一种基于H2O2的无酶丙酮酸传感检测方法

摘要

本发明提供了一种基于H2O2的无酶丙酮酸传感检测方法，包括：采用三电极系统，所述三电极系统的电解质溶液中含有H2O2；向所述电解质溶液中加入不同浓度的丙酮酸钠，利用计时电流法获取电流响应与丙酮酸钠浓度的标准曲线；所述三电极系统的工作电极为H2O2敏感电极；根据含有H2O2和丙酮酸的待测样品溶液产生的电流响应的值，对比所述标准曲线，获得丙酮酸钠的浓度。该方法基于丙酮酸‑H2O2的去碳酸基反应，利用普鲁士蓝修饰电极在线实时监测H2O2消耗速率，从而定量获得丙酮酸浓度。采用本方法的丙酮酸浓度检测策略具有较宽的线性检测范围，可有效避免因丙酮酸氧化酶稳定性差导致的重复效果差等问题，可在复杂的生物体系中实现快速、高效的实时检测，检测限可达0.5mM。

权利要求

1.一种基于H2O2的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）：（1‑1）以普鲁士蓝修饰电极作为工作电极构建三电极系统，利用计时电流法，记录电解质溶液的电流基线对应的电流值I0；

（1‑2）向电解质溶液中加入H2O2，记录电流值I1；

（1‑3）向电解质溶液中加入不同浓度的丙酮酸钠，加入丙酮酸钠50 100s时记录电流值~

I2；

（1‑4）以电流下降百分比对丙酮酸钠浓度作图，获得标准曲线；

（2）根据含有H2O2和丙酮酸的待测样品溶液产生的电流响应的值，对比所述标准曲线，获得丙酮酸钠的浓度。

2.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述的电流响应为电流下降百分比。

3.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述电流下降百分比的计算式为 。

4.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述普鲁士蓝修饰电极由如下方法制备得到：

将基底电极进行表面预处理后置于气溶胶沉积箱中；阴离子溶液0.01‑2 M K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)6和0.01‑0.5 M KCl溶液经超声雾化器雾化成气溶胶后，通入气溶胶沉积箱中，反应若干时间；等浓度阳离子溶液0.01~2 M FeCl3或者(NH4)2Fe(SO4)2和0.01~0.5 M KCl溶液超声雾化成气溶胶后，通入气溶胶沉积箱中，反应若干时间；重复上述气溶胶沉积若干次后，烘干即得。

5.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，步骤（1‑2）中加入的H2O2的终浓度的范围是0.1~0.5 mM。

6.根据权利要求5所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，步骤（1‑2）中加入的H2O2的终浓度为0.2mM。

7.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，步骤（1‑3）中加入丙酮酸钠50s时记录电流值I2。

8.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述的电解质溶液为PBS缓冲溶液。

9.根据权利要求8所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为50mM，pH为6.5。

10.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述计时电流法的扫描电势为‑0.05V。

11.根据权利要求1所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述含有H2O2和丙酮酸的待测样品溶液为生物体系。

12.根据权利要求11所述的无酶丙酮酸传感检测方法，其特征在于，所述含有H2O2和丙酮酸的待测样品溶液为菌的发酵液。

说明书

一种基于H2O2的无酶丙酮酸传感检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于电化学传感技术领域，具体涉及一种基于丙酮酸‑H2O2去碳酸基反应的无酶丙酮酸传感电极检测方法。

背景技术

[0002] 丙酮酸是生物代谢过程中承上启下的关键中间产物，在菌株代谢生长乃至发酵阶段的过程中都具有举足轻重的地位，其浓度的检测具有反应微生物细胞生长代谢规律和发
酵状态的重要参考价值。此外，血液中丙酮酸浓度可作为维生素 B1缺乏症的诊断指标之
一，对糖尿病酮症酸中毒和阴离子隙升高性中毒的诊断和治疗也有重要的参考价值。因此，
丙酮酸浓度的快速实时监测对生物发酵生产过程、医学研究及食品安全领域有非常大的指
导作用和经济效益。

[0003] 目前测定丙酮酸(盐)的方法主要有2,4‑二硝基苯肼法，乳酸脱氢酶法和高效液相色谱法。硝基苯肼法特异性差，与丙酮、乙酰乙酸等酮酸也能形成类似的苯腙，易受到干扰；
乳酸脱氢酶法专一性强，但酶试剂昂贵，检测成本高；高效液相色谱法测量准确，但操作复
杂且耗时，不适用于在线实时检测。

[0004] 相比于传统丙酮酸检测方法，基于电化学传感的在线检测技术具有操作简单、快速高效、可自动化等特点。丙酮酸生物传感器通常以丙酮酸氧化酶(EC： 1.2.2.3)为生物酶
元件，与待测物质丙酮酸特异性反应产生H2O2信号，经H2O2检测电极采集转化为电信号，从
而实现丙酮酸浓度的测定。丙酮酸氧化酶天然酶稳定性差、易失活，是目前丙酮酸生物传感
器开发受到限制、难以广泛应用的重要原因之一。

发明内容

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于H2O2的无酶丙酮酸传感检测方法。无酶电化学传感器可有效规避生物活性物质酶易失活、酶元件与电极电化学适配性差、酶元
件脱落等问题，大大延长生物传感器使用寿命。该方法可在复杂的生物体系中实现快速、高
效的实时检测，具有较宽的线性检测范围。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

[0007] 一种基于H2O2的无酶丙酮酸传感检测方法，包括如下步骤：

[0008] (1)采用三电极系统，所述三电极系统的电解质溶液中含有H2O2；向所述电解质溶液中加入不同浓度的丙酮酸钠，利用计时电流法获取电流响应与丙酮酸钠浓度的标准曲
线；所述三电极系统的工作电极为H2O2敏感电极；

[0009] (2)根据含有H2O2和丙酮酸的待测样品溶液产生的电流响应的值，对比所述标准曲线，获得丙酮酸钠的浓度。

[0010] 所述的电流响应为电流下降百分比。

[0011] 优选的，步骤(1)具体包括如下步骤：

[0012] (1‑1)构建三电极系统，利用计时电流法，记录电解质溶液的电流基线对应的电流值I0；

[0013] (1‑2)向电解质溶液中加入H2O2，记录电流值I1；

[0014] (1‑3)向电解质溶液中加入不同浓度的丙酮酸钠，加入丙酮酸钠50～100s 时记录电流值I2；

[0015] (1‑4)以电流下降百分比对丙酮酸钠浓度作图，获得所述标准曲线。

[0016] 所述电流下降百分比的计算式为(I1‑I2)/(I1‑I0)×100％。

[0017] 优选的，所述三电极系统的工作电极为普鲁士蓝修饰电极。更优选的，所述普鲁士蓝修饰电极由专利CN101532979A的方法制备得到，具体为：

[0018] 将基底电极进行打磨、超声等表面预处理后置于气溶胶沉积箱中；阴离子溶液0.01‑2M K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)6和0.01‑0.5M KCl溶液经超声雾化器雾化成气溶胶后，通入
气溶胶沉积箱中，反应若干时间；等浓度阳离子溶液0.01～2M FeCl3或者(NH4)2Fe(SO4)2和
0.01～0.5M KCl溶液超声雾化成气溶胶后，通入气溶胶沉积箱中，反应若干时间；重复上述
气溶胶沉积若干次后，烘干即得。

[0019] 优选的，步骤(1‑1)中，待电流基线稳定后，再记录电解质溶液的电流基线对应的电流值I0。

[0020] 优选的，步骤(1‑2)中加入的H2O2的终浓度的范围是0.1～0.5mM；优选 0.2mM。

[0021] 优选的，步骤(1‑3)中加入丙酮酸钠50s时记录电流值I2。

[0022] 优选的，所述的电解质溶液为PBS缓冲溶液。更优选的，所述PBS缓冲液的浓度为50mM，pH为6.5。

[0023] 优选的，所述计时电流法的扫描电势为‑0.05V，这是优选的普鲁士蓝电极响应H2O2的最佳电势。

[0024] 优选的，所述含有H2O2和丙酮酸的待测样品溶液为生物体系。更优选的，所述含有H2O2和丙酮酸的待测样品溶液为菌的发酵液。

[0025] 本方法的有益效果在于：

[0026] (1)相比于传统丙酮酸检测方法，基于电化学传感的丙酮酸检测技术可快速、高效进行实时检测。

[0027] (2)相对于基于丙酮酸氧化酶的丙酮酸检测生物传感器，该丙酮酸浓度检测方法可有效避免目前丙酮酸氧化酶稳定性差的难题，使用寿命长，且具有较宽的线性检测范围。

[0028] (3)本发明所述的方法可在复杂的生物体系中实现快速、高效的实时检测，检测限可达0.5mM。

附图说明

[0029] 图1为普鲁士蓝修饰电极对不同浓度丙酮酸钠响应的电流值与时间变化曲线；

[0030] 图2为普鲁士蓝修饰电极对不同浓度丙酮酸钠响应的电流下降百分比与丙酮酸钠浓度的线性标准曲线。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图和具体实例对本发明进行详细说明，可以帮助更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的
本发明。

[0032] 实施例1绘制标准曲线

[0033] (1)配制50mM PBS磷酸盐缓液(pH 6.5)作为电极缓冲液；

[0034] (2)构建三电极系统，其中工作电极为普鲁士蓝修饰电极，电解质溶液为50mL 电极缓冲液，选择施加电势为‑0.05V，进行计时电流扫描，活化30min，至电流基线稳定，记录
对应的电流值I0；

[0035] (3)在电极缓冲液中加入H2O2，使得其终浓度为0.2mM，待电流值稳定后记录电流值I1；

[0036] (4)在电极缓冲液中分别添加电极缓冲液和不同浓度梯度的丙酮酸钠，使得其终浓度分别为0、1、2、4、6、8和10mM，记录电流变化，并准确记录添加丙酮酸钠溶液25s、50s、
100s和150s时的电流值I2。如图1所示，加入丙酮酸钠后，电流值出现缓慢下降，即丙酮酸钠
不断消耗检测池中H2O2，H2O2电流信号衰退。添加丙酮酸钠浓度越高，单位时间内H2O2信号衰
退越快。在添加丙酮酸钠后的50～100s，电流值与时间线性关系良好。

[0037] (5)计算电流下降百分比(I1‑I2)/(I1‑I0)×100％，绘制电流下降百分比—丙酮酸钠浓度标准曲线。如图2所示，在丙酮酸钠浓度在0～10mM范围内与电流下降百分比呈良好
的线性关系。在25s、50s、100s和150s记录电流值I2作图所得的线性关系分别为：线性方程C
2 2
＝40.29×W‑0.36，相关系数R ＝0.9841；线性方程C＝25.27×W‑0.32，相关系数R ＝
2
0.9985；线性方程 C＝16.14×W‑0.49，相关系数R＝0.9960；线性方程C＝13.13×W‑0.75，
2
相关系数R＝0.9777。其中W为电流下降百分比，C为丙酮酸钠检测池中浓度 (mM)。在50s和
100s记录电流值I2所得线性拟合结果更优，考虑到尽量缩短检测时间，在待测物添加50s时
记录电流值I2为最优选择。

[0038] 实施例2实际应用

[0039] 在丙酮丁醇梭菌、肺炎克雷伯氏菌及恶臭假单胞菌发酵液中分别外源添加终浓度为11g/L的丙酮酸钠，根据本发明提供的检测方法对样品的丙酮酸钠进行检测，在25mL含
0.2mM H2O2电极缓冲液中加入1mL待测样品，利用普鲁士蓝修饰电极实时记录电流变化。待
*
测样品中丙酮酸钠浓度 C＝(25.27×W‑0.32)×26。

[0040] (1)丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)在40mL发酵体系中37℃厌氧发酵7天，发酵液主要产物经高效气相色谱仪检测浓度，分别为12.1g/L丁醇， 6.3g/L丁酸，
2.0g/L乙醇以及1.6g/L丙酮，外源添加终浓度为11.0g/L的丙酮酸钠，为样品1。

[0041] (2)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae)在40mL发酵体系中30℃厌氧发酵3天，发酵液主要产物经高效液相色谱仪检测浓度，分别为20.3g/L丙二醇， 3.4g/L乙醇，
2.4g/L丁二醇，2.1g/L乙酸以及1.5g/L乳酸，外源添加终浓度为11.0g/L的丙酮酸钠，为样
品2。

[0042] (3)琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes 130Z)在5L发酵罐体系中 37℃发酵3天，主要产物经高效液相色谱仪检测浓度，分别为58.0g/L琥珀酸，10.1g/L富马
酸，8.5g/L乙酸以及5.3g/L乳酸，外源添加终浓度为11.0g/L的丙酮酸钠，为样品3。

[0043] 如表1所示，基于丙酮酸钠‑H2O2中和策略的无酶丙酮酸生物传感器检测方法对上述三种发酵液中外源添加丙酮酸钠的检测结果一致性良好，检测的最大相对误差约为
2.36％，可实现发酵液中丙酮酸浓度检测。本发明建立的丙酮酸检测方法的检测结果较为
准确可靠，拓宽了丙酮酸在线检测的方法，具有广阔的实际应用价值。

[0044] 表1普鲁士蓝修饰电极对预先添加一定量丙酮酸钠的三种发酵液的检测结果

[0045]样品 理论丙酮酸钠浓度g/L 实测丙酮酸钠浓度g/L 相对误差％
样品1 11.00 11.20 1.82
样品2 11.00 11.07 0.64
样品3 11.00 11.26 2.36