一种黑萝卜种质资源育种利用方法转让专利
申请号 : CN202011409578.4
文献号 : CN112535099B
文献日 : 2022-07-08
发明人 : 李晓梅 , 冉茂林 , 杨峰 , 雍晓平 , 冉科 , 陈琳
申请人 : 四川省农业科学院水稻高粱研究所
摘要 :
本发明公开了一种黑萝卜种质资源育种利用方法，相比萝卜Ogura CMS更易进行不育系的选育，以黑萝卜创制的NWB CMS不育源具有更广泛的保持系选育范围，几乎所有不包含orf463特异基因的萝卜材料(包括Ogura CMS杂交品种)均可育成相应保持系与不育系，且以NWB CMS不育系极易配制出雄性不育的杂交品种，可较好保护育种者知识产权。同时以黑萝卜中所含NWB CMS恢复基因创制的各类恢复系，不仅可用于杂交品种选育，还可用于市场上NWB CMS杂交不育品种优良性状的固定与利用，降低了种质资源丢失风险，提高了种质资源利用效率。
权利要求 :
1.一种黑萝卜种质资源育种利用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)创制不育源及选育不育系
S1：以NWB CMS线粒体基因组中的特异基因orf463设计扩增引物，所述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；
S2：以可扩增出orf463特异基因的可育黑萝卜为母本，以不能扩增出orf463特异基因的可育萝卜材料为父本，进行杂交，获得F1代群体；然后F1代群体自交，获得F2代群体；从F2代群体中分离出不育株，获得NWB CMS不育系选育的不育源；
S3：以所述不育源为母本，以不能扩增出orf463特异基因可育萝卜材料为父本，连续回交6代，父本自交，同时每代进行回交群体与自交群体性状评价与筛选，育成NWB CMS不育系和保持系；
(2)创制与选育恢复系
S1：以黑萝卜为母本，待转育萝卜材料为回交父本，进行杂交，获得F1代群体；以F1代材料为母本，用回交父本进行回交，每代筛选可育回交后代为母本，连续回交3代；回交群体再连续自交5代，获得含orf463特异基因的NWB CMS恢复系；
S2：以黑萝卜为父本，待转育可育萝卜材料为母本，进行杂交，获得F1代群体；以F1代材料为母本，待转育萝卜材料为回交父本进行回交，回交后代与NWB CMS不育系进行测交，筛选能使NWB CMS不育系育性恢复的回交后代为母本，连续回交3代，同时测交育性鉴定，回交群体性状基本与回交父本一致，再连续自交5代，自交后代与NWB CMS不育系进行测交鉴定育性，育成不含orf463特异基因的NWB CMS恢复系；
(3) NWB CMS不育品种优良性状固定
以市场上包含优良性状的NWB CMS不育品种为母本，步骤(2)中创制的NWB CMS恢复系为父本进行杂交，F1代自交，选择F2代中可育材料进行自交，同时进行性状筛选与评价，选择包含NWB CMS不育品种一个以上优良性状的材料进行自交，连续自交5代，选育出含有NWB CMS不育品种优良性状的一系列自交系，用于品种选育。
说明书 :
一种黑萝卜种质资源育种利用方法
技术领域
[0001] 本发明属于育种技术领域，具体涉及一种黑萝卜种质资源育种利用方法。
背景技术
[0002] 我国是世界上萝卜生产第一大国，年平均种植面积约120万公顷。萝卜为典型的异花授粉植物，自交衰退严重，其杂种优势明显。利用细胞质雄性不育系(cytoplasmic male sterility，CMS)做母本进行杂交制种是当前萝卜杂种优势利用的主要途径，具有杂种一代纯度高、制种成本低、亲本不易流失等优点。细胞质雄性不育是由胞质基因和核基因共同作用的一种母性遗传，线粒体基因组分子内或分子间的重组或重排，可以形成嵌合基因或新的开放阅读框(ORF)而导致不育，这种不育性可由细胞核恢复基因(Restorer fertility，Rf)恢复育性。
[0003] 1968年，日本学者小仓首次发现萝卜细胞质雄性不育类型Ogura CMS，如今该胞质类型已广泛应用于萝卜杂交品种选育，但该胞质类型的恢复基因广泛存在于各种萝卜种质资源中，需要通过大量测交或者利用恢复基因Rfo的分子标记辅助进行保持材料筛选与创制，导致Ogura CMS杂交萝卜品种选育难度加大。2005年，韩国学者Nahm首次报道NWB CMS，与Ogura CMS相比，自然界普遍缺乏该胞质类型恢复材料，说明该胞质类型极易选育相应不育系，可很好的应用于萝卜品种选育。由NWB CMS配制的杂交萝卜品种均不育，可很好保护育种者知识产权，但恢复材料的缺乏导致此类品种的优良性状难以进行育种利用，长期以往将导致大量萝卜种质资源的丢失。
[0004] 黑萝卜(Raphanus sativus L.var.niger))为普通萝卜的一个变种，在亚洲、欧洲均有分布，不仅是一种根菜，且因其富含芥子油苷等活性物质而具有一定的保健医疗作用，可用于治疗各种肝、尿、胆、胃肠道、心血管及呼吸系统疾病。中国市场上消费的萝卜以白萝卜、红萝卜、青萝卜等类型为主，黑萝卜种质资源的商品性状在育种中难以利用。近年来，诸多学者研究表明NWB CMS线粒体特异基因orf463及其恢复基因广泛分布于黑萝卜中，为黑萝卜种质资源的育种应用提供了理论依据。
发明内容
[0005] 针对上述现有技术，本发明提供一种黑萝卜种质资源育种利用方法，可显著提高萝卜品种选育效率。
[0006] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种黑萝卜种质资源育种利用方法，包括以下步骤：
[0007] (1)创制不育源及选育不育系
[0008] S1：以NWB CMS线粒体基因组中的特异基因orf463设计扩增引物；
[0009] S2：以可扩增出orf463特异基因的黑萝卜为母本，以不能扩增出orf463特异基因的可育萝卜材料为父本，进行杂交，获得F1代群体；然后F1代群体自交，获得F2代群体；从F2代群体中分离出不育株，获得NWB CMS不育系选育的不育源；
[0010] S3：以所述不育源为母本，以不能扩增出orf463特异基因可育萝卜材料为父本，连续回交6代，父本自交，同时每代进行回交群体与自交群体性状评价与筛选，育成NWB CMS不育系和保持系；
[0011] (2)创制与选育恢复系
[0012] S1：以黑萝卜为母本，待转育萝卜材料为回交父本，进行杂交，获得F1代群体；以F1代材料为母本，用回交父本进行回交，每代筛选可育回交后代为母本，连续回交3代；回交群体再连续自交5代，得到含orf463特异基因的NWB CMS恢复系；
[0013] S2：以黑萝卜为父本，待转育可育萝卜材料为母本，进行杂交，获得F1代群体；以F1代材料为母本，待转育萝卜材料为回交父本进行回交，回交后代与NWB CMS不育系进行测交，筛选能使NWB CMS不育系育性恢复的回交后代为母本，连续回交3代，同时测交育性鉴定，回交群体性状基本与回交父本一致，再连续自交5代，自交后代与NWB CMS不育系进行测交鉴定育性，育成不含orf463特异基因的NWB CMS恢复系；
[0014] (3)NWB CMS不育品种优良性状固定
[0015] 以市场上包含优良性状的NWB CMS不育品种为母本，步骤(2)中创制的NWB CMS恢复系为父本进行杂交，F1代自交，选择F2代中可育材料进行自交，同时进行性状筛选与评价，选择包含NWB CMS不育品种一个以上优良性状的材料进行自交，连续自交5代，选育出含有NWB CMS不育品种优良性状的一系列自交系，用于品种选育。
[0016] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0017] 进一步，扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明公开了一种利用黑萝卜种质资源进行萝卜NWB CMS不育系及其恢复系的选育利用方法。相比萝卜Ogura CMS更易进行不育系的选育，以黑萝卜创制的NWB CMS不育源具有更广泛的保持系选育范围，几乎所有不包含orf463特异基因的萝卜材料(包括Ogura CMS杂交品种)均可育成相应保持系与不育系，且以NWB CMS不育系极易配制出雄性不育的杂交品种，可较好保护育种者知识产权。同时以黑萝卜中所含NWB CMS恢复基因创制的各类恢复系，不仅可用于杂交品种选育，还可用于市场上NWB CMS杂交不育品种优良性状的固定与利用，降低了种质资源丢失风险，提高了种质资源利用效率。
附图说明
[0019] 图1为所用黑萝卜材料；其中，3：引自意大利的花叶黑皮白肉长根萝卜；4：引自德国的花叶黑皮白肉圆锥形萝卜；5：引自匈牙利的花叶黑皮白肉圆根形萝卜；
[0020] 图2为11份材料orf463特异分子标记PCR电泳图(M:DL2000；1‑11:试验材料)；
[0021] 图3为不同类型萝卜NWB CMS不育系，其中6～11表示保持系来源；
[0022] 图4为NWB CMS恢复系转育；其中，a：圆黑萝卜与白长萝卜杂交F1代表型；b:转育而成的白长萝卜NWB CMS恢复系；c：转育而成的圆白萝卜NWB CMS恢复系。
具体实施方式
[0023] 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0024] 实施例
[0025] 一种黑萝卜种质资源育种方法，包括以下内容。
[0026] (一)供试材料
[0027] 以从欧洲引进的3份黑萝卜种质资源(图1)及8份不同类型萝卜为试验材料开展相关研究，材料详情见表1。
[0028] 表1供试材料详情
[0029]
[0030]
[0031] (二)材料基因组DNA提取及PCR扩增
[0032] 选取萝卜幼嫩叶片，采用天根生物(北京)有限公司植物DNA通用试剂盒进行DNA提取(步骤参照试剂盒说明书)。
[0033] 根据NCBI网站上已公布的萝卜NWB CMS线粒体基因组(Genebank ID：MN056360)中特异基因orf463序列设计引物，正向引物orf463‑F序列如下：
[0034] GTGCCATTGCTGGAGTGAT(5′→3′)(SEQ ID NO.1)；
[0035] 反向引物orf463‑R序列如下：
[0036] ATTGTCCTGACGGTTCTGA(5′→3′)(SEQ ID NO.2)；
[0037] 扩增特异片段长度为1106bp。扩增体系为25μL，包含40ng DNA，2.5μL 10×Taq 2+
Plus Buffer(含Mg )，2μL 2.5mM Super pure dNTPs，0.5μL 10μM正向引物，0.5μL 10μM反向引物，0.5μL 2.5U/μL Taq Plus，用ddH2O补齐25μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，32次循环；最后72℃延伸10min。PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测。结果如图2所示，证实三份黑萝卜均含有NWB CMS胞质不育基因，由于其表现可育，说明同时含有NWB CMS恢复基因，为其育种利用打下基础。
Plus Buffer(含Mg )，2μL 2.5mM Super pure dNTPs，0.5μL 10μM正向引物，0.5μL 10μM反向引物，0.5μL 2.5U/μL Taq Plus，用ddH2O补齐25μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，32次循环；最后72℃延伸10min。PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测。结果如图2所示，证实三份黑萝卜均含有NWB CMS胞质不育基因，由于其表现可育，说明同时含有NWB CMS恢复基因，为其育种利用打下基础。
[0038] (三)NWB CMS不育源的创制及不育系的选育
[0039] 以黑萝卜材料3、4、5为母本，以材料2为父本，杂交获得F1代，然后F1代材料单株用3
2m 80目纱网罩住，放壁蜂40只自交授粉，获得大量F2代群体，从F2代群体中选择不育株作为NWB CMS不育源，以该不育源为母本，以各种类型萝卜材料(6～11)为回交父本，连续回交
5代，同时父本自交，即可育成各类相应NWB CMS不育系。结果如图3所示。
2m 80目纱网罩住，放壁蜂40只自交授粉，获得大量F2代群体，从F2代群体中选择不育株作为NWB CMS不育源，以该不育源为母本，以各种类型萝卜材料(6～11)为回交父本，连续回交
5代，同时父本自交，即可育成各类相应NWB CMS不育系。结果如图3所示。
[0040] (四)NWB CMS恢复系的创制与选育
[0041] 以长根黑萝卜4为母本，以长根萝卜材料8(来源YR白玉春，含Ogura CMS的杂交品种后代)为父本，获得F1代材料(图4‑a)，然后以F1为母本，材料8为轮回父本，每代选择可育回交后代为母本，连续回交3代，回交后代性状基本与轮回亲本一致后，进行自交，选择自交后代育性可育的材料，连续自交5代，获得花叶白皮白肉长柱形萝卜NWB CMS恢复系(图4‑b)。同理，以圆根萝卜材料7为父本，经过上述转育方法可选育圆白萝卜NWB CMS恢复系(图4‑c)。
[0042] (五)NWB CMS不育杂交品种利用
[0043] 以萝卜材料1(NWB CMS不育品种世农301)为母本，上述(四)转育而成白长萝卜NWB CMS恢复系为父本，进行杂交获得F1代材料，然后F1罩网放蜂自交，获得大量F2代群体，F2代群体可分离出花叶、板叶2种叶型材料，选择每种类型优异可育材料进行自交，连续自交5代，获得板叶、花叶白皮白肉长根类型自交系，达到利用NWB CMS不育品种优良基因的目的。
[0044] 虽然结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。