一种水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列和应用

摘要

一种水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列和应用，涉及分子生物学和基因工程。克隆一个与水稻粒型发育相关的基因，通过转化水稻本身，获得这个克隆的转基因植株，通过对转基因水稻的表型观察及研究，确定基因在水稻粒型生长发育过程中的作用，为高产优质水稻新品种培育提供新的目标基因资源。提供编码水稻OsGL8蛋白的基因在粒型中的应用。从水稻染色体片段中分离克隆一种与水稻粒型相关的OsGL8基因。还包含此基因序列的重组载体，及应用此载体转化的转基因植物。OsGL8 Cas9转基因植株的谷粒粒长、粒宽和千粒重明显减少。在植物育种方面具有明显作用，具有很高应用价值，为高产优质水稻新品种培育提供新的目标基因资源。

权利要求

1.一种水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列在粒型方面中的应用，所述粒型方面为水稻粒长、粒宽、谷粒千粒重减少，其特征在于所述水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列从水稻中分离得到一个与水稻粒型发育相关的基因OsGL8（LOC_Os04g42010），基因全长3936bp，其cDNA编码区序列长1308bp，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，基因编码435个氨基酸，如SEQ ID NO. 3所示；

所述水稻粒型基因OsGL8基因的CRISPR/Cas9载体为序列表 SEQ NO：2中的第108～127位所示的DNA序列；

具体步骤如下：

（1）将水稻OsGL8基因的sgRNA片段连接于植物表达载体，形成含有水稻OsGL8基因的CRISPR/Cas9载体；

（2）将步骤（1）中的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌EHA105中，将含有CRISPR/Cas9载体的农杆菌侵染水稻愈伤，在28℃经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化，获得水稻OsGL8基因的CRISPR/Cas9转基因植株。

2.一种水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列在粒型方面中的应用，所述粒型方面为谷粒粒长增加，其特征在于所述水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列从水稻中分离得到一个与水稻粒型发育相关的基因OsGL8（LOC_Os04g42010），基因全长3936bp，其cDNA编码区序列长1308bp，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，基因编码435个氨基酸，如SEQ ID NO. 3所示；

具体步骤如下：

（1）将水稻OsGL8基因的编码区连接于植物表达载体，形成含有水稻OsGL8基因的植物过表达；

（2）将步骤（1）中的植物过表达转入农杆菌EHA105中，将含有过表达的农杆菌侵染水稻愈伤，在28℃经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化，获得水稻OsGL8基因的过表达。

说明书

一种水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，尤其是涉及一种水稻粒型基因OsGL8基因的编码序列和应用。

背景技术

[0002] 水稻(Oryza sativa L)是世界上最重要的粮食作物之一，全球50％以上人口以水稻为主食。随着世界人口的日益增长，工业化的发展使得可用的耕地面积越来越少，加上全
球气候变化加剧，导致粮食安全问题日益严重。因此，培育高产优质的水稻新品种，就成为
了解决粮食问题最有效的手段。水稻的产量构成主要由单位面积有效穗数、穗粒数和千粒
重(Xing and Zhang,2010)。水稻粒型主要包括粒长、粒宽和粒厚三个组分，是影响粒重的
关键因素之一，在灌浆程度理想的状态下，粒型直接决定水稻的粒重，一般来说，籽粒长度
越长，宽度越宽，厚度越厚，籽粒就越重。

[0003] 本申请中涉及的La蛋白作为自身免疫性抗原起初被发现于患有系统性红斑狼疮和干燥综合征的人类患者体内(Alspaugh and Tan,1975)。虽然首次发现于人类，但后来的
研究表明其同源基因广泛地存在于真核生物当中，包括酵母、昆虫、脊椎动物等，是一种高
丰度表达的细胞核磷酸化蛋白(Wolin and Cedervall,2002)。La蛋白被证实与大部分初生
的小RNA(small RNAs)有关，包括tRNA前体、5SrRNA前体和U6小核RNA以及一部分病毒编码
RNA(Kufel et al.,2000)La蛋白的特异性识别位点为3’‑UUU‑OH(Stefano 1984)，因此包
含这个结构域的RNA聚合酶III产生的前体转录本(pretRNA)和一部分RNA聚合酶II转录产
生的小RNA前体均可以被La蛋白识别并结合。这一结合可以帮助这些新合成的小RNA 免于
被外切酶剪切(Maraia and Intine，2002),起到协助装配、使其正确折叠的作用。这种La蛋
白介导的稳定结构作用是pre‑tRNAs的成熟途径所必需的，能够促进小RNA组装成功能性
RNA－蛋白质复合物，并有助于某些小RNA在核内保留(Grimm et al.,1997)。因此，La蛋白
在RNA合成过程中扮演了分子伴侣的角色。

[0004] 植物中，在拟南芥基因组数据库中用La motif结构域检索可得到8个La或者La的类似蛋白(Fleurdepine et al.,2007)。通过蛋白结构和系统发生上的比较，其中有两个可
能是真正的La蛋白，即At4g32720(At32)和At1g79880(At79)，它们在植物整个生长发育的
不同时期和不同调控条件下均有表达。At32可以恢复酿酒酵母La蛋白在非编码RNA合成中
行使的核功能且可以结合包含3’‑UUU‑OH尾巴的小RNA。可以说La蛋白的核功能是由At32行
使的，且在拟南芥中高度保守，所以将编码这一蛋白的基因命名为AtLa32。AtLa32是真正La
蛋白在拟南芥中的同源基因，主要定位在细胞核核浆，核仁腔也偶有分布。拟南芥中AtLa32
的缺失会导致胚胎致死的表型，早期球形胚时期晶胚发育不足。此外，突变的胚胎细胞呈现
核仁肥大的表型，这表明AtLa32蛋白在胚胎发生时期发挥着重要作用。

[0005] 综上所述，水稻的粒型发育受多种因素的影响，而关于La蛋白能影响水稻粒型发育的研究尚不多，对其中的机制也不是十分的清楚，本发明通过分子生物学、基因工程等方
法对拟南芥AtLa32在水稻中的同源基因OsGL8生物学功能进行了研究，进一步揭示了其在
水稻粒型的生长发育中有着重要的作用。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克隆了一个与水稻粒型发育相关的基因OsGL8，通过转化水稻本身，获得这个克隆的转基因植株，通过对转基因水稻的表型观察及研究，确定了这个基因
在水稻粒型生长发育过程中的作用，为高产优质水稻新品种培育提供新的目标基因资源。

[0007] 本发明的另一目的是提供编码水稻OsGL8蛋白的基因在粒型中的应用。

[0008] 为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

[0009] 本发明从水稻中分离得到一个基因OsGL8(LOC_Os04g42010)，基因全长3936bp，其cDNA编码区序列长1308bp，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，基因编码435个氨基酸，如
SEQ ID NO.3所示。

[0010] 根据测序验证后的该基因全长CDNA序列信息构建了该基因的超表达载体，同时构建了CRISPR/Cas9载体，它是序列表SEQ NO：2中的第108～127位所示的DNA序列。为了确定
该基因在细胞的表达部位，进一步构建了GFP载体，即根据GFP表达情况来确定基因的表达
模式，它是序列表SEQNO：2所示的DNA序列。

[0011] 本发明还提供了用于从水稻mRNA中通过反转录PCR克隆此基因OsGL8的引物序列，用来扩增水稻OsGL8基因的引物为：

[0012] Os04g42010‑CDS‑F：ATGGCCGCCGCCGCCACC

[0013] Os04g42010‑CDS‑R：TTAAGCAGCAGCATCGACTTTT

[0014] 本发明还提供含有上述水稻OsGL8基因的载体。

[0015] 本发明还提供含有上述水稻OsGL8基因载体的宿主。优选地，所述宿主为真核细胞。更优选地，所述宿主为水稻。

[0016] 本发明还提供含有上述水稻OsGL8基因的转化植物细胞。

[0017] 本发明还提供上述水稻OsGL8基因在粒型方面中的应用。

[0018] 本发明还提供一种利用转基因技术将编码水稻OsGL8的核苷酸序列转化到水稻中，以改变水稻粒型的方法，具体步骤如下：

[0019] (1)将水稻OsGL8基因的编码区或sgRNA片段连接于植物表达载体，形成含有水稻OsGL8基因的植物过表达或CRISPR/Cas9载体。

[0020] (2)将步骤(1)中的植物过表达或CRISPR/Cas9载体转入农杆菌EHA105中，将含有过表达或CRISPR/Cas9载体的农杆菌侵染水稻愈伤，(在28℃)经过共培养、除菌、抗生素筛
选和分化(大约4个月的时间)，获得水稻OsGL8基因的过表达和CRISPR/Cas9转基因植株。跟
野生型相比，过表达OsGL8的转基因水稻能够提高水稻的粒长，而Cas9转基因水稻粒长、粒
宽明显减少。

[0021] 本发明还提供了一种用于检测转基因水稻中表达量的方法，主要利用荧光定量PCR的方法。具体步骤为：取转基因水稻的叶片，用RNA提取试剂盒抽提水稻RNA，并用DNase1
消化DNA，然后反转录形成cDNA,以其为模板进行荧光定量PCR进行分析。荧光定量PCR引物
核苷酸序列为：

[0022] qPCR—Os04g42010‑F：GTGTCACCGAGGATGGGAAG

[0023] qPCR—Os04g42010‑R：GTCGAGGTAGCCTCACACTG

[0024] 本发明从水稻染色体片段中分离克隆一种与水稻粒型相关的OsGL8基因。本发明还包含此基因序列的重组载体，及应用此载体转化的转基因植物。OsGL8 Cas9转基因植株
的谷粒粒长、粒宽和千粒重明显减少。本发明提供的基因在植物育种方面具有明显的作用，
具有很高的应用价值，为高产优质水稻新品种培育提供新的目标基因资源。

附图说明

[0025] 图1为水稻OsGL8的序列同源性分析。

[0026] 图2为过表达转基因植株的PCR鉴定。在图2中，P代表阳性对照，N代表阴性对照，M代表DNA分子Marker。

[0027] 图3为过表达转基因植株中OsGL8基因的表达量检测。

[0028] 图4为Cas9转基因植株的PCR鉴定。在图4中，P代表阳性对照，N代表阴性对照，M代表DNA分子Marker。

[0029] 图5为Cas9转基因植株T0代突变类型分析。

[0030] 图6为OsGL8蛋白的瞬时表达定位。

[0031] 图7为转基因植株谷粒粒长粒宽表型图。

[0032] 图8为转基因植株谷粒粒长粒宽统计。在图8中，Bar＝1cm。

[0033] 图9为水稻OsGL8转基因植株谷粒千粒重分析。

具体实施方式

[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例将结合附图对本发明进行作进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并
不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做
的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，以下对本发
明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节
部分的描述也可以完全理解本发明。

[0035] 以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory press,1989)中所述的条
件，或按照制造厂商建议的条件。

[0036] 实施例1水稻OsGL8基因cDNA片段的克隆。

[0037] 1、RNA的提取：参照Promega公司的 Super总RNA提取试剂盒catalog#S104)。取水稻材料放入研钵，迅速用液氮冷冻并研磨，直至组织完全研磨成粉末状。将粉末
状样品迅速转移到无核酸酶的EP管中加入300～500μL裂解液体，反复吹打后加入等体积稀
释液。室温放置5min后以最大速度离心5min。小心吸取上清液体到新的1.5mL无核酸酶EP管
中，加入0.5倍上清体积的无水乙醇，用移液枪吸放3‑4次以混匀。将混合液转移到离心柱内
后12000g离心1min。弃滤液，将离心柱重新放回收集管中，向离心柱加入600μL RNA洗液，
12000g离心1min，弃滤液。向离心柱中心加入50μL DNA酶I孵育液，室温静置30min。向离心
柱加入600μLRNA洗液，12000g离心1min，弃滤液。重复一次后将离心柱重新安置于收集管
上，12000g离心2min。将离心柱转移至洗脱管上，在离心柱膜中央加入50μL无核酸酶水，室
温静置2min，12000g离心1min。将洗脱下来的洗脱液重新加回到离心柱中央，室温静置
2min，12000g离心1min再次洗脱，将RNA 保存在‑80℃。然后在分光光度计上测定RNA含量。

[0038] 2、反转录：参照Promega公司的GoScriptTM反转录试剂盒catalog#A2790，将RNA样品在70℃下孵育5min以打开高级结构，结束后立马将其置于冰上，配置以下反应体系：

[0039] (1)反应体系(20μL)为：

[0040]

[0041] (2)反应条件为：

[0042]

[0043] 将反应后样品放置4℃短期保存，‑20℃长期保存。

[0044] 3、cDNA的克隆:根据Rice Genome Annotation Project中水稻数据库信息中提供的序列信息，设计引物(SEQ ID NO.4)，采用RT‑PCR方法进行CDNA全长克隆。

[0045] 通过RT‑PCR得到一个包含有完整开放读框的编码区，长度为1308bp；回收，连接到pMD19‑T载体上，并进行测序。测序结果在DNAMAN软件上进行分析，结果显示其与水稻注释
基因LOC_Os04g42010完全匹配。

[0046] 实施例2水稻OsGL8的序列信息与同源性分析。

[0047] 本发明水稻OsGL8全长编码区的长度为1308bp，其序列如SEQ ID NO.2所示。根据全长cDNA推导出水稻OsGL8的氨基酸序列，共436个氨基酸残基，分子量为48295.8道尔顿，
等电点(PI)为5.3685，其序列如SEQ NO.3所示。

[0048] 将此蛋白在GenBank进行BLAST比对，获得与此蛋白同源的蛋白，用Clustal x软件进行比对，然后用MEGA7软件根据邻近法构建进化树(图1)。

[0049] 实施例3水稻OsGL8基因在水稻中过表达和CRISPR/Cas9及转基因植株的鉴定

[0050] 1、水稻OsGL8基因的过表达载体的构建

[0051] 根据水稻OsGL8基因的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入一个额外的碱基，以便构建过表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经
PCR扩增后，将水稻OsGL8基因的cDNA克隆至过表达载体(如pCXUN‑HA)上，测序，在保证阅读
框架正确的前提下再将该过表达载体转入农杆菌中，并转化模式植物水稻日本晴。

[0052] 根据Rice Information GateWay(RIGW)水稻数据库信息中设计的PAM位点，设计CRISPR靶标位点(sgRNA)。该靶标位点引物为：

[0053] Os04g42010‑sgRNA‑F：CTTCCTGCGGAAGACAGTCG

[0054] Os04g42010‑sgRNA‑R：CGACTGTCTTCCGCAGGAAG

[0055] 合成引物二聚体后与纯化回收后的BsaI酶切CRISPR/Cas9入门载体pU3‑sgRNA进行酶切连接，转化大肠杆菌DH5α，经菌液PCR鉴定和阳性单克隆测序，得到入门载体重组质
粒pU3‑OsGL8‑sgRNA。再通过Gateway系统与目的载体pH‑ubi‑cas9进行LR反应。

[0056] LR反应体系(5μL)如下：

[0057]

[0058] 25℃孵育2h。经过大肠杆菌转化和鉴定，最终测序正确后说明CRISPR/Cas9‑OsGL8基因编辑载体构建成功。经热激转化至农杆菌EHA105后通过农杆菌介导的转化方法，将重
组载体转化日本晴水稻。

[0059] 2、农杆菌介导法来进行水稻转基因。

[0060] A诱导愈伤组织

[0061] (1)选取颗粒完好、没有霉点的水稻种子脱去种皮，用75％乙醇消毒种子3次，每次1min，用无菌水洗净。把水倒干后加入10％次氯酸钠溶液，抽真空8min，再置于摇床上180r/
min，30℃，摇15min。

[0062] (2)在超净台中倒干次氯酸钠溶液，用无菌水洗数次，平摊于事先灭过菌的装有滤纸的平皿中吸干水分，用镊子将种子接种于NBD培养基上(注意无菌操作)，胚朝下或接触培
养基，28℃暗培养21天。12～14粒/组培瓶。

[0063] B继代培养

[0064] 将愈伤周围的胚根、胚芽剥除干净，愈伤在干净滤纸上晾一下，转移至NBD继代培养基上，28℃，暗培养7～9天。

[0065] C农杆菌EHA105的培养

[0066] 将上一部分实验中得到的正确克隆的农杆菌菌液涂布于YEP抗性平板上，28℃，暗培养约36h。挑取单克隆扩大培养，待农杆菌菌液OD600为0.3～0.8时可用于侵染，4000rpm
室温离心8min后弃上层菌液，收集菌体。用适量AAM‑As培养基重悬菌体，诱导毒性，最终使
得菌液OD600值为0.6左右，避光静置半小时后用于侵染。

[0067] D.侵染与共培养

[0068] (1)挑选生长状况良好、结构紧密的愈伤组织于侵染液中浸泡，充分颠倒混匀，室温静置30min。

[0069] (2)倒掉侵染液，将愈伤组织移至装有灭菌滤纸的平皿中充分吹干，移至NBD‑As共培养培养基上，在培养基上加一张灭菌的滤纸防止农杆菌疯长，28℃暗培养3天。

[0070] (3)将愈伤转至离心管中，轻轻翻转混匀，静置15、20min，期间间隔5min混匀一次。

[0071] (4)将菌液倒出，愈伤置于无菌滤纸上吹干约1.5h以上，保证菌液吸干，接至共培养培养基上，20℃，暗培养2～3天。

[0072] E除菌

[0073] (1)将共培养3天后的愈伤组织移至三角瓶，用灭菌水清洗3次以上，直至液体比较清澈。

[0074] (2)倒出无菌水，用含有100mg/L头孢霉素和100mg/L羧苄青霉素的无菌水洗至水澄清，28℃200rpm振荡20min，3～4次。

[0075] (3)将洗净的愈伤组织倒在灭菌滤纸上充分吹干后移至筛选培养基(NBD+50mg/L潮霉素B+125mg/L头孢霉素+125mg/L羧苄青霉素)，28℃，暗培养。每15、20天可以更换一次
培养基。

[0076] F分化

[0077] 将经过筛选新长出来的愈伤转移至分化培养基(MS+2mg/L6‑BA+2mg/L KT+0.2mg/L NAA+600mg/L casamino acid+300mg/L L‑Proline+13g/L山梨醇+0.2mg/L IAA+50mg/L
潮霉素+125mg/L头孢霉素+125mg/L羧苄青霉素)28℃，16h光培养。

[0078] G生根

[0079] 将分化出来的转基因苗(>lcm高)，剥除多余的愈伤组织，并剪去根(留约0.5cm),移至1/2MS培养基中生根。28℃，16h光培养。

[0080] H炼苗与移栽

[0081] 生根结束后，可以除去生根培养基后，将苗泡于水中数日进行炼苗，然后移栽入土中生长。

[0082] 3、转基因植株的鉴定

[0083] A.过表达转基因苗鉴定

[0084] (1)剪取转基因T0代水稻叶片，用CTAB法提取水稻叶片DNA。以野生型日本晴为阴性对照(N)，载体质粒为阳性对照(P)。采用载体特异性引物UbiP  FOR和片段引物
Os04g42010‑qPCR‑R进行PCR鉴定检测转基因情况(图2)。共鉴定了20个株系，每株均能扩增
出约600bp的DNA片段，证明是过表达阳性转基因植株，阳性率为100％。

[0085] (2)并用RNA提取试剂盒抽取叶片RNA,反转录成cDNA(方法同实例2)，根据基因序列设计引物进行荧光定量PCR分析转基因水稻OsGL8基因的表达情况，具体操作按照TAKARA
公司试剂盒说明操作，荧光定量PCR仪为Applied Biosystems。相比于野生型，OsGL8超量表
达了10‑60倍不等(图3)。

[0086] B.Cas9转基因苗鉴定

[0087] 剪取转基因T0代水稻叶片，用CTAB法提取水稻叶片DNA。以日本晴野生型为阴性对照(N)，载体质粒为阳性对照(P)，采用载体骨架特异性引物Cas9 screen F/R进行PCR鉴定
检测，片段大小500bp。在检测的16棵转基因植株中都可以检测到pH‑ubi‑cas9载体片段(图
4)。Cas9载体骨架特异性引物为：

[0088] Cas9 screen‑F：CCCCAAAGAAGAAGCGCAAG

[0089] Cas9 screen‑R：CTGCACGAGCTGGATGAACA

[0090] 为鉴定Cas9转基因植株的突变位点，设计特异引物cas9‑42010JDFOR/REV扩增CRISPR位点上下游约400bp的序列并测序。测序结果显示(图5)，获得的转基因植株在目标
靶位点区域发生了不同情况的突变，其中1号和2号株系均为碱基缺失并促使后续翻译位点
形成TAA终止子序列，并且均为纯合突变。测序特异性引物为：

[0091] cas9‑Os04g42010‑JD‑F：GCCAAAGCCAAGGAGGTTC

[0092] cas9‑Os04g42010‑JD‑R：CATGGTCTCCTGCTTCACGT

[0093] 实施例4烟草中分析水稻OsGL8基因的瞬时表达

[0094] 把基因连接到瞬时表达pH7WG2载体上，转化农杆菌GV3101，用微型注射器沿着烟草叶脉把含有瞬时表达质粒的农杆菌注射到烟草叶片中，培养3天后，撕取注射位置的叶片
在激光共聚焦下观察并拍照片，结果显示(图6)此蛋白定位在细胞核。

[0095] 实施例5水稻OsGL8基因谷粒粒型和千粒重的检测

[0096] 水稻成熟后分别收取野生型、过表达和Cas突变体各株系的谷粒，置于60℃烘干箱干燥至恒重后，测量谷粒长、谷粒宽和千粒重。测定10株。

[0097] A.谷粒粒长：每样品随机挑取10粒成熟饱满的谷粒，按照首尾相连、不重叠、不留间隙的方式，在坐标纸上紧靠排成一行，测量其长度，重复两次，计算每粒的平均长度即为
粒长。结果显示跟野生型相比，OsGL8过表达转基因植株的谷粒粒长增加，OsGL8Cas9转基因
植株的谷粒粒长减小(图7和8)。

[0098] B.谷粒粒宽:每样品随机挑取10粒成熟饱满的谷粒，将此10粒谷粒按照肩靠肩(即宽度方向)在坐标纸上紧靠排成一行，测量其宽度，重复两次，计算每粒的平均宽度即为粒
宽。OsGL8Cas9转基因植株的谷粒粒宽均小于野生型(图8)。

[0099] C.谷粒千粒重：每样品随机挑取100粒成熟饱满的谷粒，称其重量，重复两次，求其平均值，最后换算成千粒重。跟野生型相比，OsGL8 Cas9转基因植株的谷粒千粒重明显减少
(图9)。