中性粒细胞弹性蛋白酶在制备诊断胆道闭锁的产品中的应用

摘要

本发明提供了一种中性粒细胞弹性蛋白酶在制备诊断胆道闭锁的产品中的应用，涉及分子诊断技术领域，本发明通过检测大量的BA患儿样本，并结合体内和体外实验，首先证实了BA肝脏组织和外周血中NE的表达可作为提高BA的诊断和评估肝损伤程度的有力指标，因此检测NE的表达可作为临床上诊断和评估BA患儿的病情提供更方便、直接、准确的方法。除此之外，本发明还证实了NE抑制剂在动物实验上起治疗作用，可用于治疗BA的药物研发。

权利要求

1.中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂在制备用于治疗胆道闭锁的药物中的应用；

所述中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂为Sivelestat。

说明书

中性粒细胞弹性蛋白酶在制备诊断胆道闭锁的产品中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及一种中性粒细胞弹性蛋白酶在制备诊断胆道闭锁的产品中的应用。

背景技术

[0002] 胆道闭锁(biliary atresia，BA)是婴幼儿慢性肝病最常见的病因，也是婴幼儿肝移植的主要适应症，病因及发病机制尚不明确。BA临床表现主要以皮肤、黏膜进行性黄疸、
陶土样大便、茶样尿及肝脾肿大等为主，其预后差，病死率高。我国是BA的高发地区，发病率
高达1/5000‑8000。目前BA的诊断主要依据术中造影和术后病理，治疗以Kasai术和肝移植
为主，虽然肝移植是BA患儿长期生存的希望，但由于多因素的限制导致肝移植无法满足所
有BA患儿，使得大部分BA患儿只能依靠Kasai术，Kasai术的最佳适宜年龄为小于60天。由于
当前缺乏精准的早期诊断方法和有效的治疗药物，BA患儿常常在出生后3‑5月时才被确诊，
导致大多数患儿Kasai术后预后不良及后期进行性胆管破坏和肝硬化而于2岁左右死亡。因
此，探索BA可能的早期诊断方法和临床治疗药物成为当前亟需。

[0003] 目前BA诊断方法较多，其方法主要包括：

[0004] (1)动态观察外周血胆红素：每周检测患儿的血清胆红素，BA患儿直接胆红素一般呈进行性升高，但重型肝炎时亦可表现为持续性上升，这种情况鉴别较困难；

[0005] (2)超声：若未见胆囊或见有小胆囊(1.5cm以下)，则疑为BA，若见有正常胆囊存在，则支持肝炎，如能看出肝内胆管的分布形态，则更能帮助诊断。但有时在B超下胆囊和胆
管的显示与术中不符，导致B超诊断BA的精准率下降；

[0006] (3)术中胆管造影及术后病理检查：虽然术中胆管造影及术后病理检查是诊断BA的“金标准”，但其为有创性检查，且此时诊断的患儿年龄均较大，可能不利于患儿术后的预
后。

[0007] 目前治疗BA最直接的方法是Kasai术和肝移植术：

[0008] (1)Kasai术：Kasai术为小儿外科中创伤性极大的手术，虽可改善部分BA患儿胆汁淤积的症状，但由于手术年龄大部分均较大，导致患儿术后预后较差；以及BA患儿后续会出
现胆管进行性破坏和肝纤维化，使得Kasai术大部分无法解决BA的根本问题；

[0009] (2)肝移植术：肝移植是BA患儿唯一长期存活的治疗方法，因我国肝源缺乏，无法满足所有BA患儿，且肝移植费用较高。

[0010] 由此可见，目前无论对于新生儿胆道闭锁的诊断还是治疗，均存在一定缺陷。因此寻找BA方便、快捷和精准的诊断手段和有效的治疗药物是十分必要的。

[0011] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0012] 本发明的主要目的在于提供检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质在制备用于诊断胆道闭锁的产品中的应用，以缓解现有技术中存在的至少一个技术问题。

[0013] 为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质在制备用于诊断胆道闭锁的产品中的应用。

[0014] 本发明还提供了检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质在制备用于评估胆道闭锁患儿肝脏损伤程度的产品中的应用。

[0015] 本发明还提供了检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质在制备用于预后评估胆道闭锁的产品中的应用。

[0016] 进一步的，所述检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质包括检测中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂。

[0017] 进一步的，所述检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质包括检测中性粒细胞弹性蛋白酶的仪器。

[0018] 本发明还提供了中性粒细胞弹性蛋白酶作为标志物在制备胆道闭锁的诊断产品中的应用。

[0019] 进一步的，所述诊断产品包括试剂或试剂盒。

[0020] 另外，本发明还提供了中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂在制备用于治疗胆道闭锁的产品中的应用。

[0021] 进一步的，所述产品包括药物。

[0022] 进一步的，所述中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂包括Sivelestat。

[0023] 本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

[0024] 本发明通过检测大量的BA患儿样本，并结合体内和体外实验，首先证实了BA肝脏组织和外周血中NE的表达可作为提高BA的诊断和评估肝损伤程度的有力指标，因此检测NE
的表达可作为临床上诊断和评估BA患儿的病情提供更方便、直接、准确的方法。

[0025] 除此之外，本发明还证实了NE抑制剂在动物实验上起治疗作用，可用于治疗BA的药物研发。

附图说明

[0026] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0027] 图1A为本发明实施例提供的NC、IHC及BA组儿童肝脏中NE免疫组化染色代表性图片；

[0028] 图1B为本发明实施例提供的使用ELISA方法检测NE在NC(n＝20)、IHC(n＝21)及BA(n＝21)患儿外周血血浆中的含量，***P＜0.001；

[0029] 图1C为本发明实施例提供的胆道闭锁患儿NE表达水平与肝功指标的预后关联性分析的结果图；

[0030] 图2A为本发明实施例提供的第3，6，9，12天正常健康对照注射生理盐水组小鼠(Control)、RRV诱导的BA小鼠(RRV)、RRV+弹性蛋白酶抑制剂组小鼠(RRV+Sivelestat)外观
代表性图片；

[0031] 图2B为本发明实施例提供的各组小鼠黄疸率曲线；

[0032] 图2C为本发明实施例提供的各组小鼠生存曲线；

[0033] 图2D为本发明实施例提供的各组小鼠体重曲线；

[0034] 图2E为本发明实施例提供的各组小鼠肝脏表面代表性图片(箭头：炎症灶)；

[0035] 图2F为本发明实施例提供的各组小鼠肝外胆管造影代表性图片(星号：肝外胆管闭锁)；

[0036] 图2G为本发明实施例提供的各组小鼠肝内胆管染色代表性图片(PV：汇管区；BD：胆管)；

[0037] 图2H为本发明实施例提供的各组小鼠肝脏HE染色代表性图片(PV：汇管区；BD：胆管)；

[0038] 图3A为本发明实施例提供的BEC组，PMA+BEC组，血管瘤患儿PMN+BEC，PMA+血管瘤患儿PMN+BEC组，血管瘤患儿PMN+BEC+Sivelestat组，PMA+血管瘤患儿PMN+BEC+Sivelestat
组形态代表性图片；

[0039] 图3B为本发明实施例提供的各组人BEC的MTT细胞增殖实验统计结果；

[0040] 图3C为本发明实施例提供的BEC组，PMA+BEC组，BA患儿PMN+BEC，PMA+BA患儿PMN+BEC组，BA患儿PMN+BEC+Sivelestat组，PMA+BA患儿PMN+BEC+Sivelestat组形态代表性图
片；

[0041] 图3D为本发明实施例提供的各组人BEC的MTT细胞增殖实验统计结果。

具体实施方式

[0042] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技
术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。

[0043] 除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本
文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他
形式的使用是非限制性的。

[0044] 一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的
参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促
反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本
文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序
和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

[0045] 中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)是一种丝氨酸蛋白酶，属于弹性蛋白酶样丝氨酸蛋白酶亚家族，由中性粒细胞分泌产生。NE具有抑菌和组织修复功能，还
可参与炎症反应。在正常的炎症过程中，中性粒细胞向细胞外介质释放高浓度的NE，NE可通
过促炎细胞因子的降解来调节免疫反应，从而降低炎症的强度。然而，如果在这一过程中NE
与内源性抑制剂之间发生不平衡，过量的NE会降解细胞外基质的结构蛋白，如弹性蛋白、胶
原蛋白和纤维连接蛋白。因此，过量的NE可引起多种病理状态和组织损伤，例如慢性炎症性
疾病等。

[0046] 本发明的发明人在前期已经发现BA患儿肝脏中出现大量中性粒细胞浸润。同时也发现：(1)NE在BA患儿肝脏和外周血中的表达均显著增加；(2)在动物实验中，基于RRV感染
的BA小鼠模型，使用NE抑制剂后可明显改善BA小鼠的症状(黄疸减退、体重上升、生存率增
加)；(3)在细胞实验中，我们分选BA患儿和血管瘤患儿(正常对照)外周血中的中性粒细胞
并培养取上清，将上清与人胆道上皮细胞(Biliary epithelial cells，BEC)共培养，加入
NE抑制剂，发现BA患儿中性粒细胞的上清可损伤BEC，加入NE抑制剂后可抑制BEC损伤；而血
管瘤患儿的上清不会损伤BEC，且加入NE抑制剂后BEC亦无影响。因此，本发明的发明人发现
NE在BA形成过程中起关键性作用。

[0047] 基于上述实验发现，本发明提供了检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质在制备用于诊断胆道闭锁的产品中的应用。和，

[0048] 检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质在制备用于评估胆道闭锁患儿肝脏损伤程度的产品中的应用。和，

[0049] 检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质在制备用于预后评估胆道闭锁的产品中的应用。

[0050] 本发明通过检测大量的BA患儿样本，并结合体内和体外实验，首先证实了BA肝脏组织和外周血中NE的表达可作为提高BA的诊断和评估肝损伤程度的有力指标，因此检测NE
的表达可作为临床上诊断和评估BA患儿的病情提供更方便、直接、准确的方法。

[0051] 在此需要说明的是，当检测得到的中性粒细胞弹性蛋白酶的含量高于(具有统计学差异，P＜0.05)未患病的正常儿童时，可诊断或辅助诊断该检测对象患有胆道闭锁。

[0052] 对于已确诊胆道闭锁的患儿，当检测得到的中性粒细胞弹性蛋白酶的含量越高时，则可诊断或辅助诊断为道闭锁患儿肝脏损伤程度越重，相应的，当检测得到的中性粒细
胞弹性蛋白酶的含量越低时，则可诊断或辅助诊断为道闭锁患儿肝脏损伤程度越轻。

[0053] 对于进行了胆道闭锁干预后的患儿，当检测得到的中性粒细胞弹性蛋白酶的含量越高时，则可诊断或辅助诊断为胆道闭锁患儿的预后相对较差，相应的，当检测得到的中性
粒细胞弹性蛋白酶的含量越低时，则可诊断或辅助诊断为胆道闭锁患儿的预后相对较好。

[0054] 在本发明的一些实施方式中，所述检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质包括检测中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂。

[0055] 其中，检测中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂例如可以为，但不限于特异性抗体等。

[0056] 在本发明的另一些实施方式中，所述检测中性粒细胞弹性蛋白酶的物质例如可以为，但不限于检测中性粒细胞弹性蛋白酶的仪器。

[0057] 其中，检测中性粒细胞弹性蛋白酶的仪器例如可以为，但不限于蛋白检测仪等。

[0058] 基于本发明的发明人通过实验得出的中性粒细胞弹性蛋白酶在BA形成过程中起关键作用的结果，本发明还提供了中性粒细胞弹性蛋白酶作为标志物在开发胆道闭锁的诊
断产品中的应用。

[0059] 在一些可选的实施方式中，所述诊断产品包括用于诊断BA的试剂或用于诊断BA的试剂盒。

[0060] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂在制备用于治疗胆道闭锁的产品中的应用。

[0061] 本发明通过实验还证实了NE抑制剂在动物实验上起治疗作用，因此可用于治疗BA的药物研发。

[0062] 在一些可选的实施方式中，所述产品包括药物。

[0063] 当产品为药物时，药物还包括药学上可接受的辅料。

[0064] 药学上可接受的辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药
用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中
添加的药学上可接受的辅料，能够起到赋型、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有
增溶、助溶或缓控释等重要功能。

[0065] 当以注射的形式给药时，上述药物可制成任意注射可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于注射液或粉针剂。

[0066] 其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

[0067] 在一些优选的实施方式中，所述中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂包括Sivelestat。

[0068] Sivelestat，中文称“西维来司他”，成分：C20H22N2O7S，来源：Cayman(Cat.no.17779)。Sivelestat是竞争性的人中性白细胞弹性蛋白酶抑制剂，sivelestat对
积累、激活的白细胞具有直接作用，有效地保护白细胞以防氧自由基和细胞因子的生成。

[0069] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

[0070] 实施例1检测中性粒细胞弹性蛋白酶在胆道闭锁中的表达情况

[0071] (1)临床样本收集

[0072] 所有健康对照组儿童(没有肝病证据的婴儿，NC，n＝16)、胆汁淤积组患儿(定义为血清直接胆红素高于17μmol/L，IHC，n＝32)及胆道闭锁组患儿(术中胆管造影及术后肝外
胆管组织病理检查证实为胆管闭锁，BA，n＝39)均于2019年3月至2020年3月之间从广州市
妇女儿童医疗中心外科部(中国广州)招募。IHC和BA患儿的诊断基于患儿的临床特征、肝胆
生化指标、术中胆管造影及术后肝外胆管组织病理学检查。术前采集各组儿童EDTA抗凝血
样(2ml)用于中性粒细胞分析及分选。胆汁淤积组(IHC，n＝32)及BA组患儿(BA，n＝39)肝脏
标本取自患儿术中直径约1.5cm肝脏病理活检组织标本，取年龄相仿的肝血管瘤患儿肝组
织作为正常对照组(NC)。本研究经广州市妇女儿童医疗中心临床研究机构评审委员会批
准，研究前已获得所有受试者的书面知情同意。

[0073] (2)免疫组化检测肝脏组织中中性粒细胞弹性蛋白酶

[0074] 通过免疫组化分别对BA、婴儿肝炎综合征和门脉海绵样变患儿肝脏切片进行染色，将肝脏样品在室温下用10％福尔马林固定过夜，石蜡包埋切片(4μm厚)，苏木精和伊红
(H&E)染色进行组织病理学分析。对于组织标本的免疫染色，使用EDTA抗原修复缓冲液进行
抗原修复，使用含2.5％牛血清白蛋白和0.1％Triton x‑100的封闭液进行封闭和膜通透。
加入抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体(1：100)，4℃孵育过夜。加入HRP标记的二级抗体室温孵
育1h进行信号进行放大，加入3,3′‑二氨基联苯胺显色，用苏木精复染细胞核，显微镜下观
察并分析NE的表达情况。

[0075] (3)ELISA检测BA患儿外周血中NE的表达

[0076] 从NC组及BA组外周血中分选得到的中性粒细胞(250000个)加入24孔细胞培养板中，加入胆道上皮细胞培养基进行培养，同时加入20nM的PMA进行刺激，12h后收集各组培养
上清。取NC组及BA组血浆样本分别稀释10倍。按照制造商的说明，分别使用人
TM
Myeloperoxidase ELISA试剂盒、人PMN Elastase ELISA试剂盒、Quant‑iT PicoGreen 
dsDNA检测试剂盒对血浆样品及上述培养上清中NE进行定量。

[0077] 为检测NE在BA患者体内的表达情况，本实施例分别使用免疫组化和ELISA方法检测了BA患儿肝脏和外周血中NE的表达水平。结果显示，与正常对照儿童(NC组)及胆汁淤积
患儿(IHC组)相比，BA组患儿肝脏中NE的表达明显增加(图1A)。与正对照健康儿童(NC组)及
胆汁淤积患儿(IHC组)相比，BA患儿外周血NE水平显著升高(p<0.001，图1B)。

[0078] (4)胆道闭锁患儿NE表达水平与肝功指标的预后关联性分析

[0079] 采集BA患儿的术前的临床病例资料，检测血样的NE表达水平，与临床肝功指标(包括直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)、γ‑GT等)进行关联性分析及临床预后的回顾性分
析(图1C)，从图中可以看出BA患儿外周血中的弹性蛋白酶含量分别与BA患儿术前外周血中
的DBIL、TBIL、γ‑GT含量呈正相关(p<0.01，图1B)。

[0080] 实施例2在胆道闭锁小鼠上论证中性粒细胞弹性蛋白酶在BA中的重要性

[0081] (1)妊娠期BALB/c小鼠(10‑12周龄，体重35‑40g)购自广东省动物实验中心，CD177‑/‑Balb/c小鼠购自Cyagen(美国)生物有限公司。小鼠在过滤空气的无特定病原体的
独立微型隔离饲养笼中饲养(温度25℃，黑暗和光照12h间断产生)，并自由获取无菌水和高
压灭菌食品。使用出生24小时内的新生小鼠(平均体重1.5‑1.6g)建立BA小鼠模型并进行下
游实验。实验方案经广州医科大学实验动物中心(IACUC‑DB‑16‑0602)动物保护与使用委员
会批准，所有动物实验均在该中心进行；

[0082] (2)恒河猴轮状病毒(RRV)菌株MMU 18006购自美国ATCC公司(ATCC，美国)。在出生6
24小时内的新生小鼠腹腔内注射20μL1.5×10 pfu/mL的RRV，对照组注射同等剂量的生理
盐水。小鼠于注射后第5～6天出现油脂毛发及皮肤黄染表明BA诱导成功；

[0083] (3)于第2天开始连续每天腹腔注射NE抑制剂(Sivelestat，剂量：50mg/kg)，直至第12天终止注射；

[0084] (4)各组小鼠随机分为：①正常对照组；②RRV小鼠组；③RRV+Sivelestat组。正常对照组于同时间段注射等量生理盐水。收取以上各组第3、6、9、12天小鼠肝脏组织样本；

[0085] (5)观察小鼠的体重、皮肤黄疸、生存率及肝功能的变化；常规胆囊注射美兰进行肝外胆道造影，确认是否存在肝外胆道闭锁；病理染色观察小鼠肝内、外胆管形态变化及汇
管区炎症浸润情况。

[0086] 为进一步明确NE在BA中的作用，本实施例分别在RRV诱导的BA小鼠上使用NE抑制剂(Sivelesitat，50mg/kg)。结果显示，与RRV诱导的BA组小鼠相比，Sivelesitat组小鼠黄
疸率显著降低，体重升高，生存率显著提高，生存时间显著延长(图2A、2B、2C和2D)，肝脏表
面未见点状炎症坏死灶(图2E)，肝外胆管未发生闭锁(图2F)，肝内胆管也未发生闭锁(图
2G)，肝内胆管周围未见明显的炎症细胞浸润(图2H)。

[0087] 实施例3体外实验进一步证实中性粒细胞弹性蛋白酶在BA中起重要作用

[0088] 人中性粒细胞的培养液与正常胎儿胆管上皮细胞(BEC)体外共培养：

[0089] (1)BA患儿及血管瘤患儿的中性粒细胞分选：按照制造商的说明，使用红细胞裂解液将BA组血样标本裂解成单细胞悬液，加入Fc Block室温孵育10min，加入anti‑human PE 
conjugated CD177抗体4度条件下孵育30min，洗涤后加入anti‑PE Microbeads 4度孵育
15min，洗涤后使用LD分离柱在磁性分选器(Miltenyi Biotec，Germany)上进行中性粒细胞
的分选，分选的到的中性粒细胞在BD FACS Aria II(BD Biosciences，USA)上检测细胞纯
度，并使用细胞纯度>95％的细胞进行培养；

[0090] (2)人胆道上皮细胞购自ScienCell公司(货号，ScienCell)，并在人胆道上皮细胞培养基中培养。取上述培养BA组和血管瘤患儿中性粒细胞的培养液，分别将培养液加入到
对数生长期的人胆道上皮细胞中，同时加入PMA刺激进行共培养，后加入Sivelestat。分组：
血管瘤患儿：①BEC组；②PMA+BEC组；③血管瘤患儿PMN+BEC组；④PMA+血管瘤患儿PMN+BEC
组；⑤血管瘤患儿PMN+BEC+Sivelestat组；⑥PMA+血管瘤患儿PMN+BEC+Sivelestat组；BA患
儿组：①BEC组；②PMA+BEC组；③BA患儿PMN+BEC组；④PMA+BA患儿PMN+BEC组；⑤BA患儿PMN+
BEC+Sivelestat组；⑥PMA+BA患儿PMN+BEC+Sivelestat组。在培养过程中持续观察各组细
胞生长状态并记录拍照。共培养实验结束后，使用MTT法检测胆道上皮细胞增殖情况。

[0091] 为进一步证实NE在BA中的作用，本实施例分别从BA患儿和血管瘤患儿外周血中分选出PMN并培养，将培养液与人胚胎BEC共培养，加入NE抑制剂(Sivelestat)。结果显示，加
入血管瘤患儿PMN的培养液后，BEC未受到影响，加入Sivelestat后BEC亦未受到影响(图3A
和3B)，提示血管瘤患儿的PMN不会损伤BEC。然而，加了BA患儿PMN的培养液后，与BEC组比
较，BEC会受到明显损伤，增殖受抑制；同样，与PMA+BEC组比较，加了BA患儿的PMN的培养液
后BEC亦会受到明显损伤，增殖受明显抑制，表明BA患儿的PMN可损伤BEC；与PMN+BEC组相
比，PMN+BEC+Sivelestat组中BEC细胞形态正常，BEC的增殖未受到抑制；同时，与PMA+PMN+
BEC组相比，PMA+PMN+BEC+Sivelestat组中BEC细胞形态正常，BEC的增殖亦未受到抑制(图
3C和3D)，提示NE抑制剂可防止BA患儿PMN损伤BEC，PMN分泌产生的NE在BA中起重要作用。

[0092] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。