OsPIL16基因的新用途

摘要

本发明公开了OsPIL16基因或其蛋白在调控水稻穗长中的用途。本发明还公开了一种增加水稻穗长的方法、一种筛选长穗水稻的试剂盒和方法。本发明人利用CRISPR/Cas9系统将OsPIL16基因敲除后，水稻的穗长显著增加，表明OsPIL16基因能够显著调控水稻穗长，对穗长的遗传改良及培育高产水稻具有重要的理论和实际意义。

权利要求

1.OsPIL16基因或其编码蛋白在调控水稻穗长中的用途。

2.一种增加水稻穗长的方法，其特征在于：抑制水稻OsPIL16基因的表达，和/或减少OsPIL16基因编码蛋白的活性，即可。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法使用的试剂为敲除OsPIL16基因的试剂、使OsPIL16基因沉默的试剂或OsPIL16基因的抑制剂。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：它是利用CRISPR/Cas9系统抑制OsPIL16基因的表达，步骤如下：a、合成SEQ ID NO：1所述的序列；

b、插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

c、将步骤b的重组表达载体转化水稻，鉴定并确认水稻的OsPIL16基因被敲除，即可。

5.一种获得长穗水稻的方法，其特征在于：抑制水稻OsPIL16基因的表达，和/或减少OsPIL16基因编码蛋白的活性，获得长穗水稻植株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：水稻育种时，至少一个亲本为权利要求5的长穗水稻。

7.OsPIL16基因或其编码蛋白在筛选长穗水稻中的用途。

8.一种筛选长穗水稻的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、检测待筛选水稻的OsPIL16基因表达量、OsPIL16蛋白的表达量，和/或OsPIL16蛋白的活性；

b、选出OsPIL16基因表达量降低或无表达，OsPIL16蛋白表达量降低或无表达，和/或OsPIL16基因蛋白活性降低或无活性的水稻植株。

说明书

OsPIL16基因的新用途

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及OsPIL16基因或其编码蛋白在调控水稻穗长中的用途。

背景技术

[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球半数以上人口以水稻为主食，水稻产量对全球粮食安全具有举足轻重的作用。水稻产量的构成受制于各种穗部性状，其中穗长是水稻穗部性状的重要组成部分，也是水稻理想株型的一个关键指标，与产量密切相关，因此，有关穗长的遗传机制一直是水稻遗传育种学家研究的热点。

[0003] 水稻穗长是典型的数量性状，由多个基因控制，检测穗长性状的数量性状位点(QTL)并进行遗传效应分析对提高水稻产量具有重要意义。经过多年研究，目前在水稻穗长的分子遗传机理方面已取得一定成就，但至今所检测的控制穗长的QTL较少实现精细定位和克隆，通过基因工程技术改善水稻穗长的报道仍相当有限。

[0004] OsPIL16基因，是水稻中光敏色素相互作用因子(PIF)家族的一员，由Nakamura等人(2007)通过同源性分析在水稻基因组中鉴定获得。目前已知该基因参与到水稻的株高、分蘖数调控和环境耐受性等方面，未见其与水稻穗长相关的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供水稻OsPIL16基因的新用途。

[0006] 本发明提供了水稻OsPIL16基因或其编码蛋白在调控水稻穗长中的用途。

[0007] 本发明还提供了一种增加水稻穗长的方法，抑制水稻OsPIL16基因的表达，和/或减少OsPIL16基因编码蛋白的活性，即可。

[0008] 其中，所述方法使用的试剂为敲除OsPIL16基因的试剂、使OsPIL16基因沉默的试剂或OsPIL16基因的抑制剂。

[0009] SEQ ID NO.1：5’‑ATGCTACGCGGGAACGACACCGG‑3’。

[0010] 其中，它是利用CRISPR/Cas9系统抑制OsPIL16基因的表达，步骤如下：

[0011] a、合成SEQ ID NO：1所述的序列；

[0012] b、插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

[0013] c、将步骤b的重组表达载体转化水稻，鉴定并确认水稻的OsPIL16基因被敲除，即可。

[0014] 本发明还提供了一种获得长穗水稻的方法，抑制水稻OsPIL16基因的表达，和/或减少OsPIL16基因编码蛋白的活性，获得长穗水稻植株。

[0015] 其中，水稻育种时，至少一个亲本为权利要求6的长穗水稻。

[0016] 本发明还提供了OsPIL16基因或其编码蛋白在筛选长穗水稻中的用途。

[0017] 本发明还提供了一种筛选长穗水稻的方法，包括以下步骤：

[0018] a、检测待筛选水稻的OsPIL16基因表达量、OsPIL16蛋白的表达量，和/或OsPIL16蛋白的活性；

[0019] b、选出OsPIL16基因表达量降低或无表达，OsPIL16蛋白表达量降低或无表达，和/或OsPIL16基因蛋白活性降低或无活性的水稻植株。

[0020] 本发明人经过深入研究发现，水稻中OsPIL16基因被敲除后，穗长显著增加，为穗长的遗传改良及培育高产水稻的理想型性状提供了良好的理论基础，也为进一步充分挖掘水稻生产潜力、提高水稻产量提供了科学依据，应用前景良好。

[0021] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0022] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0023] 图1OsPIL16敲除水稻材料的电泳图：M1和M2：Marker DL2501；1‑11:T2代纯系鉴定PCR产物条带。

[0024] 图2OsPIL16过表达水稻材料的电泳图：M：Marker DL2501；1：日本晴DNA阴性对照；2‑9:T2代纯系鉴定PCR产物条带。

[0025] 图3不同水稻株系的穗长比较图，上下分别为穗自然状态和摊开小穗。

具体实施方式

[0026] 下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

[0027] 本发明所用的试剂及仪器如下：

[0028] (1)菌株和载体：

[0029] 大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101，CRISPR/Cas9载体BGK03，均购自杭州百格生物技术有限公司。

[0030] (2)化学试剂、酶制剂及试剂盒：

[0031] 诺唯赞生物科技有限公司：高保真DNA聚合酶(货号：P501‑d1)；

[0032] 上海捷瑞生物工程有限公司：DL 2501marker、DL 2504marker；

[0033] 北京索莱宝科技有限公司：西班牙琼脂糖(货号：YZQZT)；

[0034] 南京金斯瑞生物科技有限公司：DNA测序；

[0035] 天根生化科技有限公司：植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP305‑03)；康为世纪生物科技公司：Gel ExtractionKit(货号：CW2302M)。

[0036] (3)主要实验仪器：

[0037] eppendorf系列移液器；applied biosystems系列PCR仪；Tanon 2500凝胶成像系统。

[0038] (4)农杆菌转化过程所用各培养基组份如下：

[0039]

[0040]

[0041] 实施例1OsPIL16敲除水稻材料的获得

[0042] 一.构建靶向OsPIL16基因的sgRNA载体

[0043] 根据Genbank公布的OsPIL16序列，在OsPIL16外显子区域靠近起始密码ATG区域选择一段20bp的序列(5’‑ATGCTACGCGGGAACGACACCGG‑3’)(SEQ ID NO.1)作为CRISPR/Cas9敲除的靶位点，该序列3’端PAM序列为CGG。

[0044] CRISPR/Cas9表达载体BGK03的靶序列由水稻U6启动子驱动，编码Cas9蛋白基因由加强型玉米(UBI)启动子驱动。将合成靶位点的核苷酸序列与BGK03载体相连命名为BGK03‑OsPIL16。

[0045] BGK03‑OsPIL16重组载体的构建使用百格公司提供的CRISPR/Cas构建试剂盒来完成。具体步骤如下：

[0046] (1)设计gDNA靶点序列：5’‑ATGCTACGCGGGAACGACACCGG‑3’(SEQ ID NO.1)，其中CGG为PAM序列。之后按要求合成Oligo序列:

[0047] UP：5’‑TGTGTGATGCTACGCGGGAACGACAC‑3’(SEQ ID NO.2)

[0048] LOW:5’‑AAACGTGTCGTTCCCGCGTAGCATGA‑3(SEQ ID NO.3)。(2)将合成的Oligo序列加水溶解至10μl，按BufferAneal 18μl、UP Oligo1μl、Low Oligo 1μl反应体系混合后，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃。

[0049] (3)将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas9载体。配置反应体系：H2O 6μl、CRISPR/Cas9 Vector 2μl、Oligo二聚体1μl、Enzyme Mix 1μl，在冰上混合各个组分，混匀后室温(20℃)反应1小时，即可得到重组载体。

[0050] (4)将得到的重组载体转化大肠杆菌DH5α，取5μl反应液加到至少50μl的感受态细胞中，混匀后冰浴静置30分钟(期间切勿晃动，严格保持静置)；轻轻取出，42℃热激60秒，立即置于冰上2分钟；加入500μl SOB/LB，37℃200rpm培养1小时；取菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。之后挑取单菌落扩摇提质粒，送去公司测序(测序引物为：5’‑CCCAGTCACGACGTTGTAAA‑3’，SEQ ID NO.4)，验证构建的重组载体。获得测序正确的BGK03‑OsPIL16重组载体。

[0051] 二.敲除水稻中的OsPIL16

[0052] 首先将验证后的BGK03‑OsPIL16重组载体转化农杆菌GV3101，方法如下：

[0053] (1)取感受态农杆菌细胞200μl，加入质粒2‑5μl后，于冰上放置10min；

[0054] (2)从冰中取出后立即置于液氮中，速冻10min；

[0055] (3)拿出后置于37℃，300rpm，10min；

[0056] (4)加入800μl LB液体培养基，28℃，350rpm，3h；

[0057] (5)6000rpm离心，吸去上清800μl，涂板；

[0058] (6)于28℃培养48h；

[0059] (7)挑取转化子，提取质粒BGK03‑OsPIL16，用BGK03序列引物进行PCR鉴定，将鉴定的阳性条带送去测序，确保无误后可用于转化水稻。

[0060] 再用常规的农杆菌浸染法，将验证过的含重组载体的农杆菌GV3101转化水稻日本晴品种，获得T1代敲除株系的幼苗。

[0061] 三、OsPIL16敲除水稻材料的鉴定以及敲除位点分析

[0062] 本发明根据OsPIL16基因的敲除靶位点序列设计如下检测引物，扩增大小为415bp：

[0063] F:5’‑TTAGCTCGTCTACTCAGTGGGG‑3’(SEQ ID NO.5)，

[0064] R:5’‑CAGGTGAAGGGCTGGAAGG‑3’(SEQ ID NO.6)。

[0065] 采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取OsPIL16敲除植株的DNA，具体步骤如下：

[0066] 1.取植物新鲜组织约100mg或干重组织30mg，加入液氮充分碾磨。

[0067] 2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

[0068] 3.加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。

[0069] 4.小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

[0070] 5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃掉废液。(吸附柱容积为700μl左右，可分次加入离心)

[0071] 6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0072] 7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

[0073] 8.重复操作步骤7。

[0074] 9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

[0075] 10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50‑200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2‑5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，即可获得基因组DNA。

[0076] 对获得的基因组DNA用检测引物进行PCR扩增，PCR扩增的体系为：Super‑Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，5×SF Buffer(with 10mM MgSO4)5μL，5×PCR Enhancer 3μL，dNTP Mix(10mM each)0.5μL，上下游引物各1μL，DNA 1μL。PCR反应程序为：
95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，40个循环；72℃5min，16℃保存。

[0077] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，并切胶回收，送测序。

[0078] 将PCR产物测序与敲除位点用软件SnapGene进行序列比对，若比对结果为双峰且有突变则为杂合突变，还需进行T1代的筛选(筛选方法与T0代的筛选过程相同)，若比对结果是单峰且有突变位点则为纯合突变。

[0079] 经鉴定得到两个纯合的敲除株系，分别命名为ospil16‑3与ospil16‑10。其中，ospil16‑3株系为起始密码子后18bp位点处插入一个T突变，ospil16‑10株系为起始密码子后16、17bp位点发生缺失突变，突变后均导致基因编码的蛋白质提前终止，其突变位点示意如下：

[0080] WT：ATGCTACGCGGGAACGACAC

[0081] ospil16‑3： (加粗部分为突变位点)

[0082] ospil16‑10：ATGCTACGCGGGAAC..CAC

[0083] 各自序列如下：

[0084] WT中OsPIL16全序列为：(SEQ ID NO.7)

[0085]

[0086]

[0087] ospil16‑3株系基因组中OsPIL16全序列为：(SEQ ID NO.8)

[0088]

[0089]

[0090] ospil 16‑10株系基因组中OsPIL16全序列为：(SEQ ID NO.9)

[0091]

[0092]

[0093] 实施例2 OsPIL16过表达水稻材料的获得

[0094] 一、OsPIL16基因的克隆及过表达载体构建

[0095] 首先根据OsPIL16基因的序列设计如下引物：

[0096] F：5’‑TCATCCGTCTGCATGCTACG‑3’(SEQ ID NO.10)，R:5’‑GCCGTCACGCCTGCTTCAC‑3’(SEQ ID NO.11)。

[0097] 利用RT‑PCR技术从水稻日本晴总cDNA中扩增得到OsPIL16基因全长cDNA(开放阅读框部分)，经测序表明为PIFs家族转录因子，OsPIL16的全长cDNA为1518bp(SEQ ID NO.7)，编码一个由506个氨基酸组成的蛋白。具体步骤如下：

[0098] 取四叶期日本晴水稻幼苗，液氮速冻，放置‑70℃冰箱中保存以备提取总RNA。总RNA抽提采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取.水稻cDNA的合成按Fermentas公司的RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作进行第一链合成。

[0099] 以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F和R引物，利用RT‑PCR进行cDNA扩增，扩增条件为：94℃预热5min；94℃,40s,57℃,40s,72℃,2min,共35个循环；72℃,10min。PCR结束后进行电泳分析，采用百泰克公司的DNA回收试剂盒回收约1500bp的扩增片段。将扩增片段连接到TaKaRa公司的pMD19‑T载体，转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到华大公司测序。

[0100] 根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列为OsPIL16基因。

[0101] 然后将含OsPIL16基因的质粒经BamHI+KpnI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收1518bp的OsPIL16 DNA片段，将此片段与相应酶切的p1011载体相连，获得的载体命名为p1011‑OsPIL16。

[0102] 二、OsPIL16过表达载体经农杆菌介导转化水稻

[0103] 农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。质粒p1011‑OsPIL16经电击法导入农杆菌中。挑取单菌到25mlYEB培养基(50mg/l利福平)培养过夜，取5ml菌液转接到100mlYEB培养基(50mg/l利福平)，培养至OD600＝0.7‑0.8，菌液冰上放置10min，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml 10％甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl 10％甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒p1011‑OsPIL16。用去头的枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。
电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

[0104] 植物转化采用农杆菌介导法取在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/L卡那霉素(Kanamycin，Km)的LB固体培养基上活化后，挑取单菌落接种到3ml含50mg/L Km的LB液体培养基中，于28℃振摇培养过夜；再按1/100(v/v)接种量接种于AB液体培养基中。当培养至对数生长期时，离心收集农杆菌并重悬于10‑15mlAAM(含100‑400μmol/l乙酰丁香酮)液体培养基中，立即用于水稻受体材料的共培养。将已培养好的未成熟胚或成熟胚来源的初生愈伤组织浸泡于此农杆菌菌液中。侵染20min后将愈伤组织放在无菌滤纸上吸干过多的菌液，然后将愈伤组织转入N6D2C培养基上于28℃黑暗条件下共培养3天。将经农杆菌浸染后的愈伤组织转入含25mg/l潮霉素和600mg/l头孢霉素的选择培养基CCD2S1培养基上进行第一轮筛选培养；两周后将长出的新鲜抗性愈伤组织再转入含50mg/l潮霉素和300mg/l头孢霉素的选择培养基CCD2S2上继续筛选2代(2周/代)。愈伤组织经过连续3代筛选后，选择生长旺盛的新鲜抗性愈伤组织转移到预分化培养基MSPR上进行预分化。2周后再将预分化的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSR上，于12hr光照/天、28℃条件下进行分化。再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗，最后移到田间或温室栽培。转基因水稻按常规方法进行栽培管理。利用50mg/mL潮霉素对转化植株叶片进行初筛，再通过PCR进一步鉴定，获得T0代转基因植株，用同样的方法筛选获得T1代转基因阳性植株及T2代转基因纯合材料。

[0105] 三、OsPIL16过表达水稻株系的鉴定

[0106] 采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取OsPIL16过表达植株的DNA。取1μl转基因水稻DNA作为模板，以检测引物F:

[0107] 5’‑:ATGCTCACCCTGTTGTTTGG‑3’(SEQ ID NO.12)，

[0108] R:5’‑CACGACAGGGTGGTAATGC‑3’(SEQ ID NO.13)进行PCR扩增，

[0109] 扩增条件为：94℃预热5min；94℃,40s,58℃,40s,72℃,2min，共35个循环；72℃,10min。扩增出长度为313bp的目的片段(见图2)，经测序证明该片段为重组载体p1011‑OsPIL16的片段，证明重组载体已转化入水稻。

[0110] 筛选阳性，并在T2代的时候得到两个纯系株系，分别命名为OE8、OE9。

[0111] 实施例3 OsPIL16调控水稻穗长的效果验证

[0112] 将鉴定出来的OsPIL16敲除株系ospil16‑3、ospil16‑10(也称16‑3和16‑10)和过表达株系OB8、OB9，分别种植于扬州市里下河农科所，待其成熟之后进行收获并统计农艺学性状。统计的农艺学性状有：穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、每穗二级小穗数。穗长为穗颈节至穗顶部间的长度(见图2)。

[0113] 其中，WT(野生型)统计125株，敲除株系16‑3和16‑10各统计120株，过表达株系OB8和OB9各统计200株。

[0114] 统计数据采用软件为prism5.0进行分析，分析方法为单因素方差分析(One‑way ANOVA)。

[0115] 统计结果见表1‑3(表中，与WT相比，*为差异显著；**为差异极显著)。

[0116] 表1不同水稻株系的穗长统计

[0117]株系 穗长(cm)
WT 18.61±2.69
OE8 15.70±2.72**
OE9 15.25±2.20**
16‑3 19.91±2.15**
16‑10 19.61±2.52*

[0118] 由表1可知，与野生型品种相比，OsPIL16过表达株系的穗长显著变短，而OsPIL16敲除株系的穗长显著变长，表明OsPIL16对调控水稻穗长发挥重要作用。

[0119] 表2不同水稻株系的每穗粒数统计

[0120]株系 穗总粒数 穗实粒数
WT 89.34±18.34 73.31±16.67
OE8 67.33±8.99** 56±8.12**
OE9 53.14±6.76** 43.03±6.98**
16‑3 124.75±20.63** 103.56±16.09**
16‑10 115.86±14.29** 91.97±11.80**

[0121] 表3不同水稻株系的籽粒变化统计

[0122]株系 籽粒长度(mm) 籽粒宽度(mm) 籽粒厚度(mm)
WT 7.41±0.21 3.09±0.15 2.24±0.08
OE8 7.46±0.21 2.95±0.08** 2.08±0.07**
OE9 7.43±0.20 2.54±0.11** 2.01±0.05**
16‑10 7.66±0.29** 3.39±0.18** 2.36±0.07**

[0123] 由表2‑3可知，OsPIL16不仅调控水稻穗长，还参与调控每穗粒数和籽粒大小。与野生型品种相比，OsPIL16过表达株系的每穗粒数变少，籽粒变窄、厚度减少，而OsPIL16敲除株系的每穗粒数显著增多、籽粒显著变大，表现出良好的增产趋势，更接近于理想株型。

[0124] 综上，OsPIL16基因能够显著调控水稻穗长，可用于穗长的遗传改良及高产水稻培育。