一种5-甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明提供一种5‑甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法，将5‑甲基四氢叶酸半抗原与载体蛋白相偶联制备出5‑甲基四氢叶酸抗原，运用本发明制备的5‑甲基四氢叶酸抗原免疫BALB/c小鼠获得脾细胞，再将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得能高效价分泌5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞。

权利要求

1.一种5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体由5‑甲基四氢叶酸抗原免疫BALB/c小鼠后制备得到，包括以下步骤：①将5‑甲基四氢叶酸抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活所述BALB/c小鼠腹腔内的脾细胞产生5‑甲基四氢叶酸抗体，其中所述对5‑甲基四氢叶酸抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活所述BALB/c小鼠体内的脾细胞产生5‑甲基四氢叶酸抗体的步骤包括：用100μg所述5‑甲基四氢叶酸抗原与福氏完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；3周后再用100μg所述5‑甲基四氢叶酸抗原与福氏不完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；此后每2周用50μg的5‑甲基四氢叶酸抗原注射BALB/c小鼠的腹腔，期间用载体竞争ELISA法测定血清效价；

②将所述产生5‑甲基四氢叶酸抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞，其中，将所述产生5‑甲基四氢叶酸抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞的步骤包括：采用PEG细胞融合技术将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，得到融合细胞；负筛，去除大量针对载体蛋白的阳性孔，得到5‑甲基四氢叶酸阴性克隆；正筛，用阴性和阳性血清作对照，选择阳性克隆进入下一轮筛选，得到5‑甲基四氢叶酸阳性克隆；竞争杂交瘤细胞，将所述5‑甲基四氢叶酸阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体，即为筛选出的杂交瘤细胞；

③将石蜡油注射到所述BALB/c小鼠腹腔内，10～14d天后收集腹水，所述采集到的腹水用辛酸‑饱和硫酸铵法进行纯化，计算分子量和单抗亚类；

其中，所述5‑甲基四氢叶酸抗原由5‑甲基四氢叶酸半抗原与载体蛋白通过重氮法偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白中的任意一种或多种，所述方法包括以下步骤：

①将5‑甲基四氢叶酸溶解于HCl溶液中制备5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液；

②滴加NaNO2于所述5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液中制备活化的5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液；

③用硼酸或碳酸缓冲液溶解载体蛋白，边搅拌边加入所述活化的5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液，调节pH到9.0‑9.5，制备得所述5‑甲基四氢叶酸抗原。

2.根据权利要求1所述的5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述载体竞争ELISA法测定血清效价包括步骤：①所述5‑甲基四氢叶酸抗原用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃过夜，用PBST清洗3次所述96孔酶标板，每次3分钟；

②加入载体蛋白与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40分钟，洗板3次，每次3分钟；

③加入酶标羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃，30分钟，洗板3次；

④加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10‑15分钟；

⑤加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照。

说明书

一种5‑甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及单克隆抗体检测技术领域，具体涉及一种5‑甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法。

背景技术

[0002] 5‑甲基四氢叶酸，又叫活性叶酸Folate，是天然果蔬中提取的叶酸经还原、甲基化后得到的活性叶酸，5‑甲基四氢叶酸无需代谢，直接在小肠处被人体吸收和利用。而Folic 
Acid是合成叶酸，在肝脏处进行代谢。在体内须需首先转化为蝶酰多聚谷氨酸，进而转化为
蝶酰多谷氨酸，然后转化为四氢叶酸，进一步转化为5,10亚甲基四氢叶酸，在体内亚甲基四
氢叶酸还原酶（MTHFR）作用下，转化为5‑甲基四氢叶酸后，被人体吸收和利用。叶酸缺乏不
仅会引起人类巨幼红细胞贫血，还与神经管畸形、肿瘤、心血管疾病等相关。传统意义上认
为叶酸预防出生缺陷，并不是Folic Acid的作用，而是合成叶酸转化成5‑甲基四氢叶酸后
发挥的作用，为人体甲基化（包括DNA合成与修复,调控基因表达等）提供甲基，参与血红蛋
白合成，DNA合成与修复，达到预防出生缺陷及贫血的效果。而目前市面上针对叶酸的检测
均为总叶酸，一些MTHFR基因突变导致的叶酸缺乏患者在补充大量合成叶酸后效果并不显
著，而叶酸检测值却往往偏高。因此，制备一种专门针对5‑甲基四氢叶酸的特异性抗体用于
活性叶酸检测，在临床上精准诊断叶酸缺乏症及科学指导维生素补充显得尤其重要。

[0003] 目前国内外单抗制备技术已比较成熟，但针对小分子抗体制备技术一般多为多抗，多抗一般存在批间差大，动物死亡后该多抗即停产等问题。因此，建立一种杂交瘤融合
筛选制备小分子单抗的技术显得尤为重要。5‑甲基四氢叶酸与叶酸的分子结构极为相似，
仅5号位增加了一个甲基，筛选得到的单抗与叶酸有交叉反应的可能性极大。因此，开发出
一种特异性针对5‑甲基四氢叶酸单抗，进行免疫方法的建立，对临床上叶酸相关疾病的精
准诊疗很有意义。

发明内容

[0004] 为解决上述问题，本申请提供一种5‑甲基四氢叶酸半抗原、抗原及单克隆抗体的制备方法。解决5‑甲基四氢叶酸在免疫测定中的原料问题，改进了5‑甲基四氢叶酸与叶酸
存在交叉反应的问题。具体采用5‑甲基四氢叶酸与载体蛋白的偶联物作为免疫原和检测
原，免疫BALB/c小鼠，常规细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，利
用改进的方法对融合细胞所分泌的抗体进行正筛选和负筛选；经过3次克隆，获得1株可稳
定分泌抗5‑甲基四氢叶酸的杂交瘤细胞株，该株杂交瘤细胞分泌的抗体属于IgG1亚类，相
6 8
对分子质量约为150kD，抗体滴度为3.90×10 ，抗体亲和力为5.0×10L/mol，与叶酸等类似
物没有交叉反应，而且获得的抗体能够用于5‑甲基四氢叶酸免疫学检测方法的建立。

[0005] 为实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

[0006] 第一方面，一种5‑甲基四氢叶酸半抗原，分子式结构如式(Ⅰ)所示：

[0007]

[0008] 需要说明的是，5‑甲基四氢叶酸比叶酸多一个甲基，是天然果蔬中提取的叶酸经还原、甲基化后得到的活性叶酸，5‑甲基四氢叶酸无需代谢，直接在小肠处被人体吸收和利
用。

[0009] 进一步地，基于前述半抗原的开发，本发明提供一种5‑甲基四氢叶酸抗原的制备方法，采用5‑甲基四氢叶酸半抗原与载体蛋白通过重氮法偶联得到。

[0010] 具体地，所述载体蛋白为牛血清蛋白、匙孔血蓝蛋白中的任意一种或多种。

[0011] 具体的，5‑甲基四氢叶酸抗原的制备方法包括步骤：

[0012] ①将5‑甲基四氢叶酸溶解于HCl溶液中制备5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液；

[0013] ②滴加NaNO2于所述5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液中制备活化的5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液；

[0014] ③用硼酸或碳酸缓冲液溶解载体蛋白，边搅拌边加入所述活化的5‑甲基四氢叶酸半抗原溶液，制备得所述5‑甲基四氢叶酸抗原。

[0015] 进一步地，对于上述制备的5‑甲基四氢叶酸抗原，需要通过超滤离心去除未反应的物质，并置于‑20℃下保存备用。

[0016] 根据第二方面，本发明提供一种5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体，由本发明所述5‑甲基四氢叶酸抗原免疫BALB/c小鼠后制备得到，包括如下步骤：

[0017] ①将5‑甲基四氢叶酸抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活BALB/c小鼠腹腔内的脾细胞产生5‑甲基四氢叶酸抗体；

[0018] ②将所述产生5‑甲基四氢叶酸抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞。

[0019] ③将石蜡油注射到所述BALB/c小鼠腹腔内，10～14天后收集腹水，所述采集到的腹水用辛酸‑饱和硫酸铵法进行纯化,计算分子量和单抗亚类。

[0020] 具体地，用5‑甲基四氢叶酸抗原对BALB/c小鼠进行间隔免疫，以激活所述BALB/c小鼠体内的脾细胞产生5‑甲基四氢叶酸抗体的步骤包括：

[0021] ①用100μg所述5‑甲基四氢叶酸抗原与福氏完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；

[0022] ②3周后再用100μg所述5‑甲基四氢叶酸抗原与福氏不完全佐剂按照1∶1的比例混匀，分3次注射BALB/c小鼠的腹腔，每次间隔2天；

[0023] ③此后每2周用50μg的5‑甲基四氢叶酸抗原注射BALB/c小鼠的腹腔，期间用载体竞争ELISA法测定血清效价。

[0024] 具体地，载体竞争ELISA法测定血清效价包括步骤：

[0025] ①所述5‑甲基四氢叶酸抗原用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100 μL包被96孔酶标板，4℃过夜，用PBST清洗3次所述96孔酶标板，每次3分钟；

[0026] ②加入载体蛋白与等量系列稀释的血清共100μL，37℃反应40分钟，洗板3次，每次3分钟；

[0027] ③加入酶标羊抗小鼠IgG，每孔100μL，37℃，30分钟，洗板3次；

[0028] ④加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10‑15分钟；

[0029] ⑤加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照。

[0030] 具体地，将产生5‑甲基四氢叶酸抗体的BALB/c小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合，筛选后得到能稳定分泌5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞的
步骤包括：

[0031] ①采用PEG细胞融合技术将所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，得到融合细胞；

[0032] ②负筛，去除大量针对载体蛋白和叶酸的阳性孔，得到5‑甲基四氢叶酸阴性克隆；

[0033] ③正筛，用阴性和阳性血清作对照，选择阳性克隆进入下一轮筛选，得到5‑甲基四氢叶酸阳性克隆；

[0034] ④竞争优选杂交瘤细胞；将所述5‑甲基四氢叶酸阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体，即为优选出的杂交瘤细胞。

[0035] 具体地，本发明所使用的碳酸盐缓冲液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液。

[0036] 本发明的有益效果在于：

[0037] 本发明首次提出了5‑甲基四氢叶酸半抗原和抗原，并制备了5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体，填补了国内外在本领域的技术空白。在此之前没有5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体制
备及相关技术研究，利用本发明提供的5‑甲基四氢叶酸半抗原与多种载体蛋白的偶联物制
备5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体，制备过程简便、经济、效价高、灵敏度高、实用前景大。

附图说明

[0038] 图1为5‑甲基四氢叶酸半抗原结构图。

具体实施方式

[0039] 本发明公开了一种5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领
域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通
过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所
述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0040] 对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般
原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不
会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的
最宽的范围。

[0041] 本发明提供的5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法中所用材料或试剂均可由市场购得。

[0042] 实施例一

[0043] 本实施例提供一种5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法。

[0044] 本方法所制备5‑甲基四氢叶酸抗原所运用的载体蛋白是牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumi，BSA)，所制备的5‑甲基四氢叶酸抗原为5‑甲基四氢叶酸‑BSA，采用重氮法制
备免疫原5‑甲基四氢叶酸‑BSA，操作方法如下：

[0045] a、用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。

[0046] b、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉‑碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与
淀粉反应变成蓝黑色。

[0047] c、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

[0048] d、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解4mg牛血清白蛋白BSA。

[0049] e、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

[0050] f、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。

[0051] g、未反应的物质通过超滤离心去除。

[0052] h、使其蛋白浓度为10mg/mL‑20度保存备用。

[0053] 采用重氮法制备检测原5‑甲基四氢叶酸‑KLH(Keyhole serum cyanin，KLH)，操作方法同上。此处不赘述。

[0054] 利用5‑甲基四氢叶酸抗原进行动物免疫以及效价评定包括步骤：

[0055] 首次免疫：用100μg5‑甲基四氢叶酸‑BSA与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2天；

[0056] 二次免疫：3周后再用100μg 5‑甲基四氢叶酸‑BSA与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；

[0057] 三次免疫：此后每2周用半量 5‑甲基四氢叶酸‑BSA重复腹腔加强免疫。

[0058] 免疫完成后，要用竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA 程序包括步骤：

[0059] A、将5‑甲基四氢叶酸‑KLH用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔 100μL包被96孔酶标板，置于冰箱中4℃过夜；

[0060] B、将稀释后的5‑甲基四氢叶酸‑KLH用PBST洗板3次，每次洗板3分钟；

[0061] C、加入1μg/mL的BSA与等量系列稀释的血清共100μL，在37℃的温度下反应40分钟，用PBST板洗板3次；

[0062] D、加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，用PBST板洗板3次；

[0063] E、加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10‑15分钟；

[0064] F、加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照，5
经检测血清中抗体滴度为1:2×10。

[0065] 当获得能产生5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的健康BALB/c雌性小鼠的脾细胞后，进行细胞融合与筛选实验。

[0066] 对BALB/c雌性小鼠的尾静脉加强免疫1次，3天后取其脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下正筛负筛结合法对杂交瘤细胞进
行筛选：

[0067] (1)负筛选择去除针对载体克隆：对融合细胞先用载体进行筛选：载体BSA和叶酸用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96 孔酶标板，用PBST洗板
3次，每次3分钟；加入细胞培养上清液100μL，37℃ 反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小
鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加
100μL，37℃下反应10‑15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去
除大量针对载体和叶酸的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；

[0068] (2)正筛选择针5‑甲基四氢叶酸的目标克隆：用5‑甲基四氢叶酸筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞：用5‑甲基四氢叶酸‑KLH(1μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养
上清100μL，37℃板内反应40分钟，洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，每孔100μL，
37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液， 每孔100μL，37℃下反应10‑15分
钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选
择阳性克隆进入下一轮筛选；

[0069] (3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的5‑甲基四氢叶酸阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用5‑甲基四氢叶酸‑KLH(1μg/mL)包被ELISA板， 
洗涤后加入5‑甲基四氢叶酸标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应
40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3
次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10‑15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测
仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部
为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；

[0070] 当获得能够稳定分泌5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞后，需要对BALB/c雌性小鼠进行腹水制备与抗体特性研究，包括如下步骤：

[0071] A、注射0.5～1.0mL高压灭菌的石蜡油到若干只10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔；

[0072] B、1周后再注入2×106个杂交瘤细胞至雌性BALB/c小鼠腹腔；

[0073] C、根据小鼠的腹部膨大情况，10～14天后收集雌性BALB/c小鼠腹腔的腹水，间接采用ELISA法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，并用SDS‑PAGE电泳
分析；

[0074] D、利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量，用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类，计算亲和常数。

[0075] 实施例二

[0076] 本实施例提供另一种5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的制备方法。

[0077] 其中本方法所制备的5‑甲基四氢叶酸抗原所运用的载体蛋白是匙孔血蓝蛋白(KLH)，所制备的5‑甲基四氢叶酸抗原为5‑甲基四氢叶酸‑KLH，采用重氮法制备免疫原5‑甲
基四氢叶酸‑KLH，操作方法如下：

[0078] a、用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。

[0079] b、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉‑碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与
淀粉反应变成蓝黑色。

[0080] c、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

[0081] d、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解4mg牛血清白蛋白BSA。

[0082] e、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

[0083] f、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。

[0084] g、未反应的物质通过超滤离心去除。

[0085] h、使其蛋白浓度为10mg/mL‑20度保存备用。

[0086] 采用重氮法制备检测原5‑甲基四氢叶酸BSA，操作方法同上。

[0087] 利用5‑甲基四氢叶酸抗原进行动物免疫以及效价评定包括步骤：

[0088] 首次免疫：用100μg 5‑甲基四氢叶酸‑KLH与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2天；

[0089] 二次免疫：3周后再用100μg 5‑甲基四氢叶酸‑KLH与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；

[0090] 三次免疫：此后每2周用半量 5‑甲基四氢叶酸‑KLH重复腹腔加强免疫。

[0091] 免疫完成后，要用KLH竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA 程序包括步骤：

[0092] A、将5‑甲基四氢叶酸‑KLH用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，每孔 100μL包被96孔酶标板，置于冰箱中4℃过夜；

[0093] B、将稀释后的5‑甲基四氢叶酸‑KLH用PBST洗板3次，每次洗板3分钟；

[0094] C、加入1μg/mL的KLH与等量系列稀释的血清共100μL，在37℃的温度下反应40分钟，用PBST板洗板3次；

[0095] D、加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，用PBST板洗板3次；

[0096] E、加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10‑15分钟；

[0097] F、加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性血清作对照，5
经检测血清中抗体滴度为1: 1.2×10。

[0098] 当获得能产生5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的健康BALB/c雌性小鼠的脾细胞后，进行细胞融合与筛选实验。

[0099] 对BALB/c雌性小鼠的尾静脉加强免疫1次，3天后取其脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进的正筛负筛结合法对杂交瘤
细胞进行筛选：

[0100] (1)负筛选择去除针对载体克隆：载体KLH和类似物叶酸用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，4℃过夜包被96 孔酶标板，用PBST洗板3次，每次3分钟；加入细
胞培养上清液100μL，37℃ 反应40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100
μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔加100μL，37℃下反应10‑15
分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除大量针对载体KLH和叶
酸的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；

[0101] (2)正筛选择对针5‑甲基四氢叶酸的目标克隆：用5‑甲基四氢叶酸‑BSA(1μg/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μL，37℃板内反应40分钟，洗板3次；加入酶
标羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色
液，每孔100μL，37℃下反应10‑15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光
度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；

[0102] (3)竞争优选杂交瘤细胞：经上述筛选得到的5‑甲基四氢叶酸阳性克隆再次用抗原竞争法筛选具有抗原竞争活性的抗体：用5‑甲基四氢叶酸‑BSA (1μg/mL)包被ELISA板， 
洗涤后加入5‑甲基四氢叶酸标准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50μL，37℃板内竞争反应
40分钟；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶4000)，每孔100μL，37℃下反应30分钟，洗板3
次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100μL，37℃，10‑15分钟；加入50μL终止液，酶联免疫检测
仪测定490nm处吸光度值，OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部
为阳性，即为优选出的杂交瘤细胞；

[0103] 当获得能够稳定分泌5‑甲基四氢叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞后，需要对BALB/c雌性小鼠进行腹水制备与抗体特性研究，包括如下步骤：

[0104] A、注射0.5～1.0mL高压灭菌的石蜡油到若干只10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔；

[0105] B、1周后再注入2×106个杂交瘤细胞至雌性BALB/c小鼠腹腔；

[0106] C、根据小鼠的腹部膨大情况，10～14天后收集雌性BALB/c小鼠腹腔的腹水，间接采用ELISA法测定腹水单抗效价，采用辛酸—硫酸铵法对腹水进行纯化，并用SDS‑PAGE电泳
分析；

[0107] D、利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量，用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类，计算亲和常数。

[0108] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。