一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官及其培养方法和应用

摘要

本发明提供一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官及其培养方法和应用，属于类器官培养技术领域。所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官的培养方法包括针对鼻黏膜上皮细胞，采用U形底类器官培养法或胶汽液平类器官培养法进行培养。本发明通过优化培养方法，成功构建获得一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官，同时，通过对其分析方法进行进一步优化，从而为高通量药物筛选提供可能，因此具有良好的实际推广应用之价值。

权利要求

1.一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括针对鼻黏膜上皮细胞，采用U形底类器官培养法或胶汽液平类器官培养法进行培养；

所述U形底类器官培养法具体为：

将鼻黏膜上皮细胞重悬于类器官培养基中，接种于设置有U型底的细胞培养器皿中，离心后进行培养；

所述胶汽液平类器官培养法具体为：

使用类器官培养基将基质胶稀释并包被于细胞培养器皿中孵育得培养基A；将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器官培养基中，然后接种于所述培养基A中进行培养；

所述类器官培养基，其成分和含量如下：DMEM/F12，1 5×；人表皮生长因子，5 20 ng/~ ~mL；胰岛素，1 10 ng/mL；霍乱毒素，0.05 0.2 nM；皮质醇，0.1 1 μg/mL；3,3',5‑三碘‑L‑甲~ ~ ~状腺原氨酸，1 5 nM；N‑2细胞培养添加剂，5 15μL/mL；抗生素‑抗真菌溶液，50 200 IU/mL；

~ ~ ~

B27细胞培养添加剂，1 5×；重组人头蛋白50 200 ng/mL；

~ ~

所述U形底类器官培养法中：

3

将鼻黏膜上皮细胞重悬于类器官培养基中，控制其浓度为1 5×10 ；所述设置有U型底~的细胞培养器皿为96孔培养板；所述离心控制条件为1000 2000rpm离心1 5分钟；当类器官~ ~生长到200μm以上，在培养的第7天加入分化培养基诱导分化；所述分化培养基为人支气管上皮细胞气液界面培养基，1 5×；

~

所述胶汽液平类器官培养法中：

培养基A为含40%基质胶的类器官培养基；所述细胞培养器皿为24孔培养板；所述孵育为在35 40℃条件下孵育10 30分钟；所述步骤“将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器~ ~官培养基中”，基质胶含量控制为1 10%；在培养的第7天，类器官的大小达到200〜300μm；采~用酶解并反复吹打，从而机械性地将类器官分离，此时类器官大小为100μm；然后加入类器官培养基，离心，重悬于含50 70%基质胶的类器官培养基中，并加入分化培养基诱导分化，~然后使用胶包埋的方法对类器官进行传代培养，稀释后在细胞培养器皿中重悬接种，添加分化培养基，完全覆盖固化的基质胶液滴；所述分化培养基为人支气管上皮细胞气液界面培养基，1 5×。

~

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述U形底类器官培养法中，所述离心控制条件为1500rpm离心2分钟。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述胶汽液平类器官培养法中，所述孵育具体为37℃孵育20分钟。

4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述胶汽液平类器官培养法中，所述步骤“将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器官培养基中”，基质胶含量控制为5%。

5.权利要求1‑4任一项所述培养方法获得的鼻黏膜上皮细胞3D类器官。

6.权利要求5所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官在药物体外筛选和/或检测中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物体外筛选为体外药物高通量筛选。

8.一种体外检测平台，其特征在于，所述体外检测平台包含权利要求5所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官。

9.一种体外高通量药物筛选的方法，其特征在于，所述方法包括：将待测药物施加至权利要求5所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或权利要求8所述体外检测平台，对所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或体外检测平台进行检测分析；

所述检测分析方法包括荧光染色、RNA提取、图像捕获和生物标记分析。

10.如权利要求9所述体外高通量药物筛选的方法，其特征在于，所述荧光染色方法中，用于荧光染色的试剂为洗液、封闭液和抗体稀释液；

所述洗液成分为：PBS + 0.3% TritonX‑100；

所述封闭液成分为：PBS + 10% FBS +0.3% TritonX‑100；

所述抗体稀释液成分为：PBS + 1% FBS +0.3% TritonX‑100。

11.如权利要求9所述体外高通量药物筛选的方法，其特征在于，所述RNA提取方法中，使用TRIzol进行裂解。

12.如权利要求9所述体外高通量药物筛选的方法，其特征在于，所述图像捕获和生物标记分析方法中，使用共聚焦Z‑step成像方法进行成像处理。

说明书

一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官及其培养方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于类器官培养技术领域，具体涉及一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官及其培养方法和应用。

背景技术

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0003] 鼻黏膜慢性炎症性疾病是耳鼻咽喉科的常见、多发疾病，包括过敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)及慢性鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis，CRS)(伴或不伴有鼻息肉(Nasal polyps，NP))等。AR与CRS不仅两者间的发病密切相关，还均与下呼吸道疾病如哮喘(Asthma)和慢阻肺(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的发生具有紧密联系，严重损害患者的生活质量，并导致高额的医疗支出，给社会造成了极大的医疗负担。目前，鼻黏膜慢性炎症性疾病的发病机制十分复杂，仍不完全清楚，其常规治疗方法仍存在疗效有待改进、缺乏根治性手段等诸多问题，亟待持续深入的基础性研究，在阐明发病机制的基础上向临床转化，探索更有效的针对性治疗策略。

[0004] 体外培养人鼻黏膜上皮细胞对于呼吸道生物学、疾病发病机制的基础研究以及新型诊疗技术的开发都起到了十分重要的作用。气液界面培养法(ALI)是目前最常用的一种呼吸道上皮的培养技术，为研究气道上皮细胞形态学和功能学提供了良好的体外研究平台。以Tranwell为基础的嵌入式培养皿广泛应用于细胞ALI的培养，能够支持药物的体外检测，如测量跨细胞层的药物的运输和代谢。然而，Transwell结合ALI的培养模式只能用于样本量较小的实验室检测，而无法应用于高通量测试，如呼吸道疾病的体外药物筛选。因此以Transwell为基础的ALI培养方式极大的限制了针对上呼吸道的药物开发。近年来，随着3D类器官培养技术的成熟，体外药物高通量筛选有了更好的选择。3D类器官模型可以使用少量细胞在高通量平台上进行培养，也可以与现有的流体芯片相结合。3D类器官培养系统已成功应用于某些类型的上皮细胞，例如前列腺、肠和肺，然而发明人发现，上呼吸道上皮的3D类器官模型鲜有报道。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明提供一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官及其培养方法和应用，本发明通过优化培养方法，成功构建获得一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官，同时，通过对其分析方法进行进一步优化，从而为高通量药物筛选提供可能，因此具有良好的实际推广应用之价值。

[0006] 具体的，本发明涉及以下技术方案：

[0007] 本发明的第一个方面，提供一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官的培养方法，所述培养方法包括针对鼻黏膜上皮细胞，采用U形底类器官培养法或胶汽液平类器官培养法进行培养。

[0008] 需要说明的是，鼻黏膜上皮细胞的获得可参考Zhao,Xuening,et al."The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to producefunctioning ciliated cells in vitro."American Journal of Rhinology&Allergy26.5(2012):345‑350；在此不再进行具体描述。

[0009] 本发明的第二个方面，提供上述培养方法获得的鼻黏膜上皮细胞3D类器官。

[0010] 当选用U形底类器官培养法进行培养时，获得的鼻黏膜上皮细胞3D类器官大小为100‑200μm，其外层具有摆动的纤毛；

[0011] 当选用胶汽液平类器官培养法进行培养时，获得的鼻黏膜上皮细胞3D类器官大小为300‑400μm，其内部具有略微透明并大小均一的空腔；在空腔的内边缘具有摆动的纤毛细胞。

[0012] 本发明的第三个方面，提供上述鼻黏膜上皮细胞3D类器官在药物体外筛选和/或检测中的应用。

[0013] 本发明的第四个方面，提供一种体外检测平台，所述体外检测平台包含上述鼻黏膜上皮细胞3D类器官，从而为高通量药物筛选提供能模拟体内环境的、稳定的、成本低廉的体外检测平台。

[0014] 本发明的第五个方面，提供一种体外高通量药物筛选的方法，所述方法包括：将待测药物施加至上述鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或上述体外检测平台，对鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或上述体外检测平台进行检测分析。

[0015] 以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

[0016] 上述技术方案中成功开发出两种简单且可重复的方法来建立人鼻黏膜类器官。这一3D模型可在体外成功模拟了鼻上皮的功能性细胞形态。此外，上述技术方案还建立并优化了3D类器官的下游检测方法。

[0017] 特别是在U‑bottom方法中，鼻黏膜上皮细胞的成熟速度更快(仅7天)，并且与transwell方法(播种细胞数从100k到1k)相比，细胞播种数量减少了100倍。这种培养技术为体外人体鼻黏膜的建模提供了另一种经济高效的方法，并为鼻黏膜上皮的高通量药物筛选和个体用药优化提供了可能性，因此具有良好的实际推广应用之价值。

附图说明

[0018] 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

[0019] 图1为本发明实施例中三种使用人鼻黏膜上皮原代细胞生成类器官的方法示意图。

[0020] 图2为本发明实施例中三种方法形成的鼻黏膜类器官形态图；比例尺为100μm。图3为本发明实施例中U‑bottom类器官培养法的类器官分化情况；比例尺为100μm。

[0021] 图4为本发明实施例中GelALI来源的类器官分化图，其中，A为分化过程示意图，B为分化过程中不同时间点的类器官实际状态图；比例尺为100μm。

[0022] 图5为本发明实施例中细胞播种数量对类器官形成的影响。A.在不同时间点、不同细胞播种数量下的类器官形态。B.不同时间点、不同细胞播种数量，类器官的圆度比较。C.不同时间点、不同细胞播种数量，类器官的直径比较。D.不同时间点、不同细胞播种数量，类器官的透明度比较。

[0023] 图6为本发明实施例中ALItranswell培养系统形成的鼻黏膜上皮细胞模型及其染色图。

[0024] 图7为本发明实施例中iSpacer封片步骤。A.将样品密封在iSpacer中的示意图。B.使用iSpacer密封3D类器官的具体步骤：1.剥开iSpacers的保护衬垫；2.将垫片(外露、有粘性的一面朝下)放置于在干燥的载玻片或盖玻片表面，轻轻按压以密封；3.把标本放在孔内，加入适量的 放置盖玻片使之密封；4.将多余的溶液自孔中去除，用透明的甲油将孔的外周区域密封，形成硬膜。

[0025] 图8为本发明实施例中两种鼻黏膜类器官的成像比较(分化前)；OlympusBX51荧光显微镜为第一行(200×)，ZeissLSM700为第二行(200×)。

[0026] 图9为本发明实施例中不同放大倍数的鼻黏膜3D类器官图像。

[0027] 图10为本发明实施例中两个批次之间的比较。A.两个批次间类器官结构的比较；B.两个批次间纤毛密度的比较。

[0028] 图11为本发明实施例中原代鼻黏膜上皮细胞的类器官培养。A.原代鼻黏膜上皮细胞的类器官培养和传代示意图。B.原代鼻黏膜上皮类器官的形态。C.一代传代后的类器官形态。D.两代传代后的类器官形态。E.第2代类器官的IF染色。

具体实施方式

[0029] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0030] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0031] 结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

[0032] 如前所述，建立鼻黏膜上皮类器官模型能够更好的模拟鼻黏膜干细胞的体内生长环境，为组织工程学研究提供更加准确可靠的实验数据，并辅助鼻腔局部药物的体外筛选和开发。

[0033] 有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官的培养方法，所述培养方法包括针对鼻黏膜上皮细胞(hNECs)，采用U形底类器官培养法或胶汽液平类器官培养法进行培养；

[0034] 其中，

[0035] 所述U形底类器官培养法具体为：

[0036] 将鼻黏膜上皮细胞重悬于类器官培养基中，接种于设置有U型底的细胞培养器皿中，离心后进行培养。

[0037] 本发明的又一具体实施方式中，所述类器官培养基包括细胞扩增培养基、B27细胞培养添加剂和重组人头蛋白。

[0038] 本发明的又一具体实施方式中，所述细胞扩增培养基包括：DMEM/F12、人表皮生长因子、胰岛素、霍乱毒素、皮质醇、3,3',5‑三碘‑L‑甲状腺原氨酸、N‑2细胞培养添加剂和抗生素‑抗真菌溶液。

[0039] 本发明的又一具体实施方式中，所述类器官培养基，其成分和含量如下：DMEM/F12，1～5×；人表皮生长因子，5～20ng/mL；胰岛素，1～10ng/mL；霍乱毒素，0.05～0.2nM；皮质醇，0.1～1μg/mL；3,3',5‑三碘‑L‑甲状腺原氨酸，1～5nM；N‑2细胞培养添加剂，5～15μL/mL；抗生素‑抗真菌溶液(100x)，50～200IU/mL；B27细胞培养添加剂(50x)，1～5×；重组人头蛋白50～200ng/mL。

[0040] 本发明的又一具体实施方式中，将hNECs重悬于类器官培养基中，控制其浓度为13
～5×10；

[0041] 本发明的又一具体实施方式中，所述设置有U型底的细胞培养器皿为细胞培养板，优选为96孔培养板；

[0042] 本发明的又一具体实施方式中，所述离心控制条件为1000～2000rpm离心1～5分钟，优选为1500rpm离心2分钟；

[0043] 所述离心后进行培养按常规细胞培养方式进行培养即可，如可采用CO2加湿培养箱中进行培养；优选的，每隔3～5天(如4天)更换部分类器官培养基(如50％)，从而保证组织细胞正常的营养供给。

[0044] 采用上述培养方法，类器官形成非常迅速，基本上在第二天即可形成一个良好的类器官结构，且边界清晰；

[0045] 本发明的又一具体实施方式中，当类器官生长到200μm以上，在培养的第7天加入分化培养基诱导分化；在分化的第6天，即可在类器官的外层可观察到摆动的纤毛，且类器官的大小较前减小(尺寸减小到100‑200μm)，从而获得鼻黏膜上皮细胞3D类器官。

[0046] 本发明的又一具体实施方式中，所述分化培养基为人支气管上皮细胞气液界面培TM养基(Pneuma Cult ALI Medium)，1～5×。

[0047] 本发明的又一具体实施方式中，所述胶汽液平类器官培养法具体为：

[0048] 使用类器官培养基将基质胶(Matrigel)稀释并包被于细胞培养器皿中孵育得培养基A；将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器官培养基中，然后接种于上述培养基A中进行培养。

[0049] 本发明的又一具体实施方式中，所述类器官培养基包括细胞扩增培养基、B27细胞培养添加剂和重组人头蛋白。

[0050] 本发明的又一具体实施方式中，所述细胞扩增培养基包括：DMEM/F12、人表皮生长因子、胰岛素、霍乱毒素、皮质醇、3,3',5‑三碘‑L‑甲状腺原氨酸、N‑2细胞培养添加剂和抗生素‑抗真菌溶液。

[0051] 本发明的又一具体实施方式中，所述类器官培养基，其成分和含量如下：DMEM/F12，1～5×；人表皮生长因子，5～20ng/mL；胰岛素，1～10ng/mL；霍乱毒素，0.05～0.2nM；皮质醇，0.1～1μg/mL；3,3',5‑三碘‑L‑甲状腺原氨酸，1～5nM；N‑2细胞培养添加剂，5～15μL/mL；抗生素‑抗真菌溶液(100x)，50～200IU/mL；B27细胞培养添加剂(50x)，1～5×；重组人头蛋白50～200ng/mL。

[0052] 所述培养基A具体为含30～50％(优选为40％)基质胶的类器官培养基；

[0053] 本发明的又一具体实施方式中，所述细胞培养器皿为细胞培养板，优选为24孔培养板；

[0054] 本发明的又一具体实施方式中，所述孵育具体为在35～40℃条件下孵育10～30分钟，优选为37℃孵育20分钟；

[0055] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤“将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器官培养基中”，基质胶含量控制为1～10％，优选为5％；

[0056] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤“接种于上述培养基A中进行培养”中，培养按常规细胞培养方式进行培养即可，如可采用CO2加湿培养箱中进行培养；优选的，每隔3～5天(如4天)更换部分类器官培养基(如50％)，从而保证组织细胞正常的营养供给。

[0057] 采用上述培养方法，基本上在培养的第三天可观察到类器官结构；在培养的第7天，GelALI中类器官的大小达到200～300μm；但是由于类器官生长过密，无法启动分化；因此可采用酶解并反复吹打，从而机械性地将类器官分离(此时类器官大小为100μm左右)；然后加入类器官培养基，离心，重悬于含50～70％基质胶的类器官培养基中，并加入分化培养基诱导分化，然后使用胶包埋的方法对类器官进行传代培养，稀释后在细胞培养器皿中重悬接种，添加分化培养基，完全覆盖固化的基质胶液滴。

[0058] 采用上述方法培养后，类器官逐渐增长，并在第21天增长到300‑400μm，在此时间点，大量的、具有纤毛摆动的纤毛细胞出现。同时，类器官的内部变得略微透明并形成大小均一的空腔。在空腔的内边缘可以观察到摆动的纤毛细胞。

[0059] 所述分化培养基为人支气管上皮细胞气液界面培养基(Pneuma CultTMALI Medium)，1～5×。

[0060] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述培养方法获得的鼻黏膜上皮细胞3D类器官，所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官大小为100‑200μm，其外层具有摆动的纤毛；或，所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官大小为300‑400μm，其内部具有略微透明并大小均一的空腔；在空腔的内边缘具有摆动的纤毛细胞。

[0061] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述鼻黏膜上皮细胞3D类器官在药物体外筛选和/或检测中的应用。

[0062] 所述药物体外筛选具体为体外药物高通量筛选。

[0063] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种体外检测平台，所述体外检测平台包含上述鼻黏膜上皮细胞3D类器官，从而为高通量药物筛选提供能模拟体内环境的、稳定的、成本低廉的体外检测平台。

[0064] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种体外高通量药物筛选的方法，所述方法包括：将待测药物施加至上述鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或上述体外检测平台，对鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或上述体外检测平台进行检测分析。

[0065] 本发明的又一具体实施方式中，所述检测分析方法包括但不限于荧光染色、RNA提取、图像捕获和生物标记分析。

[0066] 本发明的又一具体实施方式中，在所述荧光染色方法中，向所选用的试剂中加入TritonX‑100，从而更加有利于试剂的渗透。

[0067] 所述试剂包括洗液、封闭液和抗体稀释液；

[0068] 其中，所述洗液成分为：PBS+0.3％TritonX‑100；

[0069] 所述封闭液成分为：PBS+10％FBS+0.3％TritonX‑100；

[0070] 所述抗体稀释液成分为：PBS+1％FBS+0.3％TritonX‑100。

[0071] 本发明的又一具体实施方式中，所述荧光染色方法包括：

[0072] 1)在1.5mL Eppendorf管(EP管)中收集鼻黏膜类器官。

[0073] 2)用Wash buffer洗涤两次。

[0074] 3)用4％PFA固定类器官10分钟。

[0075] 4)用Wash buffer洗涤两次。

[0076] 5)用Blocking buffer封闭1小时。

[0077] 6)使用mini离心机spindownEP管，沉淀类器官，并在显微镜下观察。

[0078] 7)吸出Blocking buffer，注意不要干扰EP管底部的类器官。

[0079] 8)将一抗稀释，加入EP管，使之没过EP管底部的类器官。

[0080] 9)在摇床上于4℃孵育2天，使一抗能够完全渗透类器官。

[0081] 10)一抗孵育后，使用mini离心机spin downEP管，沉淀类器官，并用Wash buffer洗涤两次。

[0082] 11)4℃摇床上，于Wash buffer中洗涤两天。

[0083] 12)使用mini离心机spindownEP管，沉淀类器官，并去除Wash buffer。

[0084] 13)将二抗和DAPI稀释到抗体稀释缓冲液中，加入EP管，使之没过EP管底部的类器官。

[0085] 14)在摇床上于4℃孵育2天。

[0086] 15)使用mini离心机离心spin down EP管，沉淀类器官，并用Wash buffer洗涤两次。

[0087] 16)4℃摇床上，于Wash buffer中洗涤两天。

[0088] 17)使用mini离心机spin down EP管，沉淀类器官，去除Wash buffer，将类器官重悬于防荧光淬灭封片剂mounting media中。

[0089] 18)使用iSpacer密封。

[0090] 本发明的又一具体实施方式中，所述RNA提取方法中，优选使用TRIzol进行裂解。

[0091] 本发明的又一具体实施方式中，所述图像捕获和生物标记分析方法中，优选使用共聚焦Z‑step成像方法，从而有利于拍摄出更加清晰的鼻类器官3D结构。

[0092] 以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0093] 实施例

[0094] 一、材料

[0095] 1、细胞来源。

[0096] 人鼻黏膜上皮细胞(hNECs)由山东大学提供。自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA)获得的3T3小鼠成纤维细胞用作细胞滋养层。

[0097] 2、细胞培养液及3D培养材料。

[0098]

[0099]

[0100] 3、免疫荧光染色抗体及试剂

[0101]

[0102] 二、建立人鼻黏膜上皮3D类器官模型的方法探索与比较

[0103] (一)实验方法

[0104] 探索了三种使用人鼻黏膜上皮原代细胞生成类器官的方法，如图1所示。在此过程中，使用前期建立、目前已十分成熟的Transwell培养作为监测hNECs(human nasalepithelial cells，鼻黏膜上皮细胞)活性及分化能力的平行对照。详细步骤如下：

[0105] (1)自鼻黏膜组织分离hNECs：鼻内镜手术中收集的鼻息肉组织以及下鼻甲黏膜，在离体1小时内经过冷PBS清洗后，放入含有100IU/ml抗生素‑抗真菌的Hanks盐平衡溶液中。然后在通风橱内使用灭菌剪刀将组织剪成小块，加入10mg/ml的DispaseⅡ酶，于4℃摇床消化过夜。离心后弃去上清，加入0.05％胰酶(含EDTA)于37℃水浴上消化15min。消化过的组织经过反复吹打以及经100μm的滤网收集分离的上皮细胞。加入培养基后终止消化过程，分离得到的单细胞(原代细胞，P0)悬液经过PBS清洗后备用。

[0106] (2)滋养层细胞的准备：使用3T3小鼠成纤维细胞作为滋养层细胞。在培养基中加入10μg/ml的丝裂霉素C，过夜处理后，在新鲜培养基中生长2‑3天，使细胞恢复良好状态。

[0107] (3)hNECs的体外扩增：在扩增培养基中，以2×103个/cm2的细胞密度将hNECs接种在3T3细胞上。当hNECs增殖达到80％融合后，收获细胞用于后续类器官和Transwell培养：使用细胞消化液(Accutase，Invitrogen)消化细胞1分钟，并反复轻轻吸打，将3T3小鼠成纤维细胞(即滋养层细胞)与hNECs细胞分离。去除3T3细胞后，使用PBS洗涤细胞两次。然后加入新鲜的细胞消化液(Accutase，Invitrogen)，在37℃下孵育7分钟，从而将3T3细胞与hNECs完全分离。(具体的培养条件见表1)。

[0108] (4)Transwell培养：使用0.4μm的Transwell，插入24孔板。将5×104的hNECs重悬于100μl扩增培养基，将其加入Transwell中，在24孔板的孔内、Transwell之下另外加入350μl的扩增培养基。

[0109] 以上步骤均已公开发表，参考文献为：Zhao,Xuening,et al."The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to producefunctioning ciliated cells in vitro."American Journal of Rhinology&Allergy26.5(2012):345‑350.

[0110] 以下为本发明创新性探索内容：

[0111] (5)U形底(U‑bottom)类器官培养法：

[0112] ①将hNECs重悬于100μl类器官培养基中，浓度分别为5×103、2.5×103、1×103；②接种在96孔板的低位液面中。

[0113] ③将96孔板以1500rpm离心2分钟。

[0114] ④将96孔板转移到37℃、5％CO2的加湿培养箱中。每4天更换50％培养基。

[0115] (6)胶汽液平(GelALI)类器官培养法：

[0116] ①使用类器官培养基将Matrigel稀释至40％浓度，并包被在24孔板上。

[0117] ②37℃孵育20分钟。

[0118] ③将1×104hNECs重悬于含5％Matrigel的500μl类器官培养基中。

[0119] ④接种在上述准备好的24孔板上。

[0120] ⑤将24孔板转移到37℃、5％CO2的加湿培养箱中。每4天更换50％培养基。

[0121] (7)胶包埋(GelEmbedding)类器官培养法：

[0122] ①使用类器官培养基将Matrigel稀释至60％浓度。

[0123] ②将1×103hNECs重悬于在20μl60％浓度的Matrigel。

[0124] ③在24孔板上以小滴形式播种hNECs。

[0125] ④37℃10分钟，使胶凝固化。

[0126] ⑤每孔加入500μl类器官培养基，覆盖凝胶。

[0127] ⑥将24孔板转移到37℃、5％CO2的加湿培养箱中。每4天更换培养基。

[0128] 表1.Transwell和类器官培养的具体条件

[0129]

[0130] (二)结果

[0131] 1、0‑7天使用显微镜观测细胞/类器官的生长情况

[0132] 在播种hNECs后，使用显微镜连续监测7天，观察细胞的形态及聚集情况(图2)。

[0133] ①U‑bottom：在培养的第二天形成一个良好的类器官结构，边界清晰。

[0134] ②GelALI：在培养的第三天可以观察到类器官结构。

[0135] ③Gel Embedding：在培养的第四天显示出明显的类器官结构。

[0136] 与U‑bottom相比，Gel ALI和Gel Embedding中的细胞类器官在初始期空间较小，在培养四天后生长成更为紧密的结构。

[0137] 2、7天后使用显微镜观测细胞/类器官的分化情况

[0138] ①U‑bottom：

[0139] 当类器官长到200μm以上，在培养的第7天加入分化培养基。在此后的分化过程中，类器官的大小没有太大变化。在分化的第6天，可以在类器官的外层可观察到摆动的纤毛，而类器官的大小较前减小(尺寸减小到100‑200μm)，如图3所示。

[0140] ②Gel ALI：

[0141] 在培养的第7天，Gel ALI中类器官的大小达到200 300μm。但是类器官生长过密，无法启动分化。使用1ml TrypLE Express(Invitrogen‑12605036)将致密的类器官消化，并在37℃下孵育5分钟，然后使用移液管进行反复吹打，从而机械性的将类器官分离，以达到传代的目的。随后加入10ml类器官培养基，使用300rcf下离心5分钟。随后将其重悬于60％的基质胶Matrigel中，并加入分化培养基，之后使用Gelembedding的方法对类器官球进行传代，按照1：6的比例稀释后在24孔板内重新播种。随后在孔内将分化培养基加满，完全覆盖固化的Matrigel液滴。

[0142] 如图4所示，类器官的大小在相互分离后减小到100μm左右，之后逐渐增长，并在第21天增长到300‑400μm，在此时间点，大量的、具有纤毛摆动的纤毛细胞出现。同时，类器官的内部变得略微透明并形成大小均一的空腔。在腔的内边缘可以观察到摆动的纤毛细胞。

[0143] ③Gel Embedding：

[0144] 在培养7天后，开始有类器官开始附着在培养板的底部，随后扩展为单层结构。在培养9天后，越来越多的原代细胞类器官失去了3D结构，因此停止了这种培养方法。

[0145] 三、细胞播种的数量的优化与探索

[0146] 由于Gel ALI和Gel Embedding中的细胞的聚集是随机形成的，无法通过优化细胞接种数量来控制类器官的大小。因此，采用U‑bottom法来探索细胞播种数量对类器官形成的影响，并使用imageJ对类器官进行图像分析。

[0147] 与接种细胞数量较少的孔相比，5×103个hNECs接种的孔产生的类器官数量较多(图5A)，但接种细胞数对类器官的圆度无影响(图5B)。细胞接种数量越多，类器官的直径略有增加。但是，三组不同的细胞接种密度下，在分化的第12天观察到的类器官直径没有显着差异(图5C)。此外，对类器官的透明度的评估发现，每个类器官中的细胞密度与细胞接种数量呈正相关(图5D)。

[0148] 四、比较类器官培养和传统的ALI气‑液培养中的细胞形态和分化过程

[0149] 在传统的ALI培养中，带气孔的Transwell底面可以形成气液界面培养环境。将hNECs以高密度(100kcells)接种在Transwell小室中，培养使其扩增，3天可相互融合。然后除去来自上层和底层的培养基，并将分化培养基加入到底层中。分化约21天可以观察到摆动的纤毛。如图6所示，使用Transwell这一平行对照方法，可在分化21天后成功生成分化的鼻黏膜上皮，其纤毛细胞(β‑IV微管蛋白，绿色)和杯状细胞(MUC5AC，红色)的染色呈阳性。

[0150] GelALI培养来源的类器官产生分化的摆动的纤毛细胞的天数与Transwell相似。在分化环境中培养类器官约21天，可在Gel ALI类器官内部形成的空腔中观察到摆动的纤毛。而使用U‑bottom方法进行培养的类器官，在分化5天后即能观察到纤毛的摆动。

[0151] 五、优化鼻类器官下游分析方法

[0152] 1、类器官免疫荧光染色的方法优化

[0153] 3D类器官的染色最困难的部分是抗体的渗透。因此，延长了抗体的孵育时间，并在每个步骤中添加了TritonX‑100以辅助试剂的渗透(用于染色的试剂列于表2)。

[0154] 表2.用于荧光染色的试剂

[0155]

[0156]

[0157] 优化的方法如下：

[0158] 1)在1.5mL Eppendorf管(EP管)中收集鼻黏膜类器官。

[0159] 2)用Wash buffer洗涤两次。

[0160] 3)用4％PFA固定类器官10分钟。

[0161] 4)用Wash buffer洗涤两次。

[0162] 5)用Blocking buffer封闭1小时。

[0163] 6)使用mini离心机spindownEP管，沉淀类器官，并在显微镜下观察。

[0164] 7)吸出Blocking buffer，注意不要干扰EP管底部的类器官。

[0165] 8)将一抗稀释，加入EP管，使之没过EP管底部的类器官。

[0166] 9)在摇床上于4℃孵育2天，使一抗能够完全渗透类器官。

[0167] 10)一抗孵育后，使用mini离心机spin downEP管，沉淀类器官，并用Wash buffer洗涤两次。

[0168] 11)4℃摇床上，于Wash buffer中洗涤两天。

[0169] 12)使用mini离心机spindownEP管，沉淀类器官，并去除Wash buffer。

[0170] 13)将二抗和DAPI稀释到抗体稀释缓冲液中，加入EP管，使之没过EP管底部的类器官。

[0171] 14)在摇床上于4℃孵育2天。

[0172] 15)使用mini离心机离心spin down EP管，沉淀类器官，并用Wash buffer洗涤两次。

[0173] 16)4℃摇床上，于Wash buffer中洗涤两天。

[0174] 17)使用mini离心机spin down EP管，沉淀类器官，去除Wash buffer，将类器官重悬于防荧光淬灭封片剂mounting media中。

[0175] 18)使用iSpacer密封(图7)。

[0176] 2、成像的优化

[0177] 在本研究中，探索了两种获得3D鼻类器官图像的方法。如图8所示，与共聚焦Z‑step成像方法(Zeiss LSM 700)相比，Olympus BX51荧光显微镜无法良好的拍摄出鼻类器官3D结构。

[0178] 使用Zeiss LSM 700共聚焦系统进一步评估了不同放大倍数下的图像质量(图9)。放大400倍的图像可显示类器官更多的结构细节。

[0179] 同时发现，不同方法的3D成像图均表明，不同的培养方法会影响鼻黏膜类器官内部结构的形成。

[0180] 与在相差显微镜下观察到现象的一致，U‑bottom培育的鼻黏膜类器官生长出的纤毛(绿色染色)覆盖于类器官的外层，而GelALI培育来源的类器官的纤毛(绿色染色)位于其内部的空腔边缘。(图3、4、9)

[0181] 3、RNA提取方法的优化

[0182] 收集了U‑bottom和Gel ALI两种培养方式的类器官。

[0183] 使用了两种裂解液：来自E.Z.N.A.总RNA试剂盒(Omega)的TRK裂解缓冲液和TRIzol，而类器官只能被TRIzol完全裂解。因此，使用TRIzol RNA提取步骤(Invitrogen)进行鼻黏膜类器官RNA的提取。

[0184] 此外，对U‑bottom培养方式，从四个类器官中收获了167ng的总RNA，从三个类器官收获了仅40ng的总RNA(OD260/280分别为1.4和1.6)。因此，对于鼻黏膜类器官的RNA提取和基因分析，建议应收集至少四个以上的类器官进行RNA提取，以保证RNA的质与量。另外，使用针对少量细胞的RNA提取的商业试剂盒(细胞数少于500k)可用于改善类器官RNA提取的质量。如果使用类器官进行测序分析，建议使用一步式PCR或第三代测序方法以减少程序步骤，从而最大程度的降低鼻黏膜类器官的RNA损耗，提高其利用率。

[0185] 六、培养方法稳定性的比较(批次间的比较)

[0186] 为了评估培养方法的稳定性，重复了U‑bottom和GelALI这两种方法。根据图5C中的结果，鼻黏膜类器官的大小并不受U‑bottom法细胞接种数量的影响。因此，在96孔板上以每孔1K个细胞播种了60个孔，以进行第一批验证，并在细胞球体形成后开始分化(第5天)。分化7天后，在73％的孔中观察到了摆动的纤毛，类器官的大小比第1批略小(图10A)。使用imageJ3D对象计数插件(https://imagej.net/3D_Objects_Counter)对纤毛密度进行评估。与第1批的数据相比，第2批类器官的纤毛密度较低。

[0187] 此外，第二批次的GelALI培养在分化后20天左右出现摆动的纤毛，这与第一批的实验结果一致。

[0188] 七、鼻黏膜上皮干细胞培育成鼻黏膜类器官过程的其它发现

[0189] 在培养鼻黏膜原代上皮细胞的第二天，惊讶地发现在2D培养环境中上清液中可自发形成原代类器官。捕获这些原代类器官，并通过凝胶包埋法(Gel Embedding)将其播种(图11A)。在凝胶包埋培养2天后，观察到三种主要类器官的表型：透明类器官、实心类器官和管状结构类器官(图11B)。除此之外，还有贴壁的、单层生长的细胞和表达鼻上皮祖细胞标记物(KRT5)的细胞。在透明的类器官中可以观察到摆动的纤毛，而在固体和管状结构的类器官中未观察到摆动的纤毛。在GelALI研究中，已经验证那些实心类器官是带有KRT5阳性染色的鼻祖细胞(图8)。这三个表型可以在凝胶包埋培养中以类器官的模式进行传代(图11C和D)。但是，随着传代次数的增加，透明类器官的数量逐渐减少，而实心类器官相应增加。这可能是由于鼻黏膜类器官培养基对细胞的类型具有一定的选择作用。

[0190] 在图11E中，对P2类器官的免疫荧光染色表明，来自初级类器官的细胞混合群体可以在凝胶包埋培养和传代系统中得以维持。

[0191] 在本实施例中，成功开发了两种简单且可重复的方法来建立人鼻黏膜类器官。这一3D模型可在体外成功模拟了鼻上皮的功能性细胞形态。此外，还建立并优化了3D类器官的下游检测方法，例如荧光染色、RNA提取、图像捕获和生物标记分析。

[0192] 在GelALI方法中，鼻上皮祖细胞在3D环境中增殖和分化。分化需要21天，这与transwell培养方法相同。然而，类器官内部产生的腔状结构表明，这种分化过程可能在生理上与鼻腔发育有关。这为提供了一个从发育生物学的角度了解鼻部疾病的新工具。但是，由于Matrigel的成本较高，且此方法培养的时间较长，不建议将该方法用于高通量药物筛选。

[0193] 在U‑bottom方法中，鼻黏膜上皮细胞的成熟速度更快(仅7天)，并且与transwell方法(播种细胞数从100k到1k)相比，细胞播种数量减少了100倍。这种培养技术为体外人体鼻黏膜的建模提供了另一种经济高效的方法，并为鼻黏膜上皮的高通量药物筛选和个体用药优化提供了可能性。

[0194] 但目前此3D鼻黏膜类器官也存在一些限制因素：首先，仅使用了两个样本来优化该方法，后期仍需要在更大的样本量中验证此方法的稳定性。其次，类器官的图像采集和分析花费了较多的时间，仅单个样本就需要一个小时。因此，开发用于图像捕获和3D类器官分析的自动化方法是十分必要的。最后，由于细胞数较少，从每个类器官分离的RNA质量欠佳。因此，为了避免在RNA分析过程中样品的损耗，建议对3D鼻黏膜类器官的基因表达分析应用一步式PCR方法或第三代测序方法。

[0195] 从鼻上皮祖细胞产生类器官、追踪其分化产生的3D结构，可以为鼻部疾病的基础研究提供新的思路。这些3D鼻类器官还可用于预测个体用药的药物反应(例如不同鼻息肉、鼻窦炎或过敏性鼻炎患者对鼻用糖皮质激素、鼻用抗组胺药的敏感程度)。该方法建立的鼻类器官仅需要Transwell 1/100的细胞数量，其简单、易操作、低成本的培养方法可以适用于使用鼻刷刷取的鼻黏膜样本，使鼻黏膜慢性炎症性疾病的个体话诊断和药物敏感性测试成为可能。此外，这种具有低成本、高效益的3D模型可以用于药物研发，作为药物应用于临床之前的体外模型，高通量筛选治疗鼻部疾病的新药。

[0196] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。