7靶点：5’‑GGAGGGCGTGGTGTACGTGG‑3’。
[0025] sgRNADQA‑gn2靶点：5’‑GTAGACATTTAAGCCATAGG‑3’。
[0026] gRNADRA‑g1靶点：5’‑TCCACGTGGATATGGAAAAG‑3’。
[0027] sgRNAIL2RG‑g7靶点：5’‑TCCCTTCAGAGAATAGATAG‑3’。
[0028] 所述质粒pKG‑T6gRNA(ADA‑g7)转录得到sgRNAADA‑g7。
[0029] 所述质粒pKG‑T6gRNA(DQA‑gn2)转录得到sgRNADQA‑gn2。
[0030] 所述质粒pKG‑T6gRNA(DRA‑g1)转录得到sgRNADRA‑g1。
[0031] 所述质粒pKG‑T6gRNA(IL2RG‑g7)转录得到sgRNAIL2RG‑g7。
[0032] 所述sgRNAADA‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：11中第1‑20位核苷酸所示。
[0033] 所述sgRNADQA‑gn2的靶序列结合区如SEQ ID NO：21中第1‑20位核苷酸所示。
[0034] 所述sgRNADRA‑g1的靶序列结合区如SEQ ID NO：28中第1‑20位核苷酸所示。
[0035] 所述sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区如SEQ ID NO：40中第1‑20位核苷酸所示。
[0036] 所述sgRNAADA‑g7如SEQ ID NO：11所示。
[0037] 所述sgRNADQA‑gn2如SEQ ID NO：21所示。
[0038] 所述sgRNADRA‑g1如SEQ ID NO：28所示。
[0039] 所述sgRNAIL2RG‑g7如SEQ ID NO：40所示。
[0040] 具体来说，所述质粒pKG‑T6gRNA(ADA‑g7)借助限制性内切酶BbsI将sgRNAADA‑g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体得到的。
[0041] 具体来说。所述质粒pKG‑T6gRNA(DQA‑gn2)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNADQA‑gn2的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体得到的。
[0042] 具体来说，所述质粒pKG‑T6gRNA(DRA‑g1)借助限制性内切酶BbsI将sgRNADRA‑g1的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体得到的。
[0043] 具体来说。所述质粒pKG‑T6gRNA(IL2RG‑g7)是借助限制性内切酶BbsI将sgRNAIL2RG‑g7的靶序列结合区的编码序列插入pKG‑U6gRNA载体得到的。
[0044] 质粒pKG‑GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；
[0045] 所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；
[0046] 质粒pKG‑GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；
[0047] 质粒pKG‑GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGH poly(A)signal序列元件。
[0048] 质粒pKG‑GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。
[0049] 所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。
[0050] 所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。
[0051] 所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。
[0052] 自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
[0053] 自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。
[0054] 特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911‑6706位核苷酸所示。
[0055] CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395‑680位核苷酸所示。
[0056] EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682‑890位核苷酸所示。
[0057] WPRE序列元件如SEQ ID NO：2中第6722‑7310位核苷酸所示。
[0058] 3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382‑7615位核苷酸所示。
[0059] bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647‑7871位核苷酸所示。
[0060] 质粒pKG‑GE3具体如SEQ ID NO：2所示。
[0061] 质粒pKG‑U6gRNA中，具有SEQ ID NO：3中第2280‑2637位核苷酸所示的DNA分子。
[0062] 质粒pKG‑U6gRNA具体如SEQ ID NO：3所示。
[0063] 猪ADA基因信息：编码adenosine deaminase；位于17号染色体；GeneID为100625920，Sus scrofa。猪ADA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪ADA
基因具有12个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：5所示。猪ADA
基因为具有sgRNAADA‑g7的靶点的基因。猪ADA基因为具有SEQ ID NO：5所示区段的基因。
基因具有12个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：5所示。猪ADA
基因为具有sgRNAADA‑g7的靶点的基因。猪ADA基因为具有SEQ ID NO：5所示区段的基因。
[0064] 猪DQA基因信息：编码SLA class II histocompatibility antigen,DQ haplotype D alpha chain precurso；位于7号染色体；GeneID为100153387，Sus scrofa。
猪DQA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：14所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DQA
基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：15所示(本发明
中江香猪的测序结果)。猪DQA基因为具有sgRNADQA‑gn2的靶点的基因。猪DQA基因为具有SEQ
ID NO：15所示区段的基因。
猪DQA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：14所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DQA
基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：15所示(本发明
中江香猪的测序结果)。猪DQA基因为具有sgRNADQA‑gn2的靶点的基因。猪DQA基因为具有SEQ
ID NO：15所示区段的基因。
[0065] 猪DRA基因信息：编码MHC class II DR‑alpha precursor；位于7号染色体；GeneID为100135040，Sus scrofa。猪DRA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：26所示(NCBI中的
示例性序列)。基因组DNA中，猪DRA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp
序列如SEQ ID NO：27所示(本发明中江香猪的测序结果)。猪DRA基因为具有sgRNADRA‑g1的靶
点的基因。猪DRA基因为具有SEQ ID NO：27所示区段的基因。
示例性序列)。基因组DNA中，猪DRA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp
序列如SEQ ID NO：27所示(本发明中江香猪的测序结果)。猪DRA基因为具有sgRNADRA‑g1的靶
点的基因。猪DRA基因为具有SEQ ID NO：27所示区段的基因。
[0066] 猪IL2RG基因信息：编码interleukin 2receptor subunit gamma；位于X染色体；GeneID为397156，Sus scrofa。猪IL2RG基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：32所示。基因组DNA
中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：33
所示。猪IL2RG基因为具有sgRNAIL2RG‑g7的靶点的基因。猪DRA基因为具有SEQ ID NO：33所示
区段的基因。
中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：33
所示。猪IL2RG基因为具有sgRNAIL2RG‑g7的靶点的基因。猪DRA基因为具有SEQ ID NO：33所示
区段的基因。
[0067] 以上任一所述免疫缺陷具体可为重症免疫缺陷。
[0068] 本发明可用于通过基因编辑手段获得重症免疫缺陷猪模型，用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实
验数据，为今后治愈人类重症免疫缺陷打下坚实基础。
验数据，为今后治愈人类重症免疫缺陷打下坚实基础。
[0069] 与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
[0070] (1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。目前未有任何大动物重症免疫缺陷模型被成功研发。大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、
生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，
95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类
是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6‑7岁开始交配)，且为单胎动物，群体
扩繁速度极慢，饲养成本也很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。而猪作为
模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官
大小等与人相近，在解剖学、生理学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同
时，猪的性成熟早(4‑6个月)，繁殖力高，一窝多胎，在2‑3年内即可形成一个较大群体。另
外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本较灵长类低得多；而且猪作为人类长期以来的
肉食性动物，用猪作为疾病模型动物在动物保护和伦理等方面的阻力相对较小。
生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，
95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类
是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6‑7岁开始交配)，且为单胎动物，群体
扩繁速度极慢，饲养成本也很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。而猪作为
模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官
大小等与人相近，在解剖学、生理学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同
时，猪的性成熟早(4‑6个月)，繁殖力高，一窝多胎，在2‑3年内即可形成一个较大群体。另
外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本较灵长类低得多；而且猪作为人类长期以来的
肉食性动物，用猪作为疾病模型动物在动物保护和伦理等方面的阻力相对较小。
[0071] (2)采用本发明改造的cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体显著提高。
[0072] (3)与采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型(纯合突变包括双等位基因相同突变和双等位基因不
同突变、杂合突变或野生型)，获得纯合突变的概率为10％～20％；另外，利用所得到的纯合
突变单克隆细胞株进行体细胞核移植可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯
合突变可稳定遗传。
同突变、杂合突变或野生型)，获得纯合突变的概率为10％～20％；另外，利用所得到的纯合
突变单克隆细胞株进行体细胞核移植可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯
合突变可稳定遗传。
[0073] 本发明为重症免疫缺陷猪模型的制备奠定了坚实的基础，对于重症免疫缺陷药物的研发具有重大应用价值。
附图说明
[0074] 图1为质粒pX330的结构示意图。
[0075] 图2为质粒pKG‑GE3的结构示意图。
[0076] 图3为质粒pKG‑U6gRNA的结构示意图。
[0077] 图4为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG‑U6gRNA的示意图。
[0078] 图5为实施例2的步骤三中MSTN三组的电泳图。
[0079] 图6为实施例2的步骤三中FNDC5三组的电泳图。
[0080] 图7为实施例3的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用ADA‑GT‑F259/ADA‑GT‑R1005组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
[0081] 图8为实施例3的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
[0082] 图9为实施例3的步骤四中的测序峰图。
[0083] 图10为实施例4的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用DQA‑GT‑F534/DQA‑GT‑R1332组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
[0084] 图11为实施例4的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
[0085] 图12为实施例4的步骤四中的测序峰图。
[0086] 图13为实施例5的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用DRA‑GT‑F326/DRA‑GT‑R1192组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
[0087] 图14为实施例5的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
[0088] 图15为实施例5的步骤四中的测序峰图。
[0089] 图16为实施例6的步骤一中以8只猪的基因组DNA为模板采用IL2RG‑GT‑F4543/IL2RG‑GT‑R5180组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。
[0090] 图17为实施例6的步骤三中各种具有粘性末端的双链DNA分子。
[0091] 图18为实施例6的步骤四中的测序峰图。
[0092] 图19为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用ADA‑nnF229和ADA‑nnR456组成的引物对)。
[0093] 图20为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用DQA‑F643和DQA‑R1022组成的引物对)。
[0094] 图21为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用DRA‑F573和DRA‑R968组成的引物对)。
[0095] 图22为实施例7中得到的单克隆细胞的靶基因PCR产物电泳图(采用IL2RG‑nF33和IL2RG‑nR460组成的引物对)。
[0096] 图23为表1中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
[0097] 图24为表2中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
[0098] 图25为表3中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
[0099] 图26为表4中部分单克隆细胞的靶基因测序峰图。
具体实施方式
[0100] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术
人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0101] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊
说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实
验，结果取平均值。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基
(Gibco)+1％Penicillin‑Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37
℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱。
说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实
验，结果取平均值。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基
(Gibco)+1％Penicillin‑Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37
℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱。
[0102] 实施例3至6中的8只猪均为刚出生从江香猪，其中雌性4只(分别命名1、2、3、4)、雄性4只(分别命名为A、B、C、D)。
[0103] 制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，除毛，然后用75﹪酒精浸泡30‑40s，然后用含5％(体积比)Penicillin‑Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然
后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消
化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培
养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为9cm的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％
左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+
10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消
化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培
养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为9cm的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％
左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+
10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
[0104] 用于实施例2至7中的猪原代成纤维细胞均获自上述命名为2的猪(雌性，血型AO)。
[0105] 实施例1、质粒的制备
[0106] 制备质粒pX330‑U6‑Chimeric_BB‑CBh‑hSpCas9，如SEQ ID NO：1所示。质粒pX330‑U6‑Chimeric_BB‑CBh‑hSpCas9，简称质粒pX330。
[0107] 制备质粒pU6gRNA eEF1a‑mNLS‑hSpCas9‑EGFP‑PURO，如SEQ ID NO：2所示。质粒pU6gRNA eEF1a‑mNLS‑hSpCas9‑EGFP‑PURO，简称质粒pKG‑GE3。
[0108] 制备质粒pKG‑U6gRNA，如SEQ ID NO：3所示。
[0109] 质粒pX330、质粒pKG‑GE3、质粒pKG‑U6gRNA均为环形质粒。
[0110] 质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440‑725位核苷酸组成CMV增强子，第727‑1208位核苷酸组成chickenβ‑actin启动子，第1304‑1324位核苷酸编码SV40核定
位信号(NLS)，第1325‑5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450‑5497位核苷酸编码
nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
位信号(NLS)，第1325‑5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450‑5497位核苷酸编码
nucleoplasmin核定位信号(NLS)。
[0111] 质粒pKG‑GE3的结构示意图见图2。SEQ ID NO：2中，第395‑680位核苷酸组成CMV增强子，第682‑890位核苷酸组成EF1a启动子，第986‑1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第
1016‑1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037‑5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162‑
5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219‑5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第
5276‑5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为
“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨
基酸残基之间)，第5333‑6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056‑6109位核苷酸编码自裂解多
肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C
端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110‑6703位核苷酸编码
Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722‑7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382‑7615位
核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647‑7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ
ID NO：2中，第911‑6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽
T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白
和具有Puro蛋白的蛋白。
1016‑1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037‑5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162‑
5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219‑5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第
5276‑5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为
“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨
基酸残基之间)，第5333‑6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056‑6109位核苷酸编码自裂解多
肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C
端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110‑6703位核苷酸编码
Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722‑7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382‑7615位
核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647‑7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ
ID NO：2中，第911‑6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽
T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白
和具有Puro蛋白的蛋白。
[0112] 与质粒pX330相比，质粒pKG‑GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ‑
actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在
Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④
原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的
下游插入P2A‑EGFP‑T2A‑PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入
WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在
Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④
原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的
下游插入P2A‑EGFP‑T2A‑PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入
WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。
[0113] 质粒pKG‑U6gRNA的结构示意图见图3。SEQ ID NO：3中，第2280‑2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558‑2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子
(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG‑U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,
在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG‑U6gRNA，形成重组质粒，示意图见图4,
在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
[0114] 实施例2、质粒pX330和质粒pKG‑GE3的效果比较
[0115] 选择位于MSTN基因的两个gRNA靶点：
[0116] MSTN‑gRNA1的靶点：5’‑GCTGATTGTTGCTGGTCCCG‑3’；
[0117] MSTN‑gRNA2的靶点：5’‑TTTCCAGGCGAAGTTTACTG‑3’。
[0118] 选择位于FNDC5基因的两个gRNA靶点：
[0119] FNDC5‑gRNA1的靶点：5’‑TGTACTCAGTGTCCTCCTCC‑3’；
[0120] FNDC5‑gRNA2的靶点：5’‑GCTCTTCAAGACGCCTCGCG‑3’。
[0121] 用于扩增包含靶点的片段的引物为：
[0122] MSTN‑F896：5’‑TCTCTCAGACAGTGCAGGCATTA‑3’；
[0123] MSTN‑R1351：5’‑CGTTTCCGTCGTAGCGTGATAAT‑3’。
[0124] FNDC5‑F209：5’‑CAGTTCTCACTTGATGGCCTTGG‑3’；
[0125] FNDC5‑R718：5’‑AGGGGTCTGGGGAGGAATGG‑3’。
[0126] 一、制备重组质粒
[0127] 取质粒pKG‑U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
[0128] 分别合成MSTN‑1S和MSTN‑1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑1)。
[0129] 分别合成MSTN‑2S和MSTN‑2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)。
[0130] 分别合成FNDC5‑1S和FNDC5‑1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑
1)。
1)。
[0131] 分别合成FNDC5‑2S和FNDC5‑2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑
2)。
2)。
[0132] MSTN‑1S：5’‑caccGCTGATTGTTGCTGGTCCCG‑3’；
[0133] MSTN‑1A：5’‑aaacCGGGACCAGCAACAATCAGC‑3’。
[0134] MSTN‑2S：5’‑caccgTTTCCAGGCGAAGTTTACTG‑3’；
[0135] MSTN‑2A：5’‑aaacCAGTAAACTTCGCCTGGAAAc‑3’。
[0136] FNDC5‑1S：5’‑caccgTGTACTCAGTGTCCTCCTCC‑3’；
[0137] FNDC5‑1A：5’‑aaacGGAGGAGGACACTGAGTACAc‑3’。
[0138] FNDC5‑2S：5’‑caccGCTCTTCAAGACGCCTCGCG‑3’；
[0139] FNDC5‑2A：5’‑aaacCGCGAGGCGTCTTGAAGAGC‑3’。
[0140] 二、质粒pX330和质粒pKG‑GE3的效果比较
[0141] 1、共转染
[0142] MSTN‑B组：将质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑1)和质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑1)：0.46μg
质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)。
质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)。
[0143] MSTN‑330组：将质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑1)、质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA
(MSTN‑1)：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)：1.08μg质粒pX330。
(MSTN‑1)：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)：1.08μg质粒pX330。
[0144] MSTN‑KG组：将质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑1)、质粒pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA
(MSTN‑1)：质粒0.46μg pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)：1.08μg质粒pKG‑GE3。
(MSTN‑1)：质粒0.46μg pKG‑U6gRNA(MSTN‑2)：1.08μg质粒pKG‑GE3。
[0145] FNDC5‑B组：将质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑1)和质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑1)：
0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)。
0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)。
[0146] FNDC5‑330组：将质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑1)、质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG‑
U6gRNA(FNDC5‑1)：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)：1.08μg质粒pX330。
U6gRNA(FNDC5‑1)：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)：1.08μg质粒pX330。
[0147] FNDC5‑KG组：将质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑1)、质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.46μg质粒pKG‑
U6gRNA(FNDC5‑1)：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)：1.08μg质粒pKG‑GE3。
U6gRNA(FNDC5‑1)：0.46μg质粒pKG‑U6gRNA(FNDC5‑2)：1.08μg质粒pKG‑GE3。
[0148] 共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、
3pulse)。
3pulse)。
[0149] 2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16‑18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
[0150] 3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用MSTN‑F896和MSTN‑R1351组成的引物对(MSTN的三组)进行PCR扩增，或者采用FNDC5‑F209和FNDC5‑
R718组成的引物对(FNDC5的三组)进行PCR扩增，然后进行电泳。
R718组成的引物对(FNDC5的三组)进行PCR扩增，然后进行电泳。
[0151] MSTN的三组的结果见图5。
[0152] FNDC5的三组的结果见图6。
[0153] MSTN‑330组基因缺失突变效率为27.6％，MSTN‑KG组基因缺失突变效率为86.5％。FNDC5‑330组基因缺失突变效率为18.6％，FNDC5‑KG组基因缺失突变效率为81.7％。结果表
明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG‑GE3使得基因编辑效率显著提高。
明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG‑GE3使得基因编辑效率显著提高。
[0154] 实施例3、ADA基因敲除的靶点的筛选
[0155] 一、ADA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
[0156] 猪ADA基因信息：编码adenosine deaminase；位于17号染色体；
[0157] GeneID为100625920，Sus scrofa。猪ADA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：4所示。基因组DNA中，猪ADA基因具有12个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ
ID NO：5所示。
ID NO：5所示。
[0158] 分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物ADA‑GT‑F259/ADA‑GT‑R1005组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图7。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共
数据库中的ADA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本
身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：ADA‑nnF229/ADA‑nnR456。
数据库中的ADA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本
身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：ADA‑nnF229/ADA‑nnR456。
[0159] ADA‑GT‑F259：5’‑GTTAAGGATCTGGTGTTGCGGTG‑3’；
[0160] ADA‑GT‑R1005：5’‑GTTCACACTCCTAGACTCCAGCC‑3’。
[0161] ADA‑nnF229：5’‑GAGGCCGTCAAAAGGATTGC‑3’；
[0162] ADA‑nnR456：5’‑CAAAGTCTCTCTTGGGTCAGGG‑3’。
[0163] 二、筛选靶点
[0164] 通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到8个靶点。
[0165] 8个靶点分别如下：
[0166] sgRNAADA‑g1靶点：5’‑AAGGATTGCCTACGAGTTTG‑3’；
[0167] sgRNAADA‑g2靶点：5’‑TTGGAGTTGGCCAGCAGGTG‑3’；
[0168] sgRNAADA‑g3靶点：5’‑TTTCATCTCCACAAACTCGT‑3’；
[0169] sgRNAADA‑g4靶点：5’‑TCAGCCTGGTTCCAGGGGAT‑3’；
[0170] sgRNAADA‑g6靶点：5’‑CCTGCTGGCCAACTCCAAAG‑3’；
[0171] sgRNAADA‑g7靶点：5’‑GGAGGGCGTGGTGTACGTGG‑3’；
[0172] sgRNAADA‑g8靶点：5’‑CAAGGAGGGCGTGGTGTACG‑3’；
[0173] sgRNAADA‑g9靶点：5’‑TGTGGAGATGAAAGCCAAGG‑3’。
[0174] 三、制备重组质粒
[0175] 取质粒pKG‑U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
[0176] 分别合成ADA‑g1S和ADA‑g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g1)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g1))表达SEQ ID NO：6所示的sgRNAADA‑g1。
g1)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g1))表达SEQ ID NO：6所示的sgRNAADA‑g1。
[0177] SEQ ID NO：6：
[0178] AAGGAUUGCCUACGAGUUUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0179] 分别合成ADA‑g2S和ADA‑g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g2)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g2)表达SEQ ID NO：7所示的sgRNAADA‑g2。
g2)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g2)表达SEQ ID NO：7所示的sgRNAADA‑g2。
[0180] SEQ ID NO：7：
[0181] UUGGAGUUGGCCAGCAGGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0182] 分别合成ADA‑g3S和ADA‑g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g3)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g3)表达SEQ ID NO：8所示的sgRNAADA‑g3。
g3)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g3)表达SEQ ID NO：8所示的sgRNAADA‑g3。
[0183] SEQ ID NO：8：
[0184] UUUCAUCUCCACAAACUCGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0185] 分别合成ADA‑g4S和ADA‑g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g4)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g4)表达SEQ ID NO：9所示的sgRNAADA‑g4。
g4)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g4)表达SEQ ID NO：9所示的sgRNAADA‑g4。
[0186] SEQ ID NO：9：
[0187] UCAGCCUGGUUCCAGGGGAUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0188] 分别合成ADA‑g6S和ADA‑g6A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8E)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g6)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g6)表达SEQ ID NO：10所示的sgRNAADA‑g6。
g6)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g6)表达SEQ ID NO：10所示的sgRNAADA‑g6。
[0189] SEQ ID NO：10：
[0190] CCUGCUGGCCAACUCCAAAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0191] 分别合成ADA‑g7S和ADA‑g7A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8F)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g7)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g7)表达SEQ ID NO：11所示的sgRNAADA‑g7。
g7)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g7)表达SEQ ID NO：11所示的sgRNAADA‑g7。
[0192] SEQ ID NO：11：
[0193] GGAGGGCGUGGUGUACGUGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0194] 分别合成ADA‑g8S和ADA‑g8A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8G)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g8)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g8)表达SEQ ID NO：12所示的sgRNAADA‑g8。
g8)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g8)表达SEQ ID NO：12所示的sgRNAADA‑g8。
[0195] SEQ ID NO：12：
[0196] CAAGGAGGGCGUGGUGUACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0197] 分别合成ADA‑g9S和ADA‑g9A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图8H)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑
g9)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g9)表达SEQ ID NO：13所示的sgRNAADA‑g9。
g9)。质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g9)表达SEQ ID NO：13所示的sgRNAADA‑g9。
[0198] SEQ ID NO：13：
[0199] UGUGGAGAUGAAAGCCAAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0200] sgRNA‑ADA‑1S：5’‑caccgAAGGATTGCCTACGAGTTTG‑3’；
[0201] sgRNA‑ADA‑1A：5’‑aaacCAAACTCGTAGGCAATCCTTc‑3’。
[0202] sgRNA‑ADA‑2S：5’‑caccgTTGGAGTTGGCCAGCAGGTG‑3’；
[0203] sgRNA‑ADA‑2A：5’‑aaacCACCTGCTGGCCAACTCCAAc‑3’。
[0204] sgRNA‑ADA‑3S：5’‑caccgTTTCATCTCCACAAACTCGT‑3’；
[0205] sgRNA‑ADA‑3A：5’‑aaacACGAGTTTGTGGAGATGAAAc‑3’。
[0206] sgRNA‑ADA‑4S：5’‑caccgTCAGCCTGGTTCCAGGGGAT‑3’；
[0207] sgRNA‑ADA‑4A：5’‑aaacATCCCCTGGAACCAGGCTGAc‑3’。
[0208] sgRNA‑ADA‑6S：5’‑caccgCCTGCTGGCCAACTCCAAAG‑3’；
[0209] sgRNA‑ADA‑6A：5’‑aaacCTTTGGAGTTGGCCAGCAGGc‑3’。
[0210] sgRNA‑ADA‑7S：5’‑caccGGAGGGCGTGGTGTACGTGG‑3’；
[0211] sgRNA‑ADA‑7A：5’‑aaacCCACGTACACCACGCCCTCC‑3’。
[0212] sgRNA‑ADA‑8S：5’‑caccgCAAGGAGGGCGTGGTGTACG‑3’；
[0213] sgRNA‑ADA‑8A：5’‑aaacCGTACACCACGCCCTCCTTGc‑3’。
[0214] sgRNA‑ADA‑9S：5’‑caccgTGTGGAGATGAAAGCCAAGG‑3’；
[0215] sgRNA‑ADA‑9A：5’‑aaacCCTTGGCTTTCATCTCCACAc‑3’。
[0216] sgRNA‑ADA‑1S、sgRNA‑ADA‑1A、sgRNA‑ADA‑2S、sgRNA‑ADA‑2A、sgRNA‑ADA‑3S、sgRNA‑ADA‑3A、sgRNA‑ADA‑4S、sgRNA‑ADA‑4A、sgRNA‑ADA‑6S、sgRNA‑ADA‑6A、sgRNA‑ADA‑
7S、sgRNA‑ADA‑7A、sgRNA‑ADA‑8S、sgRNA‑ADA‑8A、sgRNA‑ADA‑9S、sgRNA‑ADA‑9A均为单链
DNA分子。
7S、sgRNA‑ADA‑7A、sgRNA‑ADA‑8S、sgRNA‑ADA‑8A、sgRNA‑ADA‑9S、sgRNA‑ADA‑9A均为单链
DNA分子。
[0217] 四、不同靶点的编辑效率比较
[0218] 1、共转染
[0219] 第一组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g1)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g1)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0220] 第二组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g2)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g2)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0221] 第三组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g3)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g3)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0222] 第四组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g4)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g4)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0223] 第五组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g6)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g6)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0224] 第六组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g7)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g7)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0225] 第七组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g8)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g8)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0226] 第八组：将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g9)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g9)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0227] 第九组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
[0228] 共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、
3pulse)。
3pulse)。
[0229] 2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16‑18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
[0230] 3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用ADA‑nnF229和ADA‑nnR456组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图9。
[0231] 通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第九组不同靶点的编辑效率依次为19％、17％、9％、0％、2％、35％、29％、20％和0％。结果表
明，第六组编辑效率最高，sgRNAADA‑g7为最优靶点。
明，第六组编辑效率最高，sgRNAADA‑g7为最优靶点。
[0232] 实施例4、DQA基因敲除的靶点的筛选
[0233] 一、DQA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
[0234] 猪DQA基因信息：编码SLA class II histocompatibility antigen,DQ haplotype D alpha chain precurso；位于7号染色体；GeneID为100153387，Sus scrofa。
猪DQA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：14所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DQA
基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：15所示(本发明
中从江香猪的测序结果)。
猪DQA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：14所示(NCBI中的示例性序列)。基因组DNA中，猪DQA
基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：15所示(本发明
中从江香猪的测序结果)。
[0235] 分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物DQA‑GT‑F534/DQA‑GT‑R1332组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图10。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公
共数据库中的DQA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物
本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：DQA‑F643/DQA‑R1022。
共数据库中的DQA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物
本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：DQA‑F643/DQA‑R1022。
[0236] DQA‑GT‑F534：5’‑TTGCAAAGATAAGGAGGCTTCGC‑3’；
[0237] DQA‑GT‑R1332：5’‑AGCTCTTGTTTCCCTTCTGCTCA‑3。
[0238] DQA‑F643：5’‑CAGATGAAGCCCTTGATATTTGA‑3’；
[0239] DQA‑R1022：5’‑AGAAAGGCAGAATGATGAACACA‑3’。
[0240] 二、筛选靶点
[0241] 通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到10个靶点。
[0242] 10个靶点分别如下：
[0243] sgRNADQA‑g1靶点：5’‑TTAAGCCATAGGAGGCAACA‑3’；
[0244] sgRNADQA‑g2靶点：5’‑GCCATAGGAGGCAACATGGT‑3’；
[0245] sgRNADQA‑g3靶点：5’‑CCATGAATTTGATGGCGACG‑3’；
[0246] sgRNADQA‑g4靶点：5’‑CCTCGTCGCCATCAAATTCA‑3’；
[0247] sgRNADQA‑gn1靶点：5’‑CTGGTAGACATTTAAGCCAT‑3’；
[0248] sgRNADQA‑gn2靶点：5’‑GTAGACATTTAAGCCATAGG‑3’；
[0249] sgRNADQA‑gn3靶点：5’‑TTAAATGTCTACCAGTCTTA‑3’；
[0250] sgRNADQA‑gn4靶点：5’‑AGACAGTCTCCTTCTTCCCC‑3’；
[0251] sgRNADQA‑gn5靶点：5’‑TGGGGAAGAAGGAGACTGTC‑3’；
[0252] sgRNADQA‑gn6靶点：5’‑TTGACCCACAGGGTGCACTG‑3’。
[0253] 三、制备重组质粒
[0254] 取质粒pKG‑U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
[0255] 分别合成DQA‑g1S和DQA‑g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑
g1)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g1))表达SEQ ID NO：16所示的sgRNADQA‑g1。
g1)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g1))表达SEQ ID NO：16所示的sgRNADQA‑g1。
[0256] SEQ ID NO：16：
[0257] UUAAGCCAUAGGAGGCAACAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0258] 分别合成DQA‑g2S和DQA‑g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑
g2)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g2)表达SEQ ID NO：17所示的sgRNADQA‑g2。
g2)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g2)表达SEQ ID NO：17所示的sgRNADQA‑g2。
[0259] SEQ ID NO：17：
[0260] GCCAUAGGAGGCAACAUGGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0261] 分别合成DQA‑g3S和DQA‑g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑
g3)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g3)表达SEQ ID NO：18所示的sgRNADQA‑g3。
g3)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g3)表达SEQ ID NO：18所示的sgRNADQA‑g3。
[0262] SEQ ID NO：18：
[0263] CCAUGAAUUUGAUGGCGACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0264] 分别合成DQA‑g4S和DQA‑g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑
g4)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g4)表达SEQ ID NO：19所示的sgRNADQA‑g4。
g4)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g4)表达SEQ ID NO：19所示的sgRNADQA‑g4。
[0265] SEQ ID NO：19：
[0266] CCUCGUCGCCAUCAAAUUCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0267] 分别合成DQA‑gn1S和DQA‑gn1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11E)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(DQA‑gn1)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn1)表达SEQ ID NO：20所示的sgRNADQA‑gn1。
(DQA‑gn1)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn1)表达SEQ ID NO：20所示的sgRNADQA‑gn1。
[0268] SEQ ID NO：20：
[0269] CUGGUAGACAUUUAAGCCAUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0270] 分别合成DQA‑gn2S和DQA‑gn2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11F)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(DQA‑gn2)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn2)表达SEQ ID NO：21所示的sgRNADQA‑gn2。
(DQA‑gn2)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn2)表达SEQ ID NO：21所示的sgRNADQA‑gn2。
[0271] SEQ ID NO：21：
[0272] GUAGACAUUUAAGCCAUAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0273] 分别合成DQA‑gn3S和DQA‑gn3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11G)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(DQA‑gn3)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn3)表达SEQ ID NO：22所示的sgRNADQA‑gn3。
(DQA‑gn3)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn3)表达SEQ ID NO：22所示的sgRNADQA‑gn3。
[0274] SEQ ID NO：22：
[0275] UUAAAUGUCUACCAGUCUUAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0276] 分别合成DQA‑gn4S和DQA‑gn4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11H)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(DQA‑gn4)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn4)表达SEQ ID NO：23所示的sgRNADQA‑gn4。
(DQA‑gn4)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn4)表达SEQ ID NO：23所示的sgRNADQA‑gn4。
[0277] SEQ ID NO：23：
[0278] AGACAGUCUCCUUCUUCCCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0279] 分别合成DQA‑gn5S和DQA‑gn5A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11I)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(DQA‑gn5)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn5)表达SEQ ID NO：24所示的sgRNADQA‑gn5。
(DQA‑gn5)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn5)表达SEQ ID NO：24所示的sgRNADQA‑gn5。
[0280] SEQ ID NO：24：
[0281] UGGGGAAGAAGGAGACUGUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0282] 分别合成DQA‑gn6S和DQA‑gn6A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图11J)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(DQA‑gn6)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn6)表达SEQ ID NO：25所示的sgRNADQA‑gn6。
(DQA‑gn6)。质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn6)表达SEQ ID NO：25所示的sgRNADQA‑gn6。
[0283] SEQ ID NO：25：
[0284] UUGACCCACAGGGUGCACUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0285] sgRNA‑DQA‑1S：5’‑caccgTTAAGCCATAGGAGGCAACA‑3’；
[0286] sgRNA‑DQA‑1A：5’‑aaacTGTTGCCTCCTATGGCTTAAc‑3’。
[0287] sgRNA‑DQA‑2S：5’‑caccGCCATAGGAGGCAACATGGT‑3’；
[0288] sgRNA‑DQA‑2A：5’‑aaacACCATGTTGCCTCCTATGGC‑3’。
[0289] sgRNA‑DQA‑3S：5’‑caccgCCATGAATTTGATGGCGACG‑3’；
[0290] sgRNA‑DQA‑3A：5’‑aaacCGTCGCCATCAAATTCATGGc‑3’。
[0291] sgRNA‑DQA‑4S：5’‑caccgCCTCGTCGCCATCAAATTCA‑3’；
[0292] sgRNA‑DQA‑4A：5’‑aaacTGAATTTGATGGCGACGAGGc‑3’。
[0293] sgRNA‑DQA‑n1S：5’‑caccgCTGGTAGACATTTAAGCCAT‑3’；
[0294] sgRNA‑DQA‑n1A：5’‑aaacATGGCTTAAATGTCTACCAGc‑3’。
[0295] sgRNA‑DQA‑n2S：5’‑caccGTAGACATTTAAGCCATAGG‑3’；
[0296] sgRNA‑DQA‑n2A：5’‑aaacCCTATGGCTTAAATGTCTAC‑3’。
[0297] sgRNA‑DQA‑n3S：5’‑caccgTTAAATGTCTACCAGTCTTA‑3’；
[0298] sgRNA‑DQA‑n3A：5’‑aaacTAAGACTGGTAGACATTTAAc‑3’。
[0299] sgRNA‑DQA‑n4S：5’‑caccgAGACAGTCTCCTTCTTCCCC‑3’；
[0300] sgRNA‑DQA‑n4A：5’‑aaacGGGGAAGAAGGAGACTGTCTc‑3’。
[0301] sgRNA‑DQA‑n5S：5’‑caccgTGGGGAAGAAGGAGACTGTC‑3’；
[0302] sgRNA‑DQA‑n5A：5’‑aaacGACAGTCTCCTTCTTCCCCAc‑3’。
[0303] sgRNA‑DQA‑n6S：5’‑caccgTTGACCCACAGGGTGCACTG‑3’；
[0304] sgRNA‑DQA‑n6A：5’‑aaacCAGTGCACCCTGTGGGTCAAc‑3’。
[0305] sgRNA‑DQA‑1S、sgRNA‑DQA‑1A、sgRNA‑DQA‑2S、sgRNA‑DQA‑2A、sgRNA‑DQA‑3S、sgRNA‑DQA‑3A、sgRNA‑DQA‑4S、sgRNA‑DQA‑4A、sgRNA‑DQA‑n1S、sgRNA‑DQA‑n1A、sgRNA‑DQA‑
n2S、sgRNA‑DQA‑n2A、sgRNA‑DQA‑n3S、sgRNA‑DQA‑n3A、sgRNA‑DQA‑n4S、sgRNA‑DQA‑n4A、
sgRNA‑DQA‑n5S、sgRNA‑DQA‑n5A、sgRNA‑DQA‑n6S、sgRNA‑DQA‑n6A均为单链DNA分子。
n2S、sgRNA‑DQA‑n2A、sgRNA‑DQA‑n3S、sgRNA‑DQA‑n3A、sgRNA‑DQA‑n4S、sgRNA‑DQA‑n4A、
sgRNA‑DQA‑n5S、sgRNA‑DQA‑n5A、sgRNA‑DQA‑n6S、sgRNA‑DQA‑n6A均为单链DNA分子。
[0306] 四、不同靶点的编辑效率比较
[0307] 1、共转染
[0308] 第一组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g1)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g1)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0309] 第二组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g2)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g2)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0310] 第三组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g3)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g3)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0311] 第四组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g4)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑g4)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0312] 第五组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn1)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn1)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0313] 第六组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn2)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn2)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0314] 第七组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn3)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn3)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0315] 第八组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn4)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn4)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0316] 第九组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn5)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn5)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0317] 第十组：将质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn6)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn6)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0318] 第十一组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
[0319] 共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、
3pulse)。
3pulse)。
[0320] 2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16‑18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
[0321] 3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用DQA‑F643和DQA‑R1022组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图12。
[0322] 通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第十一组不同靶点的编辑效率依次为35％、29％、11％、0％、12％、44％、11％、0％、12％、40％
和0％。结果表明，第六组编辑效率最高，sgRNADQA‑gn2为最优靶点。
和0％。结果表明，第六组编辑效率最高，sgRNADQA‑gn2为最优靶点。
[0323] 实施例5、DRA基因敲除的靶点的筛选
[0324] 一、DRA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
[0325] 猪DRA基因信息：编码MHC class II DR‑alpha precursor；位于7号染色体；GeneID为100135040，Sus scrofa。猪DRA基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：26所示(NCBI中的
示例性序列)。基因组DNA中，猪DRA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp
序列如SEQ ID NO：27所示(本发明中从江香猪的测序结果)。
示例性序列)。基因组DNA中，猪DRA基因具有5个外显子，其中第2外显子及其上下游各500bp
序列如SEQ ID NO：27所示(本发明中从江香猪的测序结果)。
[0326] 分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物DRA‑GT‑F326/DRA‑GT‑R1192组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图13。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公
共数据库中的DRA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物
本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：DRA‑F573/DRA‑R968。
共数据库中的DRA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物
本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：DRA‑F573/DRA‑R968。
[0327] DRA‑GT‑F326：5’‑TTTCACGGACAGTCACATGGAGT‑3’；
[0328] DRA‑GT‑R1192：5’‑ATACCTAGCTCTGAAATCCGCCC‑3’。
[0329] DRA‑F573：5’‑TCATCGCCTTCTCTATTTTCCAC‑3’；
[0330] DRA‑R968：5’‑CCCCTGGAAGGAAAAGTAAGTCA‑3’。
[0331] 二、筛选靶点
[0332] 通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。
[0333] 4个靶点分别如下：
[0334] sgRNADRA‑g1靶点：5’‑TCCACGTGGATATGGAAAAG‑3’；
[0335] sgRNADRA‑g2靶点：5’‑CCCTCTTTTCCATATCCACG‑3’；
[0336] sgRNADRA‑g3靶点：5’‑AGCTGTGGACAAAGCCAACC‑3’；
[0337] sgRNADRA‑g4靶点：5’‑TGCACCCTGAGCCTCAAAGC‑3’。
[0338] 三、制备重组质粒
[0339] 取质粒pKG‑U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
[0340] 分别合成DRA‑g1S和DRA‑g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑
g1)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g1)表达SEQ ID NO：28所示的sgRNADRA‑g1。
g1)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g1)表达SEQ ID NO：28所示的sgRNADRA‑g1。
[0341] SEQ ID NO：28：
[0342] UCCACGUGGAUAUGGAAAAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0343] 分别合成DRA‑g2S和DRA‑g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑
g2)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g2)表达SEQ ID NO：29所示的sgRNADRA‑g2。
g2)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g2)表达SEQ ID NO：29所示的sgRNADRA‑g2。
[0344] SEQ ID NO：29：
[0345] CCCUCUUUUCCAUAUCCACGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0346] 分别合成DRA‑g3S和DRA‑g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑
g3)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g3)表达SEQ ID NO：30所示的sgRNADRA‑g3。
g3)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g3)表达SEQ ID NO：30所示的sgRNADRA‑g3。
[0347] SEQ ID NO：30：
[0348] AGCUGUGGACAAAGCCAACCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0349] 分别合成DRA‑g4S和DRA‑g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图14D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑
g4)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g4)表达SEQ ID NO：31所示的sgRNADRA‑g4。
g4)。质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g4)表达SEQ ID NO：31所示的sgRNADRA‑g4。
[0350] SEQ ID NO：31：
[0351] UGCACCCUGAGCCUCAAAGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0352] sgRNA‑DRA‑1S：5’‑caccgTCCACGTGGATATGGAAAAG‑3’；
[0353] sgRNA‑DRA‑1A：5’‑aaacCTTTTCCATATCCACGTGGAc‑3’。
[0354] sgRNA‑DRA‑2S：5’‑caccgCCCTCTTTTCCATATCCACG‑3’；
[0355] sgRNA‑DRA‑2A：5’‑aaacCGTGGATATGGAAAAGAGGGc‑3’。
[0356] sgRNA‑DRA‑3S：5’‑caccgAGCTGTGGACAAAGCCAACC‑3’；
[0357] sgRNA‑DRA‑3A：5’‑aaacGGTTGGCTTTGTCCACAGCTc‑3’。
[0358] sgRNA‑DRA‑4S：5’‑caccgTGCACCCTGAGCCTCAAAGC‑3’；
[0359] sgRNA‑DRA‑4A：5’‑aaacGCTTTGAGGCTCAGGGTGCAc‑3’。
[0360] sgRNA‑DRA‑1S、sgRNA‑DRA‑1A、sgRNA‑DRA‑2S、sgRNA‑DRA‑2A、sgRNA‑DRA‑3S、sgRNA‑DRA‑3A、sgRNA‑DRA‑4S、sgRNA‑DRA‑4A均为单链DNA分子。
[0361] 四、不同靶点的编辑效率比较
[0362] 1、共转染
[0363] 第一组：将质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g1)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g1)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0364] 第二组：将质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g2)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g2)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0365] 第三组：将质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g3)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g3)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0366] 第四组：将质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g4)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g4)：1.238μg质粒pKG‑GE3。
[0367] 第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
[0368] 共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、
3pulse)。
3pulse)。
[0369] 2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16‑18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
[0370] 3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用DRA‑F573和DRA‑R968组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图15。
[0371] 通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第五组不同靶点的编辑效率依次为52％、45％、24％、20％和0％。结果表明，第一组编辑效率
最高，sgRNADRA‑g1为最优靶点。
最高，sgRNADRA‑g1为最优靶点。
[0372] 实施例6、IL2RG基因敲除的靶点的筛选
[0373] 一、IL2RG基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析
[0374] 猪IL2RG基因信息：编码interleukin 2 receptor subunit gamma；位于X染色体；GeneID为397156，Sus scrofa。猪IL2RG基因编码的蛋白质如SEQ ID NO：32所示。基因组DNA
中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：33
所示。
中，猪IL2RG基因具有9个外显子，其中第4外显子及其上下游各500bp序列如SEQ ID NO：33
所示。
[0375] 分别以8只猪的基因组DNA为模板，采用引物IL2RG‑GT‑F4543/IL2RG‑GT‑R5180组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳，见图16。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结
果与公共数据库中的IL2RG基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引
物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：IL2RG‑nF33/IL2RG‑
nR460。
果与公共数据库中的IL2RG基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引
物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：IL2RG‑nF33/IL2RG‑
nR460。
[0376] IL2RG‑GT‑F4543：5’‑ATATAGCACAGGGGAGGGAGGAA‑3’；
[0377] IL2RG‑GT‑R5180：5’‑AGGGTGCGAAGGGTCAGATTC‑3’；
[0378] IL2RG‑nF33：5’‑CCCAGGCTTCCCACTATATTCTC‑3’；
[0379] IL2RG‑nR460：5’‑CCATTGGATCCCTCACTTCTTCT‑3’。
[0380] 二、筛选靶点
[0381] 通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到9个靶点。
[0382] 9个靶点分别如下：
[0383] sgRNAIL2RG‑g1靶点：5’‑CCTGTAGTTTTAGCGTCTGT‑3’；
[0384] sgRNAIL2RG‑g2靶点：5’‑CAACAAATGTTTGGTAGAGG‑3’；
[0385] sgRNAIL2RG‑g3靶点：5’‑GATGATAAAGTCCAGGAGTG‑3’；
[0386] sgRNAIL2RG‑g4靶点：5’‑CTGGACTTTATCATCATTAG‑3’；
[0387] sgRNAIL2RG‑g5靶点：5’‑TTGTCCAGCTCCAGGACCCA‑3’；
[0388] sgRNAIL2RG‑g6靶点：5’‑GGCCACTATCTATTCTCTGA‑3’；
[0389] sgRNAIL2RG‑g7靶点：5’‑TCCCTTCAGAGAATAGATAG‑3’；
[0390] sgRNAIL2RG‑g8靶点：5’‑AACATTTGTTGTCCAGCTCC‑3’；
[0391] sgRNAIL2RG‑g9靶点：5’‑TGTCCAGCTCCAGGACCCAC‑3’。
[0392] 三、制备重组质粒
[0393] 取质粒pKG‑U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
[0394] 分别合成IL2RG‑g1S和IL2RG‑g1A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17A)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g1)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g1)表达SEQ ID NO：34所示的sgRNAIL2RG‑g1。
(IL2RG‑g1)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g1)表达SEQ ID NO：34所示的sgRNAIL2RG‑g1。
[0395] SEQ ID NO：34：
[0396] CCUGUAGUUUUAGCGUCUGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0397] 分别合成IL2RG‑g2S和IL2RG‑g2A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17B)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g2)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g2)表达SEQ ID NO：35所示的sgRNAIL2RG‑g2。
(IL2RG‑g2)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g2)表达SEQ ID NO：35所示的sgRNAIL2RG‑g2。
[0398] SEQ ID NO：35：
[0399] CAACAAAUGUUUGGUAGAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0400] 分别合成IL2RG‑g3S和IL2RG‑g3A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17C)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g3)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g3)表达SEQ ID NO：36所示的sgRNAIL2RG‑g3。
(IL2RG‑g3)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g3)表达SEQ ID NO：36所示的sgRNAIL2RG‑g3。
[0401] SEQ ID NO：36：
[0402] GAUGAUAAAGUCCAGGAGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0403] 分别合成IL2RG‑g4S和IL2RG‑g4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17D)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g4)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g4)表达SEQ ID NO：37所示的sgRNAIL2RG‑g4。
(IL2RG‑g4)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g4)表达SEQ ID NO：37所示的sgRNAIL2RG‑g4。
[0404] SEQ ID NO：37：
[0405] CUGGACUUUAUCAUCAUUAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0406] 分别合成IL2RG‑g5S和IL2RG‑g5A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17E)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g5)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g5)表达SEQ ID NO：38所示的sgRNAIL2RG‑g5。
(IL2RG‑g5)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g5)表达SEQ ID NO：38所示的sgRNAIL2RG‑g5。
[0407] SEQ ID NO：38：
[0408] UUGUCCAGCUCCAGGACCCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0409] 分别合成IL2RG‑g6S和IL2RG‑g6A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17F)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g6)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g6)表达SEQ ID NO：39所示的sgRNAIL2RG‑g6。
(IL2RG‑g6)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g6)表达SEQ ID NO：39所示的sgRNAIL2RG‑g6。
[0410] SEQ ID NO：39：
[0411] GGCCACUAUCUAUUCUCUGAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0412] 分别合成IL2RG‑g7S和IL2RG‑g7A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17G)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g7)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g7)表达SEQ ID NO：40所示的sgRNAIL2RG‑g7。
(IL2RG‑g7)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g7)表达SEQ ID NO：40所示的sgRNAIL2RG‑g7。
[0413] SEQ ID NO：40：
[0414] UCCCUUCAGAGAAUAGAUAGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0415] 分别合成IL2RG‑g8S和IL2RG‑g8A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17H)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g8)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g8)表达SEQ ID NO：41所示的sgRNAIL2RG‑g8。
(IL2RG‑g8)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g8)表达SEQ ID NO：41所示的sgRNAIL2RG‑g8。
[0416] SEQ ID NO：41：
[0417] AACAUUUGUUGUCCAGCUCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0418] 分别合成IL2RG‑g9S和IL2RG‑g9A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子(图17I)。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG‑U6gRNA
(IL2RG‑g9)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g9)表达SEQ ID NO：42所示的sgRNAIL2RG‑g9。
(IL2RG‑g9)。质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g9)表达SEQ ID NO：42所示的sgRNAIL2RG‑g9。
[0419] SEQ ID NO：42：
[0420] UGUCCAGCUCCAGGACCCACguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
[0421] sgRNA‑IL2RG‑1S：5’‑caccgCCTGTAGTTTTAGCGTCTGT‑3’；
[0422] sgRNA‑IL2RG‑1A：5’‑aaacACAGACGCTAAAACTACAGGc‑3’。
[0423] sgRNA‑IL2RG‑2S：5’‑caccgCAACAAATGTTTGGTAGAGG‑3’；
[0424] sgRNA‑IL2RG‑2A：5’‑aaacCCTCTACCAAACATTTGTTGc‑3’。
[0425] sgRNA‑IL2RG‑3S：5’‑caccGATGATAAAGTCCAGGAGTG‑3’；
[0426] sgRNA‑IL2RG‑3A：5’‑aaacCACTCCTGGACTTTATCATC‑3’。
[0427] sgRNA‑IL2RG‑4S：5’‑caccgCTGGACTTTATCATCATTAG‑3’；
[0428] sgRNA‑IL2RG‑4A：5’‑aaacCTAATGATGATAAAGTCCAGc‑3’。
[0429] sgRNA‑IL2RG‑5S：5’‑caccgTTGTCCAGCTCCAGGACCCA‑3’；
[0430] sgRNA‑IL2RG‑5A：5’‑aaacTGGGTCCTGGAGCTGGACAAc‑3’。
[0431] sgRNA‑IL2RG‑6S：5’‑caccgGGCCACTATCTATTCTCTGA‑3’；
[0432] sgRNA‑IL2RG‑6A：5’‑aaacTCAGAGAATAGATAGTGGCCc‑3’。
[0433] sgRNA‑IL2RG‑7S：5’‑caccgTCCCTTCAGAGAATAGATAG‑3’；
[0434] sgRNA‑IL2RG‑7A：5’‑aaacCTATCTATTCTCTGAAGGGAc‑3’。
[0435] sgRNA‑IL2RG‑8S：5’‑caccgAACATTTGTTGTCCAGCTCC‑3’；
[0436] sgRNA‑IL2RG‑8A：5’‑aaacGGAGCTGGACAACAAATGTTc‑3’。
[0437] sgRNA‑IL2RG‑9S：5’‑caccgTGTCCAGCTCCAGGACCCAC‑3’；
[0438] sgRNA‑IL2RG‑9A：5’‑aaacGTGGGTCCTGGAGCTGGACAc‑3’。
[0439] sgRNA‑IL2RG‑1S、sgRNA‑IL2RG‑1A、sgRNA‑IL2RG‑2S、sgRNA‑IL2RG‑2A、sgRNA‑IL2RG‑3S、sgRNA‑IL2RG‑3A、sgRNA‑IL2RG‑4S、sgRNA‑IL2RG‑4A、sgRNA‑IL2RG‑5S、sgRNA‑
IL2RG‑5A、sgRNA‑IL2RG‑6S、sgRNA‑IL2RG‑6A、sgRNA‑IL2RG‑7S、sgRNA‑IL2RG‑7A、sgRNA‑
IL2RG‑8S、sgRNA‑IL2RG‑8A、sgRNA‑IL2RG‑9S、sgRNA‑IL2RG‑9A均为单链DNA分子。
IL2RG‑5A、sgRNA‑IL2RG‑6S、sgRNA‑IL2RG‑6A、sgRNA‑IL2RG‑7S、sgRNA‑IL2RG‑7A、sgRNA‑
IL2RG‑8S、sgRNA‑IL2RG‑8A、sgRNA‑IL2RG‑9S、sgRNA‑IL2RG‑9A均为单链DNA分子。
[0440] 四、不同靶点的编辑效率比较
[0441] 1、共转染
[0442] 第一组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g1)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g1)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0443] 第二组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g2)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g2)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0444] 第三组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g3)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g3)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0445] 第四组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g4)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g4)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0446] 第五组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g5)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g5)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0447] 第六组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g6)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g6)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0448] 第七组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g7)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g7)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0449] 第八组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g8)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g8)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0450] 第九组：将质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g9)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.762μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g9)：1.238μg质粒pKG‑
GE3。
GE3。
[0451] 第十组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。
[0452] 共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、
3pulse)。
3pulse)。
[0453] 2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16‑18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
[0454] 3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用IL2RG‑nF33和IL2RG‑nR460组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳并测序，结果见图18。
[0455] 通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第十组不同靶点的编辑效率依次为1％、0％、3％、5％、0％、46％、65％、18％、34％和0％。结果
表明，第七组编辑效率最高，sgRNAIL2RG‑g7为最优靶点。
表明，第七组编辑效率最高，sgRNAIL2RG‑g7为最优靶点。
[0456] 实施例7、制备ADA、DQA、DRA和IL2RG基因编辑SCID单克隆细胞
[0457] 1、共转染
[0458] 将质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g7)、质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn2)、质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g1)、质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g7)和质粒pKG‑GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个
猪原代成纤维细胞：0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g7)：0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn2)：
0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g1)：0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g7)：1.64μg质粒pKG‑
GE3。
猪原代成纤维细胞：0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(ADA‑g7)：0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(DQA‑gn2)：
0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(DRA‑g1)：0.34μg质粒pKG‑U6gRNA(IL2RG‑g7)：1.64μg质粒pKG‑
GE3。
[0459] 共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、
3pulse)。
3pulse)。
[0460] 2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16‑18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。
[0461] 3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后用完全培养液洗涤，然后用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单克隆转移到96孔板中(每个孔1个细胞，每个孔中装
有200μl完全培养液)，培养2周(每2‑3天更换新的完全培养液)。
有200μl完全培养液)，培养2周(每2‑3天更换新的完全培养液)。
[0462] 4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中)。
[0463] 5、取步骤4的6孔板，培养直至细胞长至50％丰满度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
[0464] 6、取步骤4的离心管，取细胞，提取基因组DNA，进行PCR扩增(分别采用ADA‑nnF229和ADA‑nnR456组成的引物对、DQA‑F643和DQA‑R1022组成的引物对、DRA‑F573和DRA‑R968组
成的引物对、IL2RG‑nF33和IL2RG‑nR460组成的引物对)，然后进行电泳。将猪原代成纤维细
胞作为野生型对照。
成的引物对、IL2RG‑nF33和IL2RG‑nR460组成的引物对)，然后进行电泳。将猪原代成纤维细
胞作为野生型对照。
[0465] 采用ADA‑nnF229和ADA‑nnR456组成的引物对的电泳图见图19。
[0466] 采用DQA‑F643和DQA‑R1022组成的引物对的电泳图见图20。
[0467] 采用DRA‑F573和DRA‑R968组成的引物对的电泳图见图21。
[0468] 采用IL2RG‑nF33和IL2RG‑nR460组成的引物对的电泳图见图22。
[0469] 7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。
[0470] 猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为纯合野生型。如果某一单克隆细胞的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成
纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，
该单克隆细胞的基因型为杂合型；如果某一单克隆细胞的测序结果为两种，均与猪原代成
纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，
该单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一
种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺
失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型；如果某一单克隆细胞
的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单克隆细胞的基因型为纯
合野生型。
纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，
该单克隆细胞的基因型为杂合型；如果某一单克隆细胞的测序结果为两种，均与猪原代成
纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，
该单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型；如果某一单克隆细胞的测序结果为一
种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺
失、插入或替换)，该单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型；如果某一单克隆细胞
的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单克隆细胞的基因型为纯
合野生型。
[0471] ADA基因的编辑结果见表1。编号为31、43的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为45、52的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为39的单克
隆细胞的基因型为杂合型。编号为4、6、12、14、20、28、29、34、48、50的单克隆细胞均显示为
复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基
因编辑。得到的基因编辑单克隆细胞的比率为15/73。示例性的ADA的测序峰图见图23。
隆细胞的基因型为杂合型。编号为4、6、12、14、20、28、29、34、48、50的单克隆细胞均显示为
复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断发生了基
因编辑。得到的基因编辑单克隆细胞的比率为15/73。示例性的ADA的测序峰图见图23。
[0472] 表1
[0473]
[0474]
[0475]
[0476] DQA基因的编辑结果见表2。编号为29、31、32、45、51、69的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为39、52、61的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变
型。编号为44、70、72的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为4、6、12、14、20、28、34、46、67
的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形
式，但可以判断发生了基因编辑。得到的DQA基因编辑单克隆细胞的比率为21/71。示例性的
DQA的测序峰图见图24。
型。编号为44、70、72的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为4、6、12、14、20、28、34、46、67
的单克隆细胞均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形
式，但可以判断发生了基因编辑。得到的DQA基因编辑单克隆细胞的比率为21/71。示例性的
DQA的测序峰图见图24。
[0477] 表2
[0478]
[0479]
[0480]
[0481] DRA基因的编辑结果见表3。编号为31、50的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为69的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为6、12、29、45、52的单克隆细胞
均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断
发生了基因编辑。DRA基因编辑单克隆细胞的比率为8/71。示例性的DRA的测序峰图见图25。
均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断
发生了基因编辑。DRA基因编辑单克隆细胞的比率为8/71。示例性的DRA的测序峰图见图25。
[0482] 表3
[0483]
[0484]
[0485]
[0486] IL2RG基因的编辑结果见表4。编号为12、61的单克隆细胞的基因型为双等位基因相同突变型。编号为43、45、50的单克隆细胞的基因型为双等位基因不同突变型。编号为46、
48、51、69、70的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为6、20、28、29、31、32、52的单克隆细胞
均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断
发生了基因编辑。得到的IL2RG基因编辑单克隆细胞的比率为17/72。示例性的IL2RG的测序
峰图见图26。
48、51、69、70的单克隆细胞的基因型为杂合型。编号为6、20、28、29、31、32、52的单克隆细胞
均显示为复杂的套峰，因此未能获得有效的序列，不能确定基因型和具体形式，但可以判断
发生了基因编辑。得到的IL2RG基因编辑单克隆细胞的比率为17/72。示例性的IL2RG的测序
峰图见图26。
[0487] 表4
[0488]
[0489]
[0490]
[0491] 8、完成步骤7后，挑选IL2RG、ADA、DQA和DRA基因同时敲除的单克隆细胞。
[0492] 通过分析，编号为6、12、29、31、45、52的单克隆细胞为ADA、DQA、DRA和IL2RG基因同时敲除的单克隆细胞。
[0493] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。
总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申
请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，
可以进行一些基本特征的应用。
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。
总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申
请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，
可以进行一些基本特征的应用。