一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用

摘要

本申请公开了一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原，所述免疫原包括：PreS蛋白和SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白中的至少一者，其中，PreS蛋白是通过对野生型S蛋白的关键位点进行突变而形成的，PreS蛋白具有免疫性强、可诱导产生高滴度中和抗体的优点。由所述免疫原可以衍生出包括编码所述免疫原的核苷酸序列的核酸分子、包括所述核酸分子的表达盒、包括所述核酸分子或所述表达盒的表达载体、包括所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体的转化体、由所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体转染腺病毒包装细胞并进行细胞培养而获得的重组腺病毒，以及包括所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体或所述转化体的药物组合物。

权利要求

1.一种表达载体，其特征在于，包括复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，以及编码PreS蛋白的核苷酸序列或编码SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列，其中，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4‑orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4‑orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒，所述PreS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

4.一种转化体，其特征在于，包括表达系统，以及如权利要求1至3任一项中所述的表达载体；所述表达系统为真核生物或原核生物。

5.一种重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒是将如权利要求1至3任一项中所述的表达载体转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养获得的。

6.一种重组腺病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建重组穿梭载体，所述重组穿梭载体装载有编码PreS蛋白的核苷酸序列或编码SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列；对所述重组穿梭载体进行双酶切，回收目的基因片段，所述目的基因片段包括编码所述PreS蛋白的核苷酸序列或编码所述全长S蛋白的核苷酸序列；

制备复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体为基因组中缺失E1编码区和E3编码区并且将E4‑orf6区域替换为人Ad5型腺病毒的E4‑orf6区域的AdC68型黑猩猩腺病毒；

将所述目的基因片段与所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架连接，获得表达载体；

对所述表达载体进行线性化处理；以及将线性化处理后的所述表达载体转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养，获得所述重组腺病毒；

其中，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组穿梭载体还包括基因表达调控元件，所述基因表达调控元件包括启动子和/或终止子。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项中所述的表达载体、或如权利要求4中所述的转化体、或权利要求5中所述的重组腺病毒。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。

10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为适用于肌内、皮下或粘膜施用的剂型。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂以及喷雾剂中的至少一种，适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型为注射剂。

12.根据权利要求1至3任一项中所述的表达载体、或权利要求4中所述的转化体、或权利要求5中所述的重组腺病毒、或如权利要求6中所述的制备方法制得的重组腺病毒、或权利要求8至11任一项中所述的药物组合物在制备用于治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。

说明书

一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原及其应用

技术领域

[0001] 本申请涉及生物制药领域，具体涉及一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原及其应用。

背景技术

[0002] 新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2，简称新冠病毒)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID‑19，简称新冠肺炎)的新发呼吸道病原体。SARS‑CoV‑2具有较强的传染性和较长的
潜伏期。对于COVID‑19，目前尚无证实有效的治疗方法和预防疫苗。

[0003] 目前有研究发现，新型冠状病毒SARS‑CoV‑2包括棘突蛋白(Spike,S蛋白)、包膜蛋白(Envelope,E蛋白)、膜蛋白(Membrane/matrix,M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋
白)四个结构蛋白。其中，S蛋白包括S1亚基，所述S1亚基上具有RBD结构域(Receptor 
binding domain,RBD)，通过RBD结构域与人体细胞上的ACE2受体蛋白相结合，使得SARS‑
CoV‑2感染人体细胞，即：SARS‑CoV‑2的S蛋白是决定SARS‑CoV‑2入侵人体细胞的关键蛋白。
因此，针对S蛋白的中和抗体可阻断SARS‑CoV‑2入侵人体细胞，S蛋白、S蛋白的亚基或RBD可
作为靶抗原用于制备疫苗。

[0004] COVID‑19疫苗是预防COVID‑19、防止COVID‑19疫情蔓延的有效措施之一。当前，快速研制出能够提升群体免疫水平，并且阻断COVID‑19传播的疫苗已成为最为紧迫的重大需
求。

发明内容

[0005] 本申请提供了一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原及其应用，所述免疫原可以诱导产生高滴度的中和抗体，能够应用于制备治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒感染的疫苗和/或药物。

[0006] 第一方面，本申请提供了一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原，所述免疫原包括：PreS蛋白和SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白中的至少一者。

[0007] 在一些实施方式中，所述PreS蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

[0008] 在一些实施方式中，所述全长S蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

[0009] 在与人体细胞上的ACE2受体蛋白结合之前，SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白呈现融合前的PreS构象，但PreS构象存在时间非常短暂，即：一旦所述S蛋白与所述ACE2受体蛋白相结
合，所述PreS构象迅速转变成融合后的构象，而拥有PreS构象的S蛋白具有更强的免疫原
性，可以诱导产生高滴度的中和抗体。本申请的所述PreS蛋白是通过对野生型S蛋白的关键
位点进行突变而形成，能够稳定呈现S蛋白融合前的PreS构象。

[0010] 第二方面，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括：编码PreS蛋白的核苷酸序列，以及编码SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列中的至少一者。

[0011] 在一些实施方式中，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

[0012] 在一些实施方式中，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

[0013] 第三方面，本申请提供了一种表达盒，所述表达盒包括如第二方面中所述的核酸分子。

[0014] 第四方面，本申请提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体，以及如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒。

[0015] 作为本申请的一种优选实施方案，所述载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的黑猩猩腺病毒68型
(chimpanzee adenovirus type68,AdC68)，其不能在正常人体细胞中复制生产，只能在
HEK293、Vero等细胞中复制生产，具有高度的安全性。此外，AdC68型黑猩猩腺病毒在人体中
不含有预存抗体，从而排除预存抗体对疫苗功效的抑制作用。

[0016] 进一步地，所述载体可以为pAdC68XY3。

[0017] 第五方面，本申请提供了一种转化体，所述转化体包括表达系统，以及如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体；所述
表达系统为真核生物或原核生物。

[0018] 作为所述表达系统的真核生物例如可以是酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞，所述哺乳动物细胞例如可以是COS(绿猴细胞系)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小
鼠细胞和人类细胞等。作为所述表达系统的原核生物例如可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌
等。

[0019] 第六方面，本申请提供了一种重组腺病毒，所述重组腺病毒是将如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体转染腺病
毒包装细胞，然后进行细胞培养获得的。所述重组腺病毒是基于同源重组而产生的，具有高
度的安全性。

[0020] 第七方面，本申请提供了一种重组腺病毒的制备方法，包括如下步骤：

[0021] 构建重组穿梭载体，所述重组穿梭载体装载有编码PreS蛋白的核苷酸序列和/或编码SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白的核苷酸序列；

[0022] 对所述重组穿梭载体进行双酶切，回收目的基因片段，所述目的基因片段包括编码所述PreS蛋白的核苷酸序列和/或编码所述全长S蛋白的核苷酸序列；

[0023] 制备复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架；

[0024] 将所述目的基因片段与所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒的载体骨架连接，获得表达载体；

[0025] 对所述表达载体进行线性化处理；以及

[0026] 将线性化处理后的所述表达载体转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养，获得所述重组腺病毒；

[0027] 在一些实施方式中，编码所述PreS蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

[0028] 在一些实施方式中，编码所述全长S蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；

[0029] 在一些实施方式中，所述重组穿梭载体还包括基因表达调控元件，所述基因表达调控元件包括启动子和/或终止子。

[0030] 该方法制备的重组腺病毒可以诱发机体产生针对SARS‑CoV‑2病毒的体液免疫应答和细胞免疫应答。

[0031] 第八方面，本申请提供了一种药物组合物，包括如第一方面中所述的免疫原、或如第二方面中所述的核酸分子、或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达
载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方面中所述的重组腺病毒。

[0032] 在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。

[0033] 其中，佐剂是指通过增强巨噬细胞活性促进机体T细胞或B细胞的反应，参与半抗原或抗原免疫应答的天然的或合成的物质。佐剂能增强药物组合物的特异性免疫反应，从
而提升药物组合物的免疫效果。可与本申请的药物组合物共同施用的佐剂包括但不限于干
扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、颗粒溶素、乳铁蛋白、卵白蛋白和白细胞介素。

[0034] 辅料是指生产药物组合物和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能，以使药物组合物达到一定的保质期
和生物利用度，从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请的药物组合物共同施
用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。

[0035] 在一些实施方式中，所述药物组合物适用于肌内、皮下或粘膜施用。

[0036] 在一些实施方式中，适用于粘膜施用的所述药物组合物的剂型为口服剂、气溶胶吸入剂、滴鼻剂以及喷雾剂中的至少一种。

[0037] 在一些实施方式中，适用于肌内或皮下施用的所述药物组合物的剂型为注射剂。

[0038] 本领域技术人员可以理解的是，本申请还提供了所述药物组合物的治疗方式或免疫方式，包括：鼻喷给药、滴鼻给药、气溶胶吸入式给药、肌肉注射、皮下注射、口服给药等。
优选采用鼻喷给药的治疗方式或免疫方式。

[0039] 第九方面，本申请提供了如第一方面中所述的免疫原、或如第二方面中所述的核酸分子，或如第三方面中所述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中
所述的转化体、或如第六方面中所述的重组腺病毒、或如第七方面中所述的制备方法制得
的重组腺病毒、或如第八方面中所述的药物组合物在制备用于治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒
感染的疫苗和/或药物中的用途。

[0040] 本申请还提供了一种治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒感染的方法，包括：给予对象有效量的如第一方面中所述的免疫原、或如第二方面中所述的核酸分子，或如第三方面中所
述的表达盒、或如第四方面中所述的表达载体、或如第五方面中所述的转化体、或如第六方
面中所述的重组腺病毒、或如第七方面中所述的制备方法制得的重组腺病毒、或如第八方
面中所述的药物组合物，以达到治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒感染的目的，所述给予包括鼻
喷、滴鼻、气溶胶吸入、肌肉注射、皮下注射以及口服中的一种或多种给药方式。

[0041] 本申请提供了一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原，所述免疫原包括：PreS蛋白和SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白中的至少一者，其中，PreS蛋白是通过对野生型S蛋白的关键位点进
行突变而形成的，PreS蛋白具有免疫性强、可诱导产生高滴度中和抗体的优点。由所述免疫
原可以衍生出包括编码所述免疫原的核苷酸序列的核酸分子、包括所述核酸分子的表达
盒、包括所述核酸分子或所述表达盒的表达载体、包括所述核酸分子或所述表达盒或所述
表达载体的转化体、由所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体转染腺病毒包装细胞并
进行细胞培养而获得的重组腺病毒，以及包括所述核酸分子或所述表达盒或所述表达载体
或所述转化体或所述重组腺病毒的药物组合物。

[0042] 经免疫实验发现，PreS蛋白作为免疫原诱导产生的特异性IgG抗体滴度，是SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白作为免疫原诱导产生的特异性IgG抗体滴度的三倍以上，充分说明本发
明的免疫原在制备用于治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒感染的疫苗和/或药物中具有巨大优
势。

附图说明

[0043] 下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其有益效果显而易见。

[0044] 图1为本申请实施例1中pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒的结构示意图。

[0045] 图2为本申请实施例2中PreS基因片段的鉴定电泳图谱，其中，泳道M代表Marker(DL1000)，泳道1和泳道2均代表PreS基因片段的PCR产物，白色圆圈内的条带对应为PreS基
因片段。

[0046] 图3为本申请实施例3中HK293细胞培养上清液样品和实施例7中HK293细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1
代表经rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒感染后的HK293细胞的细胞培养上清液样品(添加有
5mmol/L的二硫苏糖醇)，泳道2代表经rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒感染后的HK293细胞的细
胞培养上清液样品(未添加还原剂)，白色圆圈内代表PreS蛋白的条带；泳道3代表经
rAdC68XY3‑S重组腺病毒感染后的HK293细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二
硫苏糖醇)，泳道4代表经rAdC68XY3‑S重组腺病毒感染后的HK293细胞的细胞培养上清液样
品(未添加还原剂)，白色方框内代表S蛋白的条带；泳道5至泳道8为阴性对照。

[0047] 图4为本申请实施例3中Vero细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1代表经rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒感染
后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇)，泳道2代表经
rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原剂)，白
色圆圈内代表PreS蛋白的条带。

[0048] 图5为本申请实施例4中纯化后的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的电镜图。

[0049] 图6为本申请实施例5中pAdC68XY3‑S重组腺病毒质粒的结构示意图。

[0050] 图7为本申请实施例6中S基因片段的鉴定电泳图谱，其中，泳道M代表Marker(DL1000)，泳道1至泳道3均代表S基因片段的PCR产物，白色方框内的条带对应为S基因片
段。

[0051] 图8为本申请实施例7中Vero细胞培养上清液样品的蛋白质印迹(Western Blot,WB)图谱，其中，泳道M代表蛋白分子量Maker，泳道1代表阴性对照，泳道2代表经rAdC68XY3‑
S重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(添加有5mmol/L的二硫苏糖醇)，泳
道3代表经rAdC68XY3‑S重组腺病毒感染后的Vero细胞的细胞培养上清液样品(未添加还原
剂)，白色方框内代表S蛋白的条带。

[0052] 图9为本申请实施例8中纯化后的rAdC68XY3‑S重组腺病毒的电镜图。

[0053] 图10为本申请实验例中各组试验小鼠血清中特异性IgG抗体滴度的数据图，其中，D0表示各组试验小鼠免疫第0天，D21表示各组试验小鼠免疫第21天。

具体实施方式

[0054] 下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施
例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory 
Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中涉及的动物实验
在GLP(Good Laboratory Practice)实验室条件下开展，并按照“动物福利伦理审查实验室
动物指南”处理动物。

[0055] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述
的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。

[0056] 本申请中使用的术语“S蛋白”可以来源于已知的任何SARS‑CoV‑2病毒株，在一些实施例中，野生型S蛋白来源于毒株SARS‑CoV‑2。

[0057] 本申请中使用的术语“PreS蛋白”是指一种稳定呈现SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白在与人体细胞上的ACE2受体蛋白结合前构象的蛋白，可以是已知的任何SARS‑CoV‑2病毒株的野
生型S蛋白经优化而形成的，所述优化例如可以是点突变，所述优化包括一个或多个氨基酸
残基的缺失、增加或取代。在一些实施例中，PreS蛋白是来源于毒株SARS‑CoV‑2的野生型S
蛋白经点突变而形成的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0058] 本申请中使用的术语“核酸分子”是指由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，例如可以是通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)片段、核
糖核酸(RNA)片段以及寡核苷酸片段中的任意一种，以及通过连接、切割、内切核酸酶作用
或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段，可以是单链的或双链的。在一些实施
例中，PreS基因片段和S基因片段均属于核酸分子。

[0059] 本申请中使用的术语“HEK293”是指人胚胎肾细胞293，其是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有极少表达细胞外配体所需的内生受体、易转染的特性，分为293A、293T
等类型，其中，293A用来包装腺病毒。在一些实施例中，将HEK293细胞作为pAdC68XY3‑PreS
重组腺病毒质粒的转染细胞，以包装产生rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒；在一些实施方式中，
将HEK293细胞作为rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的表达系统，以表达产生PreS蛋白。

[0060] 本申请的术语“Vero”是指非洲绿猴肾细胞，其是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的异倍体细胞。在一些实施例中，将Vero细胞作为rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒
的表达系统，以表达产生PreS蛋白。

[0061] 本申请的术语“表达盒”包含表达目的蛋白所需的必要元件，包括在表达系统中转录和翻译过程中所必需的元件，所述表达盒可以包括启动子、表达框和终止子，所述启动子
和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现目的蛋白表达的启动子和终止
子，其中启动子可以是原核的或真核的，例如可以是Lacl、LacZ、pLacT、ptac、T3或T7噬菌体
RNA聚合酶启动子、CMV启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40启动子、小鼠金属硫蛋白–L启动子
等。所述表达盒还可以任选地包括增强子或其他表达调控元件。

[0062] 本申请的术语“表达框”是指开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，其包含一段可以编码目的蛋白的核苷酸序列，并且该核苷酸序列上具有起始密码子和终止密码子。

[0063] 本申请的术语“载体”是指能够运输另一种核酸的核酸分子，例如可以是质粒、病毒、粘粒等，所述病毒例如可以是腺病毒、安卡拉牛痘病毒(MVA)、水泡性口炎病毒(VSV)等，
所述腺病毒例如可以是Ad5型人腺病毒、Ad26型人腺病毒、AdC3型黑猩猩腺病毒、AdC7型黑
猩猩腺病毒、AdC68型黑猩猩腺病毒等。在一些实施例中，基因组中缺失E1编码区和E3编码
区的AdC68型黑猩猩腺病毒为PreS基因片段或S基因片段的载体。在一些实施例中，所述
AdC68型黑猩猩腺病毒载体是pAdC68XY3，是对基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68
型黑猩猩腺病毒进行改造而获得的骨架质粒，其中所述改造包括：将AdC68型黑猩猩腺病毒
的早期区域4可读框6(E4‑orf6区域)替换为人Ad5型腺病毒E4‑orf6区域，以提高在HEK293、
PER.C6等细胞中的扩增产量。

[0064] 本申请的术语“表达载体”是指一种DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子，所述控制序列能够实现所述核酸分子在合适的表达系统中表达。在一
些实施例中，rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒和rAdC68XY3‑S重组腺病毒均属于表达载体。

[0065] 本申请的术语“表达系统”是指用于表达外源基因蛋白的一类宿主，例如可以是真核生物、原核生物、病毒等。在一些实施例中，HEK293细胞和Vero细胞均属于表达系统。

[0066] 本申请的术语“转化体”是指接受了外源遗传物质(如：质粒DNA)而使遗传特性发生变化的一类表达系统。在一些实施例中，接受了外源的酶切基因片段的HEK293细胞属于
转化体。

[0067] 本申请的术语“免疫原”是指可以刺激机体产生免疫应答的一类物质，在一些实施例中，S蛋白和PreS蛋白均属于免疫原。

[0068] 本申请的术语“免疫”是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排出抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能，包括天然免疫和获得性免疫。在一些实施例
中，通过对受试者注射rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒，而引起机体免疫系统针对免疫原(PreS
蛋白)的免疫应答反应；以及，通过对受试者注射rAdC68XY3‑S重组腺病毒，而引起机体免疫
系统针对免疫原(S蛋白)的免疫应答反应。

[0069] 本申请的术语“药物组合物”包括治疗目的的组合物和免疫/预防目的的组合物。所述治疗目的是指改善或减轻COVID‑19的至少一种症状，可以延迟COVID‑19的恶化或进
展，或可以延迟或阻止其他相关疾病或并发症的发作。所述免疫/预防目的是指可以刺激或
引起生物体产生免疫应答以达到预防SARS‑CoV‑2感染目的。所述药物组合物可以是包括一
种或多种免疫原的组合物，例如：包括SARS‑CoV‑2的全长S蛋白和/或PreS蛋白。所述药物组
合物还可以是包括核酸分子的组合物，所述核酸分子编码一种或多种的免疫原或免疫原性
表位，并且所述核酸分子可以包括在载体(如：质粒、病毒)中而形成表达盒、表达载体、转化
体等形式。所述药物组合物例如可以是疫苗，所述疫苗可以是mRNA疫苗、DNA疫苗、重组载体
疫苗等类型。此外，所述药物组合物例如还可以是药物制剂。在一些实施例中，所述药物组
合物包括rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒和/或rAdC68XY3‑S重组腺病毒。

[0070] 本申请的术语“对象”是指能够发生细胞免疫应答的任何生物体，包括人类和其他哺乳类动物，还包括已被SARS‑CoV‑2感染且尚未治愈、曾被SARS‑CoV‑2感染且已治愈或具
有SARS‑CoV‑2感染风险的任何个体。落入本申请范围内的合适的哺乳类动物包括但不限
于：灵长类、家畜(例如羊、牛、马、猴、猪等)、实验室试验动物(例如兔、鼠等)、宠物(例如猫、
狗等)和圈养野生动物(例如狼、狐狸、鹿等)。在一些实施例中，对象为试验小鼠。在一些实
施例中，所述对象优选为人类。

[0071] 本申请的术语“有效量”是指足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种症状改善的给药剂量，或是能够刺激细胞免疫应答以达到预防疾病目的的给药剂
量。有效量取决于众多因素，例如：药物的活性、采用的递送方式等，且可以由本领域技术人
员根据对象的个体情况容易地确定。

[0072] 本申请的术语“湿转法”是通过将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)的胶片浸入转印缓冲液中，使得经SDS‑PAGE分离获得的蛋白质样品从胶片上转印至转印膜上而得以固
定。在一些实施例中，将经SDS‑PAGE分离获得的PreS蛋白从胶片上转印至转印膜上而得以
固定。

[0073] 除非另有说明，以下实施例中使用的培养基、试剂和溶液均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。

[0074] 一、本申请实施例中涉及培养基的说明

[0075] (1)MEM培养基购自美国的Hyclone实验室。

[0076] (2)DMEM培养基购自美国的Hyclone实验室。

[0077] (3)LB培养基

[0078] 每100mL的LB液体培养基中，包括：1.0g的蛋白胨，0.5g的酵母粉，以及1.0g的NaCl。

[0079] 对于LB固体培养基，是在LB液体培养基配方的基础上添加20g/L的琼脂。

[0080] 二、本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明详见下表1:

[0081] 表1.本申请实施例中涉及细胞、质粒、病毒及动物的说明

[0082]

[0083] 三、本申请实施例中涉及的基因片段、蛋白、试剂以及溶液的说明：

[0084] 本申请实施例中涉及的除引物之外的基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0085] 本申请实施例中涉及的所有引物是由武汉擎科生物技术有限公司合成。

[0086] 本申请实施例中涉及的限制性内切酶(如：NotI、KpnI和PacI)、归位内切酶(如：PI‑SceI和I‑CeuI)、连接酶(如：T4连接酶)、酶切缓冲液(10×NEB CutSmart buffer)、PCR
反应混合液(2×PrimerSTAR mix)以及双蒸水(ddH2O)均购自宝生物工程(大连)有限公司。

[0087] 本申请实施例中涉及的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒以及病毒RNA/DNA提取试剂盒均购自美国的Axygen公司。

[0088] 本申请实施例中涉及的LipofectamineTM2000试剂盒和ECL显色液购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)。

[0089] 本申请实施例中涉及的PVDF(Polyvinylidene‑Fluoride)膜购自美国默克(Merck)公司。

[0090] 本申请实施例中涉及的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。

[0091] 本申请实施例中涉及的S蛋白购自京天成公司。

[0092] 本申请实施例中涉及的鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体购自美国的GeneTex公司。

[0093] 本申请实施例中涉及的3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺(TMB)购自美国的KPL公司。

[0094] 下面结合实施例、对比例和实验例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

[0095] 实施例1：构建rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒

[0096] 本实施例通过对野生型S蛋白的关键位点进行突变，获得PreS蛋白以作为目的免疫原，其中，所述野生型S蛋白来源于毒株SARS‑CoV‑2，所述PreS蛋白的氨基酸序列如SEQ 
ID NO.1所示。将经过人源密码子优化后获得的PreS基因片段作为重组腺病毒rAdC68XY3‑
PreS的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PreS基因片段能够编码产生PreS蛋白。

[0097] 在本实施例中，重组腺病毒rAdC68XY3‑PreS的载体为复制缺陷型黑猩猩腺病毒，所述复制缺陷型黑猩猩腺病毒为基因组中缺失E1编码区和E3编码区的AdC68型黑猩猩腺病
毒，E1编码区的缺失使得重组腺病毒rAdC68XY3‑PreS不能在普通细胞(如：人体细胞)内复
制，具有很高的生物安全性，从而不能在正常人体细胞中复制生产，仅能在HEK293、Vero等
细胞中复制。E3编码区的缺失使得重组腺病毒rAdC68XY3‑PreS具有更强的包容性。

[0098] 1.1构建pShuttle‑PreS重组质粒

[0099] 本实施例选择未插入外源基因的pShuttle‑CMV质粒作为pShuttle‑PreS重组质粒的载体。pShuttle‑‑CMV为穿梭型质粒，其上含有CMV增强子、CMV启动子、T7启动子、嵌合内
含子和bGH  poly(A)加尾信号，并具有NotI和KpnI双酶切位点，还具有卡那霉素
(Kanamycin,Kana)抗性。

[0100] 所述构建pShuttle‑PreS重组质粒，具体包括如下步骤：

[0101] S1.11、在PreS基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列，并在其3’端和5’端分别添加NotI和KpnI酶切位点，然后进行基因合成；

[0102] S1.12、采用NotI和KpnI限制性内切酶对步骤S1.11合成的基因片段进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为3769bp的目的基因片段，其中，双
酶切后回收目的基因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；

[0103] S1.13、采用NotI和KpnI限制性内切酶对pShuttle‑CMV进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为4093bp的载体骨架，其中，双酶切后回收载体骨
架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；

[0104] S1.14、将步骤S1.12获得的目的基因片段，与步骤S1.13获得的载体骨架相混合，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，获得pShuttle‑PreS连接产物；

[0105] S1.15、将步骤S1.14获得的pShuttle‑PreS连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃静置培养过夜，获得多个单菌
落，其中，转化按照本领域常规的热激转化方式实施；

[0106] S1.16、挑取步骤1.15中的多个单菌落接种于含有100μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，获得多个菌液；

[0107] S1.17、对步骤1.16中的多个菌液分别进行质粒提取操作，将提取的质粒测序，测序结果正确的质粒即为pShuttle‑PreS重组质粒，其中，质粒提取操作根据质粒提取试剂盒
操作说明实施。

[0108] 1.2构建pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒

[0109] 在本实施例中，选择自行构建的pShuttle‑PreS和商购的pAdC68XY3‑GFP来构建pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒，pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒的结构如图1所示。

[0110] 所述构建pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒表达载体，具体包括如下步骤：

[0111] S1.21、采用PI‑SceI和I‑CeuI归位内切酶对pShuttle‑PreS进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为4246bp的目的基因片段，其中，回收目的基
因片段的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施，目的基因片段包含PreS基因片段和PreS蛋
白的表达调控元件；

[0112] S1.22、采用PI‑SceI和I‑CeuI归位内切酶对pAdC68XY3‑GFP进行双酶切，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切完全后，胶回收长度为33062bp的载体骨架，其中，双酶切后回收
载体骨架的操作根据胶回收试剂盒操作说明实施；

[0113] S1.23、将步骤1.21获得的目的基因片段，与步骤S1.22获得载体骨架混合，在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，获得pAdC68XY3‑PreS连接产物；

[0114] S1.24、将pAdC68XY3‑PreS连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)抗性的LB平板上，37℃培养过夜，获得多个
单菌落，其中，转化按照本领域常规的热激转化方式实施；

[0115] S1.25、挑取步骤1.24中的多个单菌落分别接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养过夜，获得多个菌液；

[0116] S1.26、对步骤1.25中的多个菌液分别进行质粒提取操作，然后对提取的质粒测序，测序结果正确的质粒即为pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒，其中，质粒提取操作根据质
粒提取试剂盒操作说明实施；

[0117] S1.27、将步骤1.26中测序结果正确的pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养
过夜；挑取多个培养获得的单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基
中，37℃培养过夜，之后使用质粒提取试剂盒提取质粒后进行测序。

[0118] 经测序，pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中，PreS基因片段插入位置为AdC68型黑猩猩腺病毒基因组中缺失的E1编码区。

[0119] 1.3线性化处理pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒

[0120] 采用PacI限制性内切酶对1.2中获得的所述pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒进行酶切，以使所述pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒线性化，其中，酶切温度为37℃，酶切时间
为三小时，酶切体系详见下表2：

[0121] 表2 pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒线性化的酶切体系

[0122]

[0123]

[0124] 酶切完成后，采用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，其中，回收的基因片段长度为35556bp，实现pAdC68XY3‑PreS重组腺病毒质粒线形化，并通过微量核酸定量仪对回收后
的基因片段进行定量分析。

[0125] 1.4制备rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒

[0126] 对1.3中酶切后回收的基因片段(长度为35556bp)进行转染操作，采用TM
Lipofectamine 2000试剂盒进行转染操作，并选择HEK293细胞作为表达系统。根据
TM
Lipofectamine 2000试剂盒的操作说明，将1.3中酶切后回收的基因片段(长度为35556bp)
转染于汇合度为60～70％的HEK293细胞内。

[0127] 在LipofectamineTM2000试剂盒操作说明的“接种细胞”步骤中，用于培养HEK293细胞的培养基为MEM培养基，并在转染前两小时将MEM培养基更换为DMEM培养基。转染五小时
后，更换培养基为含10％(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基。

[0128] 转染隔日，在倒置显微镜下观察细胞病变，直至60％的HEK293细胞出现噬斑时收集细胞。将收集的细胞在室温(25℃)与‑80℃之间反复冻融三次，然后在1200×g的转速下
离心五分钟，收集上清液，获得的上清液中包含rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒，并将上清液分
装后置于‑80℃超低温冰箱保存备用。

[0129] 实施例2：鉴定rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒基因组中的PreS基因片段

[0130] 以rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的全基因组作为模板，采用PCR技术扩增PreS基因片段。针对PreS基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1如
SEQ ID NO.5所示，所述反向引物R1如SEQ ID NO.6所示。采用病毒RNA/DNA提取试剂盒对上
述1.4中获得的上清液进行全基因组提取操作，具体操作参照试剂盒操作说明进行。

[0131] 其中，PCR反应体系详见下表3：

[0132] 表3为PCR反应体系一览表

[0133]

[0134]

[0135] PCR反应程序具体为：①95℃预变性2min；②95℃变性15s；③45℃退火15s；④72℃延伸90s；⑤重复②～④30个循环；⑥72℃，5min。

[0136] PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，白色圆圈内的条带预估为PreS基因片段，然后切胶回收该条带并测序，测序结果显示该条带即为
PreS基因片段。其中，所述切胶回收采用胶回收试剂盒进行，具体操作参照胶回收试剂盒中
的操作说明实施。

[0137] 实施例3：rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒表达PreS蛋白

[0138] 分别选择HK293细胞和Vero细胞作为表达系统，以分别检测rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒在HK293细胞和Vero细胞中PreS蛋白的表达。具体包括如下步骤：

[0139] S3.1、将表达系统按5×105个/孔的接种量接种于六孔板的孔内，选用MEM培养基培养表达系统，以使表达系统在孔内增殖；

[0140] S3.2、当孔内表达系统的汇合率达到90％时，将rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒接种于孔内，并设置阴性对照，在37℃的条件下静置培养；

[0141] S3.3、当37℃静置培养48h后，先将粘壁细胞刮于细胞培养液中，然后将细胞培养液离心，并收集上清液，将该上清液标记为细胞培养上清液；

[0142] S3.4、取80μL步骤S3.3中获得的细胞培养上清液，然后加入20μL五倍浓缩的SDS‑PAGE上样缓冲液(5×SDS‑PAGE Loading Buffer)，并在100℃下煮沸五分钟，获得该细胞培
养上清液的待检样品；

[0143] S3.5、结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测步骤S3.4中获得的待检样品中的PreS蛋白表达。

[0144] 其中，在所述步骤S3.2中，当所述表达系统为HK293细胞时，rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒按照感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)0.2进行接种；当所述表达系统为
Vero细胞时，rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒按照MOI 20进行接种。

[0145] 在所述步骤S3.3中，当所述表达系统为HK293细胞时，所述阴性对照即为未接种有rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的HK293细胞；当所述表达系统为Vero细胞时，所述阴性对照即
为未接种有rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的Vero细胞。

[0146] 在所述步骤S3.5中，结合SDS‑PAGE和WB技术检测各个待检样品，具体包括如下步骤：

[0147] S3.51、将所述待检样品进行8％SDS‑PAGE电泳；

[0148] S3.52、电泳结束后，利用湿转法将目的PreS蛋白转印至PVDF膜上；

[0149] S3.53、将附着有PreS蛋白的PVDF膜浸泡于含5％(质量百分比)脱脂奶粉的PBST溶液中，在4℃下封闭过夜；

[0150] S3.54、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.53的所述PVDF膜两次，然后将所述PVDF膜浸泡于鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)中，在37℃下孵育一小
时；

[0151] S3.55、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.54的所述PVDF膜两次，然后将所述PVDF膜浸泡于辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)中，在37℃下孵
育一小时；

[0152] S3.56、采用PBST溶液清洗完成步骤S3.55的所述PVDF膜两次，然后将ECL显色液加至于所述PVDF膜的附着有PreS蛋白的一面上，化学发光法显色。

[0153] 其中，在所述步骤S3.51中，10％SDS‑PAGE电泳的条件为：①保持电压100V二十分钟；②保持电压160V一小时二十分钟。

[0154] 在所述步骤S3.54中，可用兔抗anti‑RBD多克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)替代所述鼠抗S蛋白(S2亚基)单克隆抗体稀释液(稀释比例为1:2000)。

[0155] 在所述步骤S3.55中，可用HRP标记的羊抗兔IgG稀释液(稀释比例为1:5000)替代所述HRP标记的羊抗鼠IgG稀释液(稀释比例为1:5000)。

[0156] 需要说明的是，利用WB技术检测各个待检样品也可通过商品化的Western Blot ECL化学发光法显色试剂盒进行。

[0157] 如图3和图4所示，经rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒感染后，HK293细胞和Vero细胞的所述细胞培养上清液的待检样品中均能成功检测到PreS蛋白的表达，表达的PreS蛋白分子
量约为180～200KD，需要说明的是，表达的PreS蛋白存在高度的糖基化。

[0158] 实施例4：rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的纯化及检定

[0159] 4.1小规模扩增rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒

[0160] 首先，提供汇合度为90％的HEK293细胞；然后，将rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒按照MOI0.2接种于所述HEK293细胞中，并置于37℃、5％(体积百分比)CO2的培养箱内静置培养；
待70％以上的细胞变圆、脱落时，使用细胞刮将粘壁细胞刮下，然后将细胞培养液2265×g
离心十分钟，并分别收集上清液和细胞沉淀；最后，将收集的所述细胞沉淀重悬于PBS缓冲
液中，并在室温(25℃)与‑80℃之间反复冻融三次，2265×g离心十分钟以收集上清液，将两
次收集的上清液合并，并标记为rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒保存液以用于下一步纯化。

[0161] 4.2纯化rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒

[0162] 在生物安全柜中，向一50mL的离心管中缓慢加入12mL密度为1.4g/mL的氯化铯溶液，然后非常轻缓地加入9mL密度为1.2g/mL的氯化铯溶液，接着在不连续梯度的顶部加入
13mL的所述rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒保存液，获得待纯化的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒
样品。

[0163] 预冷离心转子至4℃，将待纯化的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒样品于4℃、100000×g离心一百二十分钟，对于SW28型号的转子需采用23000r/min的转速。离心后，小心抽吸
病毒带，获得含rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的溶液。将所述含rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒
的溶液转移至一无菌的15mL离心管内，向其中加入等体积的10mmol/L的Tris‑HCl缓冲液
(pH为7.9)，获得稀释的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒悬液。

[0164] 取另一50mL的离心管，向其中加入20mL密度为1.35g/mL的氯化铯溶液，然后非常轻缓地在氯化铯溶液的顶部加入15mL所述稀释的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒悬液。平衡所
述离心管后，在4℃、100000×g离心十八小时，对于SW28型号的转子需采用23000r/min的转
速。离心结束后，小心收集蓝白色病毒带。将获得的蓝白色病毒带置于10000道尔顿的纤维
素酯膜中，4℃透析至PBS溶液中以去除氯化铯，获得纯化的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒溶
液。向纯化的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒溶液中加入10％(体积百分数)甘油，分装后冻存
于‑80℃冰箱中以备用。

[0165] 4.3 rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒的检定及分析

[0166] 采用2％(质量百分比)磷钨酸溶液(pH为6.8)复染纯化的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒，然后进行电镜检测，如图5所示，经电镜观察可看到完整的rAdC68XY3‑PreS重组腺病
毒颗粒。

[0167] 此外，采用腺病毒滴度‑TCID50法检测纯化的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒，检测结果显示纯化的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒滴度在109TCID50/ml以上。其中，所述腺病毒滴
度‑TCID50法参考文献( G.,Archiv f experiment Pathol u Pharmakol,162:480‑
483,1931)进行。

[0168] 实施例5：构建rAdC68XY3‑S重组腺病毒

[0169] 本实施例对来源于毒株SARS‑CoV‑2的野生型S蛋白进行信号肽替换操作，获得的全长S蛋白作为目的免疫原，所述全长S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。将经过人源
密码子优化后获得的S基因片段作为重组腺病毒rAdC68XY3‑S的靶基因，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.8所示，S基因片段能够编码产生SARS‑CoV‑2病毒的全长S蛋白。重组腺病毒
rAdC68XY3‑S的结构如图6所示。

[0170] 重组腺病毒rAdC68XY3‑S的构建参照实施例1进行，依次构建pShuttle‑S重组质粒、构建pAdC68XY3‑S重组腺病毒质粒和制备rAdC68XY3‑S重组腺病毒，在此不再赘述。

[0171] 经测序，pAdC68XY3‑S重组腺病毒质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中，S基因片段插入位置为AdC68型黑猩猩腺病毒基因组中缺失的E1编码区。

[0172] 需要说明的是，对于构建pShuttle‑S重组质粒，起始合成的基因片段(对应步骤S1.11)为：在S基因片段的起始密码子前面加入Kozak序列，并在编码全长S蛋白的N端的核
苷酸序列处添加编码Jev信号肽的核苷酸序列，最后在3’端和5’端分别添加NotI和KpnI酶
切位点。

[0173] 实施例6：鉴定rAdC68XY3‑S重组腺病毒基因组中的S基因片段

[0174] 以rAdC68XY3‑S重组腺病毒的全基因组作为模板，采用PCR技术扩增S基因片段。针对S基因片段设计用于PCR扩增的正向引物F2和反向引物R2，所述正向引物F2如SEQ ID 
NO.9所示，所述反向引物R2如SEQ ID NO.10所示。

[0175] 其中，提取rAdC68XY3‑S重组腺病毒的全基因组、PCR反应体系以及PCR反应程序参照实施例2进行，在此不再赘述。

[0176] PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图7所示，白色方框内的条带预估为S基因片段，然后切胶回收该条带并测序，测序结果显示该条带即为S基
因片段。其中，所述切胶回收采用胶回收试剂盒进行，具体操作参照胶回收试剂盒中的操作
说明实施，在此不再赘述。

[0177] 实施例7：rAdC68XY3‑S重组腺病毒表达S蛋白

[0178] 具体参照实施例3进行，仅需将实施例3中的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒替换为rAdC68XY3‑S重组腺病毒，在此不再赘述。

[0179] 如图3和图8所示，经rAdC68XY3‑S重组腺病毒感染后，HK293细胞和Vero细胞的细胞培养上清液的待检样品中均能成功检测到S蛋白的表达，表达的S蛋白分子量约为180～
200KD，需要说明的是，表达的S蛋白存在高度的糖基化。

[0180] 实施例8：rAdC68XY3‑S重组腺病毒的纯化及检定

[0181] 具体参照实施例4进行，仅需将实施例4中的rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒替换为rAdC68XY3‑S重组腺病毒，在此不再赘述。

[0182] 如图9所示，经电镜观察可看到完整的rAdC68XY3‑S重组腺病毒颗粒。采用腺病毒滴度‑TCID50法检测纯化的rAdC68XY3‑S重组腺病毒，检测结果显示纯化的rAdC68XY3‑S重
组腺病毒滴度在9.0TCID50/ml以上。

[0183] 对比例：rAdC68XY3‑GFP重组腺病毒的制备及纯化

[0184] 本对比例提供了一种rAdC68XY3‑GFP重组腺病毒，rAdC68XY3‑GFP重组腺病毒的制备方法是：将商购的pAdC68XY3‑GFP重组质粒线性化，并转染HEK293细胞，经细胞培养而获
得rAdC68XY3‑GFP重组腺病毒，具体操作参照实施例1中的1.3和1.4进行。

[0185] 将制备获得的rAdC68XY3‑GFP重组腺病毒进行小规模扩增及纯化，具体操作参照实施例4中的4.1和4.2进行，将纯化获得的rAdC68XY3‑GFP重组腺病毒留存备用。

[0186] 实验例：比较rAdC68XY3‑GFP重组腺病毒、rAdC68XY3‑PreS重组腺病毒和rAdC68XY3‑S重组腺病毒的免疫活性

[0187] 选取18只试验小鼠(约3～7天时间适应环境)，动物经检验检疫后随机分为三组，每组6只，每组的具体情况详见下表3：

[0188] 表3为实验例中分组的具体内容表

[0189]

[0190] 对各组的试验小鼠进行腹腔注射免疫，每只每次注射为5微克，每周注射1次，共注射3次，21天后眼眶取血。采用酶联免疫反应(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,
ELISA)法检测试验小鼠血清中特异性IgG抗体滴度，包括如下步骤：

[0191] S10、采用无菌碳酸钠缓冲液(pH为9.6)和商购的S蛋白配置S蛋白溶液，所述S蛋白溶液的浓度为0.5μg/mL，然后将所述S蛋白溶液按照100μL/孔加入至96孔酶标板，置于4℃
包被过夜；

[0192] S20、次日，弃去酶标板孔内的液体，用PBST缓冲液洗板三次，然后每孔加入封闭液，置于37℃封闭一小时；

[0193] S30、封闭结束后，弃去所述酶标板孔内的封闭液，然后用封闭液对免疫后的试验小鼠血清进行系列梯度稀释，并将稀释后的血清按照100μL/孔加入至所述酶标板，每个稀
释度血清设置三个平行样，设置封闭液作为空白对照，置于37℃孵育一小时；

[0194] S40、步骤S30的孵育结束后，用PBST缓冲液洗板三次，然后将过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(稀释比例为1:1000)按照100μL/孔加入至所述酶标板，置于37℃孵育一小
时；

[0195] S50、步骤S40的孵育结束后，用PBST缓冲液洗板三次，按照100μL/孔加入作为生色底物的3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺(TMB)，暗处放置15分钟；

[0196] S60、按照100μL/孔加入0.2mol/L的硫酸终止反应，用酶标仪在波长450nm和参比波长620nm处测定吸光度。

[0197] 对步骤S10至步骤S60需要说明的是，所述碳酸钠缓冲液(pH为9.6)的配方是：每1000mL的碳酸钠缓冲液中，包括8.4g的碳酸氢钠(NaHCO3)和3.5g的碳酸钠(Na2CO3)。所述
PBST缓冲液为含有0.1％(质量百分数)吐温‑20的PBS缓冲液，所述封闭液为含有10％(质量
百分数)脱脂奶粉的PBS缓冲液，PBS缓冲液采用本领域常规技术手段配置。

[0198] 实验结果如图10所示，其中，实验组1的特异性IgG抗体滴度几何平均值为8445，实验组2的特异性IgG抗体滴度几何平均值为2263，说明PreS蛋白和SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白
均可以诱导产生特异性IgG抗体。其中，PreS蛋白诱导产生的特异性IgG抗体滴度可以达到S
蛋白诱导产生的特异性IgG抗体滴度的三倍以上，这意味着免疫原PreS可以诱导产生高滴
度的特异性IgG抗体，证明PreS蛋白在制备用于治疗或预防SARS‑CoV‑2病毒感染的疫苗和/
或药物中具有巨大优势。

[0199] 以上对本发明所提供的一种SARS‑CoV‑2病毒的免疫原及其应用，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只
是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替
换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。