改变效应功能的Fc变体及其融合蛋白转让专利
申请号 : CN202011039915.5
文献号 : CN112574315B
文献日 : 2023-04-07
发明人 : 路力生 , 霍永庭 , 刘云鹏 , 李艳敏 , 韩喆 , 欧颖烨 , 芦迪 , 涂晶晶
申请人 : 广东菲鹏制药股份有限公司
摘要 :
本发明公开了一种改变效应功能的Fc变体及其融合蛋白，其Fc区包含一个或多个氨基酸改变，具有改变的效应功能；进一步的，公开了包含改变效应功能的Fc变体的融合蛋白，以及此类Fc变体或融合蛋白的制备方法，编码此类Fc变体或融合蛋白的核酸，包含所述核酸的表达载体，包含所述Fc变体或融合蛋白、核酸或表达载体的宿主细胞，包含此类Fc变体或融合蛋白的药物组合物，以及此类Fc变体或融合蛋白的用途。
权利要求 :
1.一种Fc变体，所述Fc变体与野生型Fc相比为三氨基酸取代；所述野生型Fc为IgG1 Fc，其中依照EU编号，所述三氨基酸取代选自E233P，P238A，D265A；N297A，L235A，N434A；和A327Q，G237A，L235A。
2.一种融合蛋白，所述融合蛋白由Fc变体与多肽融合形成，所述Fc变体与野生型Fc相比为三氨基酸取代；所述野生型Fc为IgG1 Fc，其中依照EU编号，所述三氨基酸取代选自E233P，P238A，D265A；N297A，L235A，N434A；和A327Q，G237A，L235A。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式(I)所示结构：A‑肽接头‑B或B‑肽接头‑A(I)，
其中，A为IL‑10，IL‑6或IL‑12，肽接头为(GS)n、(G4S)n或不存在，其中n为1‑10的整数，B为Fc变体。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述A是IL‑10。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述A是人IL‑10。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述IL‑10的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
7.一种核酸，其编码权利要求1所述的Fc变体或权利要求2‑6任一项所述的融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的核酸，其中所述核酸的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的Fc变体或权利要求2‑6任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
10.权利要求1所述的Fc变体、权利要求2‑6任一项所述的融合蛋白或权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗有此需要的个体中癌症的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症为实体瘤。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述实体瘤为结肠癌，黑色素瘤，直肠癌，乳腺癌。
13.根据权利要求10所述的用途，其中所述个体是人。
说明书 :
改变效应功能的Fc变体及其融合蛋白
技术领域
[0001] 本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种改变效应功能的Fc变体，其Fc区包含一个或多个氨基酸改变，其具有改变的效应功能；进一步的，本发明涉及包含改变效应功能的Fc变体的融合蛋白。
背景技术
[0002] 抗体的Fc区与许多Fc受体及配体相互作用，行使一系列重要的功能，称为效应器功能(effector function)。IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE的为FcεR，IgA的为FcαR等等。已经鉴定了FcγR的三个亚类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。Fc受体的另一种类型是新生Fc受体(FcRn)。
[0003] 由抗体Fc区介导的效应功能可以分为两种：(1)在抗体与抗原结合之后发挥作用的效应功能(这些功能涉及参与补体级联反应或Fc受体(FcR)‑负荷细胞)；和(2)不依赖于抗原结合而发挥作用的效应功能(这些功能提供在血循环中的持续性和通过胞吞作用穿过细胞屏障的能力)。
[0004] 近年来抗体Fc区常用来制备各种融合蛋白，融合蛋白的Fc段能够与各类免疫白细胞上表达的FcγRs受体结合，从而产生Fc段介导的细胞毒作用(ADCC)以及补体依赖的细胞毒性(CDC)效应，靶向杀伤功能蛋白受体阳性细胞，会影响融合蛋白发挥活性而为减弱治疗类融合蛋白Fc段与FcγRs受体的亲和力而设计的基因突变，通常会导致融合蛋白与FcRn受体亲和力的下降，降低其在体内的半衰期。
发明内容
[0005] 本发明旨在至少一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本发明的第一方面，提供了一种Fc变体，旨在减弱Fc与各类免疫白细胞上表达的Fc受体，即FcγRs(主要包括FcR gamma I,FcR gamma IIa,FcR gamma IIb以及FcR gamma IIIa)之间的亲和力，从而降低或者消除Fc段介导的细胞毒作用(antibody‑dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC)或结合补体C1q介导的补体依赖的细胞毒性(complement‑dependent cytotoxicity，CDC)效应，并且保持其与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor，FcRn)的亲和力不变或增强，不影响体内半衰期。
[0006] 根据本发明的实施例，其中依照EU编号方式，所述Fc变体在选自第233，235，237，238，265，297，327，434位的至少一处包含氨基酸取代。
[0007] 根据本发明的实施例，所述Fc优选为IgG Fc，其中IgG Fc为IgG1 Fc，IgG2 Fc，IgG3Fc，IgG4 Fc中的一种，优选是IgG1 Fc，更优选人IgG1 Fc。
[0008] 根据本发明的实施例，其中所述氨基酸取代选自E233P，L235A，G237A，P238A，D265A，N297A，A327Q，和N434A中的至少一种。
[0009] 根据本发明实施例，其中所述氨基酸取代选自E233P，L235A，G237A，P238A，D265A，N297A，A327Q，和N434A中的至少三种。
[0010] 根据本发明实施例，所述氨基酸取代为选自：E233P，P238A，D265A；N297A，L235A，N434A；和A327Q，G237A，L235A的三氨基酸取代。
[0011] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种Fc变体融合蛋白，具体地，本发明涉及如下实施方式：
[0012] 实施方案1.一种融合蛋白，其结构为如下式所示：
[0013] A‑肽接头‑B或B‑肽接头‑A(I)
[0014] 其中A为IL‑10，IL‑6，或IL‑12，肽接头为(GS)n，其中n为1‑10的整数，B为Fc变体。
[0015] 实施方案2.实施方案1所述的融合蛋白，其中所述A是IL‑10，优选人IL‑10。
[0016] 实施方案3.实施方案1‑2任意一项所述的融合蛋白，其中IL‑10通过所述肽接头连接在IgG变体的N末端或者C末端。
[0017] 实施方案4.实施方案1所述的融合蛋白，其中IgG Fc变体为IgG1 Fc，IgG2 Fc，IgG3Fc，IgG4 Fc的变体中的一种，优选是IgG1 Fc变体，更优选人IgG1 Fc变体。
[0018] 实施方案5.实施方案1‑4任意一项所述的融合蛋白，其中所述IL‑10的氨基酸序列是SEQ ID NO：17。
[0019] 实施方案6.前述实施方案任一项的融合蛋白，其中所述Fc变体经过修饰，与野生型Fc相比，修饰后的Fc变体削弱了所述融合蛋白与FcγR的亲和力。
[0020] 实施方案7.实施方案6所述的融合蛋白，其中依照EU编号方式，所述Fc变体在选自第233，235，237，238，265，297，327，434位的至少一处包含氨基酸取代。
[0021] 实施方案8.实施方案7所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代选自E233P，L235A，G237A，P238A，D265A，N297A，A327Q，和N434A中的至少一种。
[0022] 实施方案9.实施方案6或7所述的融合蛋白，其中所述氨基酸取代选自E233P，L235A，G237A，P238A，D265A，N297A，A327Q，和N434A中的至少三种。
[0023] 实施方案10.实施方案9所述的融合蛋白，所述氨基酸取代为选自：E233P，P238A，D265A；N297A，L235A，N434A；和A327Q，G237A，L235A的三氨基酸取代。
[0024] 实施方案11.实施方案10所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6。
[0025] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种核酸，其编码上述任意一种Fc变体或任意一种Fc变体融合蛋白。
[0026] 根据本发明实施例，其中所述核酸的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22。
[0027] 在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述任意一种Fc变体或任意一种Fc变体融合蛋白和药学上可接受的载体。
[0028] 根据本发明的第五方面，本发明提供了一种上述任意一种药物组合物在制备用于治疗有此需要的个体中癌症的药物中的用途。
[0029] 根据本发明实施例，其中所述癌症为实体瘤。
[0030] 根据本发明实施例，其中所述实体瘤为结肠癌，黑色素瘤，直肠癌，乳腺癌。
[0031] 根据本发明实施例，其中所述个体是人。
[0032] 定义
[0033] 除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。
[0034] 本文中术语“Fc”或“Fc区”用于定义抗体重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自大约位置231处的氨基酸残基延伸至大约位置340处的氨基酸残基。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
[0035] 本文所述的Fc包括野生型Fc以及经过修饰的Fc，例如，与野生型IgG Fc相比，修饰后的IgG Fc削弱了本文所述的融合蛋白与FcγR的亲和力。亲和力可以使用本领域公知的方法或者本文所公开的方法测定。
[0036] 氨基酸“取代”指多肽中一个氨基酸用另一种氨基酸替换。在一个实施方案中，氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。“保守”氨基酸取代可以在所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；而带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。非保守取代会需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的成员。例如，氨基酸取代还可导致将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换，例如将来自一个组(例如极性)的氨基酸用来自一个不同组(例如碱性)的另一种氨基酸替换。可以使用本领域公知的遗传或化学方法来生成氨基酸取代。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等等。例如E233P表示Fc中第233位的E被P替换，P238A表示Fc中第238位的P被A。
[0037] “IgG类抗体”指具有天然存在免疫球蛋白G(IgG)分子的结构的抗体。IgG类抗体的抗体重链具有域结构VH‑CH1‑CH2‑CH3。IgG类抗体的抗体轻链具有域结构VL‑CL。IgG类抗体基本上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab片段和一个Fc域组成。IgG类抗体包括例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG1 Fc，IgG2 Fc，IgG3Fc，IgG4 Fc分别表示IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc或Fc区。本文中融合蛋白中的IgG Fc可以为IgG1 Fc，IgG2 Fc，IgG3Fc，IgG4 Fc，优选是IgG1 Fc，更优选人IgG1 Fc。
[0038] 如本文中使用的，术语“融合蛋白”指包含IL‑10、IL‑6或IL‑12分子和IgG1的Fc部分形成的融合多肽分子，其中融合蛋白的组件通过肽键彼此连接，或是直接地或是经由肽接头。
[0039] 术语“肽接头”为包含一个或多个氨基酸，通常约2‑20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或本文中记载的。合适的、非免疫原性的肽接头包括例如(GS)n接头，其中n为1‑10的整数。在一个实施方案中，n为1‑6，优选4。
[0040] “融合”意指各组分直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
[0041] “亲和力”或“结合亲和力”指分子的单一结合位点与其结合配偶体之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
[0042] “多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，而且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或能由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸构件中断。多核苷酸可包含合成后进行的修饰，诸如缀合至标记物。
[0043] 术语“修饰”指对肽主链(例如氨基酸序列)的任何操作或对多肽的翻译后修饰(例如糖基化)。修饰也包括氨基酸序列中氨基酸的取代、缺失或插入。
[0044] “天然IL‑10”(也称作“野生型IL‑10”)意指天然存在IL‑10,与“经修饰IL‑10”相反，后者自天然存在IL‑10经过修饰，例如为了改变它的一项或多项特性，诸如稳定性。经修饰IL‑10分子可以例如包含氨基酸序列中的修饰，例如氨基酸取代、缺失或插入。“天然IL‑6”(也称作“野生型IL‑6”)意指天然存在IL‑6,与“经修饰IL‑6”相反，后者自天然存在IL‑6经过修饰，例如为了改变它的一项或多项特性，诸如稳定性。经修饰IL‑6分子可以例如包含氨基酸序列中的修饰，例如氨基酸取代、缺失或插入。“天然IL‑12”(也称作“野生型IL‑12”)意指天然存在IL‑12,与“经修饰IL‑12”相反，后者自天然存在IL‑12经过修饰，例如为了改变它的一项或多项特性，诸如稳定性。经修饰IL‑12分子可以例如包含氨基酸序列中的修饰，例如氨基酸取代、缺失或插入。
[0045] 如本文中所使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
[0046] 术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的融合蛋白的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、细菌细胞，如大肠杆菌，昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
[0047] 药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。
[0048] 药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良作用。
[0049] “个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，所述个体或受试者是人。
[0050] 术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
[0051] “药学上可接受的载体”指药物组合物中活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0052] 如本文中使用的，“治疗/处理”指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善的预后。
附图说明
[0053] 图1.质粒pcDNA3.4A(a),pcDNA3.4A‑R0354(b),pcDNA3.4A‑R0355(c),pcDNA3.4A‑R0356(d),pcDNA3.4A‑R0359VCHE(e)，pcDNA3.4A‑R0359VCLE(f)的图谱，以及pcDNA3.4A‑R0330(g)。
[0054] 图2.信号肽、R0354、R0355、R0356、R0359以及R0330分子的基因序列。
[0055] 图3.R0354,R0355,R0356，R0359(由R0359VCHE和R0359VCLE组成)以及R0330和人IL‑10的氨基酸序列。
[0056] 图4.纯度分析及层析图谱：a).亲和洗脱物SE‑HPLC纯度；b).亲和洗脱pH处理后SE‑HPLC纯度；c).精细纯化后洗脱组分SE‑HPLC纯度；d)合并的洗脱组分的层析图谱。
[0057] 图5.活化后CD8+T细胞IL‑10R增加。
[0058] 图6.自产IL‑10融合蛋白分子促进CD8+T细胞分泌INFγ。
[0059] 图7.小鼠体内抗肿瘤活性：a)小鼠结肠癌(CT26WT)抗肿瘤模型；b)小鼠结肠癌(CT26WT)肿瘤生存曲线；c)小鼠黑色素瘤(B16‑F1)抗肿瘤模型；d)小鼠结肠癌(MC38)抗肿瘤模型。
具体实施方式
[0060] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。
[0061] Fc变体
[0062] 在本发明的一个实施方案中，公开了一种Fc变体，所述Fc变体为IgG Fc，其中IgG Fc为IgG1 Fc，IgG2 Fc，IgG3Fc，IgG4 Fc中的一种，优选是IgG1 Fc，更优选人IgG1 Fc。
[0063] 在本发明的一个实施方案中，其中依照EU编号方式，所述IgG Fc在选自第233，235，237，238，265，297，327，434位的至少一处包含氨基酸取代。
[0064] 在本发明的一个实施方案中，其中所述氨基酸取代选自E233P，L235A，G237A，P238A，D265A，N297A，A327Q，和N434A中的至少一种。
[0065] 在本发明的一个实施方案中，其中所述氨基酸取代选自E233P，L235A，G237A，P238A，D265A，N297A，A327Q，和N434A中的至少三种。
[0066] 在本发明的一个实施方案中，所述氨基酸取代为选自：E233P，P238A，D265A；N297A，L235A，N434A；和A327Q，G237A，L235A的三氨基酸取代。
[0067] 本领域技术人员还可以理解的，一些Fc区位点的突变不会影响Fc受体的亲和力，例如，常见的Fc变体还包含K447位的缺失，或为了在Fc的C末端连接其他蛋白而致K447A突变，Fc区447位缺失或突变不会影响Fc变体与Fcγ受体的亲和力和/或FcRn的亲和力，除以上实施方式外，包含447位缺失或突变的Fc变体或其他不影响Fcγ受体亲和力的突变位点，也在本发明保护范围内。
[0068] 融合蛋白
[0069] Fc融合蛋白的形式有多种，本发明Fc变体可根据需要制成任何形式的融合蛋白，或与其他多种类型的蛋白质进行融合，本发明公开的融合蛋白的实施例仅是其中的一种范例，不对本发明的保护范围造成限制。
[0070] 在本发明的一个实施方案中，公开了一种融合蛋白，其结构为如下式所示：
[0071] A‑肽接头‑B或B‑肽接头‑A(I)
[0072] 其中A为IL‑10，IL‑6或IL‑12，肽接头为(GS)n，其中n为1‑10的整数，B为IgG Fc。
[0073] 在本发明的一个实施方案中，A也可以为IL‑10，IL‑6或IL‑12的活性片段。
[0074] 在本发明的进一步实施方案中，IgG1 Fc包含选自如下组成的组的三氨基酸取代：E233P，P238A，D265A；N297A，L235A，N434A；和A327Q，G237A，L235A。
[0075] 在本发明的实施方案中，IL‑10可以为动物，例如哺乳动物，例如人的天然IL‑10，或者IL‑10经取代、插入一个或多个氨基酸所得到的经修饰的IL‑10。IL‑10活性片段是IL‑10指天然IL‑10或经修饰的IL‑10从N‑端或C端或者从N‑端和C‑端截掉一个或多个氨基酸后所得到的肽链，该肽链保留IL‑10的功能活性。本领域技术人员可以通过常规方法得到所述活性片段，如通过化学合成或重组表达方法得到IL‑10的片段，并通过本领域公知的或本申请公开的方法测量IL‑10片段是否具有原IL‑10的活性。
[0076] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码信号肽的另外的编码区联合，所述信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述融合物，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明融合蛋白或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。信号肽可以是通用信号肽，例如，IgG通用信号肽。例如，所述信号肽的编码序列可以是ATGGGATGGTCATGCATAATACTCTTTCTTGTGGCTACTGCTACCGGGGTTCACTCT(SEQ ID NO:11)。
[0077] 在本发明的实施方案中，A‑肽接头‑B表示肽接头分别连接A的羧基端(C端，或3’端)和B的氨基端(N端，或5’端)，B‑肽接头‑A表示肽接头分别连接B的羧基端(C端，或3’端)和A的氨基端(N端，或5’端)。
[0078] 在另一个实施方案中，n为1‑6，例如，1，2，3，4，5，6，优选n为4。
[0079] 在另一个实施方案中，IgG1 Fc为人IgG1 Fc。虽然IgG类抗体的Fc赋予融合蛋白以有利的药动学特性，包括长血清半衰期(归于靶组织中较好的积累和有利的组织‑血液分布比)，但是它可同时引起不想要的将融合蛋白靶向表达Fc受体的细胞，而非目的细胞。此外，Fc受体信号传导途径的激活可引起导致(促炎症)细胞因子受体激活的细胞因子释放和系统性施用时的严重副作用。本发明的融合蛋白不仅保留了IL‑10的免疫抗肿瘤活性，更重要的是对Fc段定点基因突变进行优化组合，减弱了IL‑10‑Fc融合蛋白与各类免疫白细胞上表达的Fc受体，即FcγRs(主要包括FcR gamma I,FcR gamma IIa,FcR gamma IIb以及FcR gamma IIIa)之间的亲和力，从而降低或者消除Fc段介导的细胞毒作用(ADCC)或结合补体C1q介导的补体依赖的细胞毒性效应(CDC)，从而不产生细胞毒性，避免效应T细胞被杀伤，最终有效的提高了IL‑10抗肿瘤效果。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059‑7063(1986)和Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499‑1502(1985)；美国专利No.5,821，337；Bruggemann et al.J Exp Med 166,1351‑1361(1987)。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano‑Santoro et al.J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045‑1052(2003)；和Cragg and Glennie，Blood 103,2738‑2743(2004))。
[0080] 在一个优选的实施方案中，IL‑10为人IL‑10或h IL‑10。
[0081] 在一个优选的实施方案中，IL‑6为人IL‑6或h IL‑6。
[0082] 在一个优选的实施方案中，IL‑12为人IL‑12或h IL‑12。
[0083] 在一个优选的实施方案中，所述IgG1 Fc所包含的三氨基酸取代为E233P，P238A，D265A；N297A，L235A，N434A；或A327Q，G237A，L235A。其中编号为对Fc的氨基酸编号，所述编号根据EU编号系统进行。
[0084] 在另一个优选的实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:6。
[0085] 核酸
[0086] 在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明Fc变体或融合蛋白的核酸。本领域技术人员公知，由于遗传密码的简并性，编码一种融合蛋白的核酸可以有很多种。本领域技术人员可以根据宿主细胞对核酸序列进行优化，使得核酸序列在宿主细胞中能够以优化的水平表达，例如，具有较高的表达水平。为了实现例如融合蛋白的表达，编码融合蛋白的核酸序列可以还可以与启动子，内含子，增强子等调节元件有效连接，使得这些调节元件在宿主细胞中发挥各自的功能。融合蛋白还可以包含信号肽使得所编码的融合蛋白能够分泌到培养液中，从而通过离心获得上清液，并从上清液中进一步纯化所述融合蛋白。包含融合蛋白编码序列、调节元件和信号肽编码序列的核酸也在本发明的核酸的范围内。
[0087] 在一个优选的实施方案中，所述核酸的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22。
[0088] 在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明Fc变体或融合蛋白的核酸的表达载体。
[0089] 表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的有效连接中克隆编码融合蛋白(片段)的多核苷酸(即编码区)。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为有效连接。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“有效连接的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸有效连接。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸有效连接以指导细胞特异性转录。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，与内含子‑A连接)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔阳β蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
[0090] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区连接，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述融合蛋白，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明融合蛋白或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其有效连接的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β‑葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。
[0091] 可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白序列的DNA纳入融合蛋白(片段)编码多核苷酸内或其末端。
[0092] 在一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明融合蛋白(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持融合蛋白表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的融合蛋白用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech22,1409‑1414(2004)，和Li etal.,Nat Biotech 24,210‑215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转TM基因植物中生成抗体的PLANTIB0DIES 技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS‑7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham et al.,J Gen Virol 36,59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243‑251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO‑76)、人宫颈癌细胞(HELA)、猕猴肾细胞(MDCK)，牛鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(HepG2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44‑68(1982)的)、MRC5细胞和FS4细胞。其它可‑
用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CH0)细胞，包括dhfr CHO细胞(Urlaub et al.，Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。
对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa，NJ)，pp.255‑268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，优选为细胞埃希氏菌属细胞，特别优选大肠杆菌细胞。
用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CH0)细胞，包括dhfr CHO细胞(Urlaub et al.，Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。
对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa，NJ)，pp.255‑268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，优选为细胞埃希氏菌属细胞，特别优选大肠杆菌细胞。
[0093] 可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备Fc变体或融合蛋白，所述技术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷、疏水性、亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用融合蛋白结合的抗体、配体、受体或抗原。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定融合蛋白的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。
[0094] 组合物、配制剂和施用路径
[0095] 在一个另外的方面，本发明提供包含本文中提供的任何Fc变体或融合蛋白的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任何Fc变体或融合蛋白以及药学上可接受载体。
[0096] 治疗方法和组合物
[0097] 可以将本文中提供的任一种融合蛋白用在治疗方法中。
[0098] 对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本发明的融合蛋白。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。
[0099] 在一个方面，提供用作药物的本发明的融合蛋白。在别的方面，提供用于治疗疾病的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明提供如本文中描述的融合蛋白，用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供融合蛋白，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是癌症。例示性癌症包括结肠癌、黑色素瘤、直肠癌和乳腺癌。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
[0100] 在一个别的方面，本发明提供本发明的融合蛋白在制造或制备药物中的用途，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是癌症。在一个特定实施方案中，该疾病为结肠癌。在一个特定实施方案中，该疾病为黑色素瘤。在一个特定实施方案中，该疾病为直肠癌。在一个特定实施方案中，该疾病为乳腺癌。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
[0101] 在一个别的方面，本发明提供用于在个体中治疗疾病的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，待治疗的疾病是癌症。在一个特定实施方案中，该疾病为结肠癌。在一个特定实施方案中，该疾病为黑色素瘤。在一个特定实施方案中，该疾病为直肠癌。在一个特定实施方案中，该疾病为乳腺癌。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
[0102] 在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的融合蛋白。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的融合蛋白以治疗疾病。
[0103] 为了预防或治疗疾病，本发明的融合蛋白的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用路径、患者的体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和进程、施用融合蛋白是为了预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床史和对融合蛋白的响应、以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
[0104] 以下实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0105] 实施例：
[0106] 除非另有说明，实施例中的百分比浓度为质量体积百分比浓度。例如，2％琼脂糖凝胶表示100ml凝胶中含有2g琼脂糖。10％胎牛血清表示100ml体积中含有10g胎牛血清。
[0107] 为此,我们开发了能显著提高人的白细胞介素‑10融合蛋白类药物的免疫抗肿瘤活性的分子构建及其评价方法，具体如下：
[0108] 实施例1：IL‑10‑hFc融合蛋白分子构建
[0109] 对人源IgG1抗体的Fc段依据EU编号方式进行定点突变，构建PCDNA3.4A‑RO354，PCDNA3.4A‑RO355以及PCDNA3.4A‑RO356三个质粒，其中三个目的片段的分子结构如下：RO354：IgG通用信号肽‑IL10‑GSGSGSGS‑hIgG1 Fc(铰链区+CH2+CH3,含E233P，P238A，D265A突变)；RO355：IgG通用信号肽‑IL10‑GSGSGSGS‑hIgG1 Fc(铰链区+CH2+CH3,含N297A，L235A，N434A突变)；RO356：IgG通用信号肽‑IL10‑GSGSGSGS‑hIgG1 Fc(铰链区+CH2+CH3,含A327Q，G237A，L235A突变)。同时构建其同型对照PCDNA3.4A‑R0359和PCDNA3.4A‑R0330。
PCDNA3.4A‑R0359包括PCDNA3.4A‑R0359VCHE和PCDNA3.4A‑R0359VCLE,分子结构如下PCDNA3.4A‑R0359VCHE:IgG通用信号肽‑anti‑HIV VH‑hIgG1.3CH(CH1+铰链区+CH2+CH3),PCDNA3.4A‑R0359VCLE:IgG通用信号肽‑anti‑HIV VL‑hIgKC，同型对照PCDNA3.4A‑R0359所表达的多肽为R0359。R0330分子结构如下:IgG通用信号肽‑IL10‑GSGSGSGS‑hIgG1 Fc(铰链区+CH2+CH3,含L234A，L235E,G237A,并在447位缺失K,为百时美施贵宝公司Fc变体，作为本发明的对照)；
PCDNA3.4A‑R0359包括PCDNA3.4A‑R0359VCHE和PCDNA3.4A‑R0359VCLE,分子结构如下PCDNA3.4A‑R0359VCHE:IgG通用信号肽‑anti‑HIV VH‑hIgG1.3CH(CH1+铰链区+CH2+CH3),PCDNA3.4A‑R0359VCLE:IgG通用信号肽‑anti‑HIV VL‑hIgKC，同型对照PCDNA3.4A‑R0359所表达的多肽为R0359。R0330分子结构如下:IgG通用信号肽‑IL10‑GSGSGSGS‑hIgG1 Fc(铰链区+CH2+CH3,含L234A，L235E,G237A,并在447位缺失K,为百时美施贵宝公司Fc变体，作为本发明的对照)；
[0110] 以上构建质粒图谱见图1，各融合蛋白核酸序列见图2，氨基酸序列见图3。
[0111] 实验中所用主要仪器：PCR仪(Tprofessional TR20)；电泳仪(DYY‑TC)；凝胶成像仪(Smart Gel N)；离心机(H1650‑W)；微量恒温器(HW‑8C)；超净工作台(SDJ系列)；恒温振荡器(H2‑9211K)；恒温水浴锅(HH‑4A)；
[0112] 实验中所用主要试剂:pcDNATM3.4TOPOTMTA Cloning Kit(Invitrogen A14697)；5‑alpha感受态大肠杆菌(Competent E.coli)(NEB C2987I)；DL2000 DNA Marker(TAKARA3427A)；Q5高保真DHA聚合酶(High‑Fidelity DNA Polymerase)(NEB M0491L)；
AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit)(AxyGEN AP‑GX‑50)；Hind III(NEB)；
EcoRI(NEB)；T4 DNA连接酶(TAKARA 2011A)；无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN DP117)；
AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit)(AxyGEN AP‑GX‑50)；Hind III(NEB)；
EcoRI(NEB)；T4 DNA连接酶(TAKARA 2011A)；无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN DP117)；
[0113] 实验步骤
[0114] (1)基因合成
[0115] 将R0354、R0355、R0356、R0359和R0330的氨基酸序列分别进行人源化碱基优化，并人工合成它们的编码核苷酸序列。R0354、R0355、R0356、R0359和R0330的编码核酸序列分别如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和9，和SEQ ID NO:19所示。
[0116] (2)载体选择
[0117] 根据所要构建质粒的用途、外源基因表达产物产量、载体DNA制备的难易，以及载体和目标片段的酶切位点分析结果选择PCDNA3.4A载体。载体购买自Invitrogen公司，所构建的质粒图谱见图1。
[0118] (3)引物设计
[0119] 通过SnapGene软件(SnapGene Version 1.1.3)设计引物，最终确定扩增R0354、R0355、R0356的一对特异性寡核苷酸引物序列为1F 5’–CCGCAAGCTTGCCACCATGGGATGGTCATGCATAATACTC‑3’(SEQ ID NO:12)；1R 5’‑CCGGAATTCTCATTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG—3(SEQ ID NO:13),扩增产物片段长度为1288bp；扩增R0359VCHE一对特异性寡核苷酸引物序列为2F 5’‑CCGCAAGCTTGCCACCATGGGATGGTCATGCATAATAC‑3’(SEQ ID NO:14)；2R 5’‑CCGGAATTCTCATTACTTGCCAGGGGACAGAGACAGGGACTTC‑3’(SEQ ID NO:15)，扩增产物片段长度为1432bp；扩增R0359VCLE一对特异性寡核苷酸引物序列为2F 5’‑CCGCAAGCTTGCCACCATGGGATGGTCATGCATAATAC‑3’；3R 5’‑CCGGAATTCTCATTAACATTCACCGCGATTAAAGGACTTTGTC‑3’(SEQ ID NO:16)，扩增产物片段长度为748bp；扩增R0330的一对特异性寡核苷酸引物序列为1F
5’–CCGCAAGCTTGCCACCATGGGATGGTCATGCATAATACTC‑3’(SEQ ID NO:12)；4R 5’‑CCGGAATTCTCATTAGCCAGGGGACAGAGACAGGGACTTC‑3’(SEQ ID NO:23),扩增产物片段长度为1270bp。(4)PCR扩增
5’–CCGCAAGCTTGCCACCATGGGATGGTCATGCATAATACTC‑3’(SEQ ID NO:12)；4R 5’‑CCGGAATTCTCATTAGCCAGGGGACAGAGACAGGGACTTC‑3’(SEQ ID NO:23),扩增产物片段长度为1270bp。(4)PCR扩增
[0120] 使用PCR仪(Tprofessional TR20)，通过Q5高保真DHA聚合酶(High‑Fidelity DNA Polymerase)(NEB M0491L)，以合成序列为模板，分别以引物1F/1R；2F/2R；2F/3R进行PCR扩增。
[0121] 反应总体积：50μL，含PCR 5×缓冲液10μL，高GC缓冲液(High GC buffer)10μL，DNA模板0.5μL，Q5高保真DHA聚合酶(High‑Fidelity DNA Polymerase)0.5μL，dNTP(25mM)4μL，以及特异性上、下引物(终浓度200nmol/L)各1.5μL，并加消毒双蒸水至总体积50μL；
[0122] 反应条件：94℃预变性5分钟，然后依次94℃变性30秒，接着55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒分钟，共30个循环。
[0123] (5)扩增产物纯化
[0124] 通过电泳仪(DYY‑TC)，用每100ml凝胶中含有2g琼脂糖的琼脂糖凝胶对步骤(4)所得的扩增产物进行电泳，以检测其是否有目的片段，使用DL2000 DNA Marker(TAKARA 3427A)以产生序列梯。通过凝胶成像仪(Smart Gel N)观察结果，PCR产物经电泳后显示为单一条带，大小约1.3Kb,1.4Kb，800bp和1.3Kb无杂带，提示PCR产物单一，无非特异扩增。利用Axygen琼脂糖凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit,AxyGEN AP‑GX‑50)回收纯化的产物,得到目的DNA分子。
[0125] (6)载体和目的片段的限制性酶切
[0126] 对目的DNA分子和载体分子进行Hind III(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切,获得相应的粘末端，酶切反应在37℃水浴反应1h(反应体系：Hind III 1μL；EcoRⅠ1μL；10×缓冲液5μL；质粒/DNA 10μL～12μL≤1μg；总体积50μL(无菌水补至总体积)；反应条件：温度37℃，酶切1小时)；2％琼脂糖凝胶电泳回收载体酶切大片段，利用Axygen琼脂糖凝胶回收试剂盒直接回收目的基因酶切片段。
[0127] (7)连接转化
[0128] 载体酶切回收大片段与目的基因酶切片段连接，采用T4连接酶(TAKARA 2011A)，在16℃反应4小时(反应体系：载体酶切片段0.5μL；目的基因酶切片段3.8μL；T4 DNA连接酶0.5μL；10×T4 DNA缓冲液0.5μL)。全部连接产物与120ul DH5α感受态细菌(NEB C2987I)混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置2min,加入预热至室温的450ul LB培养基，
37℃恒温摇床(H2‑9211K)培养60min，用离心机(H1650‑W)将菌液离心后，用移液器混匀后均匀涂布于每毫升含100ug的氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱(HW‑8C)倒置培养过夜。
37℃恒温摇床(H2‑9211K)培养60min，用离心机(H1650‑W)将菌液离心后，用移液器混匀后均匀涂布于每毫升含100ug的氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱(HW‑8C)倒置培养过夜。
[0129] (8)挑取单克隆菌PCR验证
[0130] 挑取9个单菌落接种于每毫升含100ug的氨苄青霉素的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养5h，对菌液进行扩增，选择阳性菌液，再进行测序验证。
[0131] (9)测序与结果判断
[0132] 将测序结果与设计序列进行比对，获得三个目的基因的序列及两个同型对照的序列，并用无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN DP117)提取质粒。五个分子的基因序列见图2。
[0133] 实施例2.融合蛋白R0330、R0354、R0355、R0356以及R0359的制备以及纯化方法[0134] 1)IL‑10融合蛋白R0330/R0354/R0355/R0356/R0359制备方法
[0135] 为了得到更多的目的蛋白，我们采用瞬时转染来表达蛋白，构建相应的4个表达载体质粒,分别是PCDNA3.4A‑RO354，PCDNA3.4A‑RO355 PCDNA3.4A‑RO356以及PCDNA3.4A‑R0359；采用PEI(polysciences；MW40000)转染Expi293(ThermoFisher Scientific；A14635)进行大量的瞬时表达；通过连续培养7天，离心收样。
[0136] 实验步骤：
[0137] 瞬时转染前一天的Expi293(ThermoFisher Scientific；A14635)细胞传代，用Dynamis培养基(gibco；A2617502)按2E6的密度接种1L摇瓶(conning；431147)，放入细胞培养摇床(Adolf Kuhner；ISF4‑XC)中37℃；8％ CO2；120rpm培养；
[0138] 转染当天，Expi293细胞用细胞计数仪(Countstar；IC1000)计数，用新鲜DY培养稀释调整细胞密度为2.9E6；准备转染；PEI：DNA＝3:1；将DNA‑PEI混合物加入Expi293细胞中，混匀，放入细胞培养摇床(Adolf Kuhner；ISF4‑XC)中37℃；8％CO2；120rpm培养。
[0139] 转染4h之后补加双抗(gibco；15140122)和抗凝剂(gibco；0010057)
[0140] 连续培养7天，之后收样，先低速1000rpm；10min；4℃离心(湘仪，H2050R)，收集细胞上清再一次进行高速离心(湘仪，H2050R)，12000rpm；30min 4℃；收集上清；转交给纯化组进行纯化，方法如下。
[0141] 2)IL‑10融合蛋白R0354/R0355/R0356/R0359/R0330纯化方法
[0142] 实验目的：从细胞发酵上清中分离纯化得到SE‑HPLC纯度>95％的目标hIL‑10‑hFc融合蛋白；
[0143] 纯化方法：采用MabSelect SuRe LX(Protein A)亲和捕获——pH5.0±0.1调节——Chromdex PG200分子筛精纯。
[0144] 实验材料：Expi293细胞发酵上清液；缓冲液：缓冲液A：1*PBS(10mM PB,150mM NaCl,pH7.2，广州化学试剂厂，除非特殊说明，以下试剂均来源广州化学试剂厂)；缓冲液B(20mM NaAc，pH3.4)；CIP缓冲液(0.1M NaOH)；中和缓冲液(1M Tris，pH8.0(aMResCO,0497‑500G))；缓冲液：0.5M HCitrate(国药，沪试，10007108)；超滤浓缩管(Millipore，Ultra 15mL Centrifugal Filters，30KDa)。
[0145] 实验设备:层析填料1(GE Healthcare，MabSelect SuRe LX)，层析柱1(GE Healthcare，XK16/20，柱体积(CV)，26ml)；层析系统：GE Healthcare，AKTA pure150；便携式pH计(Horiba)；酶标仪(Epoch，BioTek)；离心机(湘仪，H2050R)；层析填料2：博格隆，Chromdex PG200，层析柱2：GE Healthcare，XK26/40，柱体积(Colunm volume,CV)188.91ml。
[0146] 实验步骤：
[0147] 以融合蛋白R0354为例的纯化流程如下:
[0148] 1)目标分子捕获
[0149] 在层析系统(GE Healthcare，AKTA pure150)中对装有层析填料1(GE Healthcare，MabSelect SuRe LX)的层析柱1(GE Healthcare，XK16/20，柱体积(CV)，26ml)再生后用缓冲液A平衡10CV，重设紫外检测器(UV Monitor)，以气泡感应方式载入Expi293细胞发酵上清液。用缓冲液A洗涤层析柱20CV，接着用100％缓冲液B步阶洗脱7CV，收集
20mAu～20mAu 280nm紫外吸收组分，并在收集管中预先加入～5％中和缓冲液使最终pH在
6.0‑7.0范围,接着在位清洗(Clean in place)(CIP，CIP缓冲液向上流动(up‑flow)清洗
3CV，保持3min，然后缓冲液A向下流动(down‑flow)清洗5CV后结束。
20mAu～20mAu 280nm紫外吸收组分，并在收集管中预先加入～5％中和缓冲液使最终pH在
6.0‑7.0范围,接着在位清洗(Clean in place)(CIP，CIP缓冲液向上流动(up‑flow)清洗
3CV，保持3min，然后缓冲液A向下流动(down‑flow)清洗5CV后结束。
[0150] 按上述流程将细胞发酵后离心获得的上清液进行亲和捕获。并对各捕获后的洗脱样品分别采用SE‑HPLC(分子筛‑高效液相色谱)法进行纯度分析。其纯度结果如图4a所示。
[0151] 2)pH调节
[0152] 取该亲和洗脱组分，加入0.5M HCitrate调节pH至5.0±0.1，室温(RT)下静置>1小时后，在3500rpm，4℃下离心10min并以0.2um滤膜过滤，用SE‑HPLC法进行纯度分析。其纯度结果如图4b所示。
[0153] 3)精细纯化
[0154] 将pH调节后样品采用超滤浓缩管(Millipore， Ultra 15mL Centrifugal Filters，30KDa)浓缩至目标体积以使每次上样样品体积<5％层析柱体积，再按下述流程进行分子筛精细纯化：
[0155] 在层析系统中对装有层析填料2(博格隆，Chromdex PG200)的层析柱2(GE Healthcare，XK26/40，柱体积(Colunm volume,CV)188.91ml)再生后用缓冲液A平衡2CV至基线，重设紫外检测器，并以气泡感应方式载入样品，用缓冲液A洗涤层析柱1.5CV，收集20mAu～20mAu 280nm紫外吸收组分,在位清洗(CIP，CIP缓冲液向上流动(up‑flow)清洗
2CV，保持3min，然后缓冲液A向下流动(down‑flow)清洗5CV后结束。层析柱最终保存在CIP缓冲液中。其层析图谱如图4c所示。
2CV，保持3min，然后缓冲液A向下流动(down‑flow)清洗5CV后结束。层析柱最终保存在CIP缓冲液中。其层析图谱如图4c所示。
[0156] 将收集的洗脱组分分别送检SE‑HPLC，其中合并后的4.B.3‑4.C.1洗脱组分纯度如图4d所示。从而得到纯度>95％的hIL‑10‑hFc融合蛋白。
[0157] 实施例3.通过Fortebio法鉴定R0330、R0354、R0355、R0356融合蛋白与Fc受体的亲和力
[0158] 实验材料
[0159] 样品来源：融合蛋白R0330、R0354、R0355以及R0356来自实施例2中制备的融合蛋白。其分子量依次为90.24kDa，90.38kDa，90.34kDa以及90.62kDa。
[0160] Fc受体：FcR gamma I，FcR gamma IIa，FcR gamma IIb，FcR gamma IIIa以及FcRn重组蛋白购自Acro Biosystems；对照品hIgG1(403502，Biolegend)分以及hIgG4(403702，Biolegend)
[0161] 缓冲液体系：1*磷酸缓冲盐溶液(SBJ‑0032,森贝伽)，其中含0.02％吐温20(44112‑100G‑F，Merck)(PBST)
[0162] 再生液体系：10mM甘氨酸(G8898‑500G，Merck)
[0163] 仪器设备
[0164] 分子互相作用分析仪ForteBIO(Octet OKe)；96孔板(上海晶安生物科技，J09602)；Anti‑Penta‑HIS(HIS1K)(18‑5120，Fortebio)探针
[0165] 实验方法
[0166] FcR gamma I用1*PBST缓冲液稀释到2ug/ml，并以此浓度固化到分子互相作用分e析仪ForteBIO(Octet OK)的Anti‑Penta‑HIS(HIS1K)(18‑5120，Fortebio)探针上，此受体对应的分析物R0330、R0354、R0355、R0356、hIgG1和hIgG4分别用1*PBST缓冲液稀释到
66.67nM。FcRn，FcR gamma IIa，FcR gamma IIb以及FcR gamma IIIa分别用1*PBST稀释到
3ug/ml，并以此浓度固化到HIS1K探针上,每个受体对应的分析物R0330、R0354、R0355、R0356、hIgG1、hIgG4分别用1*PBST缓冲液稀释到2μM。用PBST平衡探针60s，分别结合各个受体180s，再次用PBST平衡探针90s后，再与对应的分析物R0330、R0354、R0355、R0356、hIgG1、hIgG4结合180s，然后于PBST中解离300s，探针于10mM甘氨酸中再生中和以后，再按照这个方法进行下个循环的平衡，结合，解离以及再生中和。所有循环转速都设定为1000rpm；实验温度为30℃。
66.67nM。FcRn，FcR gamma IIa，FcR gamma IIb以及FcR gamma IIIa分别用1*PBST稀释到
3ug/ml，并以此浓度固化到HIS1K探针上,每个受体对应的分析物R0330、R0354、R0355、R0356、hIgG1、hIgG4分别用1*PBST缓冲液稀释到2μM。用PBST平衡探针60s，分别结合各个受体180s，再次用PBST平衡探针90s后，再与对应的分析物R0330、R0354、R0355、R0356、hIgG1、hIgG4结合180s，然后于PBST中解离300s，探针于10mM甘氨酸中再生中和以后，再按照这个方法进行下个循环的平衡，结合，解离以及再生中和。所有循环转速都设定为1000rpm；实验温度为30℃。
[0167] 结果和讨论
[0168] 与野生型对照品hIgG1以及hIgG4相比较，R0330、R0354、R0355、R0356三种分子与FcR gamma I，FcR gamma IIa，FcR gamma IIb，FcR gamma IIIa四个受体几乎不结合，但是与FcRn的亲和力没有明显的减弱，与预期结果一致(见表1)。
[0169] 表1：Fortebio法评价R0330、R0354、R0355、R0356、hIgG1、hIgG4分别与FcR gamma I(表1a)，FcR gamma IIa(表1b)，FcR gamma IIb(表1c)，FcR gamma IIIa(表1d)以及FcRn(表1e)受体的亲和力
[0170] 表1a
[0171]样品ID 上样样品ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
R0354 FcR gamma I 4.18E+05 4.87E‑03 1.17E‑08
R0355 FcR gamma I 8.89E+05 1.00E‑02 1.13E‑08
R0356 FcR gamma I 6.44E+04 1.67E‑03 2.59E‑08
R0330 FcR gamma I 1.07E+05 8.47E‑04 7.93E‑09
hIgG1 FcR gamma I 3.41E+05 9.18E‑04 2.69E‑09
hIgG4 FcR gamma I 9.45E+06 4.96E‑02 5.24E‑09
R0354 FcR gamma I 4.18E+05 4.87E‑03 1.17E‑08
R0355 FcR gamma I 8.89E+05 1.00E‑02 1.13E‑08
R0356 FcR gamma I 6.44E+04 1.67E‑03 2.59E‑08
R0330 FcR gamma I 1.07E+05 8.47E‑04 7.93E‑09
hIgG1 FcR gamma I 3.41E+05 9.18E‑04 2.69E‑09
hIgG4 FcR gamma I 9.45E+06 4.96E‑02 5.24E‑09
[0172] 表1b
[0173] 样品ID 上样样品ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)R0354 FcR gamma IIa 1.06E+03 3.67E‑03 3.45E‑06
R0355 FcR gamma IIa 1.52E+03 7.39E‑03 4.87E‑06
R0356 FcR gamma IIa 2.03E+03 6.26E‑03 3.08E‑06
hIgG1 FcR gamma IIa 1.06E+04 3.67E‑03 3.45E‑07
HIgG4 FcR gamma IIa 4.44E+04 5.45E‑03 1.26E‑07
R0355 FcR gamma IIa 1.52E+03 7.39E‑03 4.87E‑06
R0356 FcR gamma IIa 2.03E+03 6.26E‑03 3.08E‑06
hIgG1 FcR gamma IIa 1.06E+04 3.67E‑03 3.45E‑07
HIgG4 FcR gamma IIa 4.44E+04 5.45E‑03 1.26E‑07
[0174] 表1c
[0175]样品ID 上样样品ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
R0354 FcR gamma IIb 1.63E+03 1.07E‑02 6.56E‑06
R0355 FcR gamma IIb 1.63E+04 2.25E‑02 1.38E‑06
R0356 FcR gamma IIb 1.53E+04 2.15E‑02 1.41E‑06
R0330 FcR gamma IIb 8.41E+03 7.78E‑04 9.24E‑08
hIgG1 FcR gamma IIb 3.47E+03 2.05E‑03 5.91E‑07
HIgG4 FcR gamma IIb 8.49E+03 2.15E‑03 2.53E‑07
R0354 FcR gamma IIb 1.63E+03 1.07E‑02 6.56E‑06
R0355 FcR gamma IIb 1.63E+04 2.25E‑02 1.38E‑06
R0356 FcR gamma IIb 1.53E+04 2.15E‑02 1.41E‑06
R0330 FcR gamma IIb 8.41E+03 7.78E‑04 9.24E‑08
hIgG1 FcR gamma IIb 3.47E+03 2.05E‑03 5.91E‑07
HIgG4 FcR gamma IIb 8.49E+03 2.15E‑03 2.53E‑07
[0176] 表1d
[0177]
[0178]
[0179] 表1e
[0180]样品ID 上样样品ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
R0354 FcRn 1.05E+04 4.47E‑03 4.24E‑07
R0355 FcRn 9.45E+03 1.87E‑03 1.97E‑07
R0356 FcRn 3.94E+05 5.72E‑02 1.45E‑07
hIgG1 FcRn 3.38E+04 5.93E‑03 1.75E‑07
HIgG4 FcRn 3.98E+04 5.53E‑03 1.39E‑07
R0354 FcRn 1.05E+04 4.47E‑03 4.24E‑07
R0355 FcRn 9.45E+03 1.87E‑03 1.97E‑07
R0356 FcRn 3.94E+05 5.72E‑02 1.45E‑07
hIgG1 FcRn 3.38E+04 5.93E‑03 1.75E‑07
HIgG4 FcRn 3.98E+04 5.53E‑03 1.39E‑07
[0181] 实施例4：CD8+T细胞的活化以及INF‑γ分泌检测
[0182] 1)目的：探究CD8+T细胞活化程度与其IL‑10受体(IL‑10R)表达的关系[0183] 实验材料：正常人来源的PBMC(本实验中所用血液为公司员工自愿捐献血液，编号为80)，CD8+T分离试剂盒(Miltenyi，cat：130‑096‑495)，DPBS(Hyclone，cat：SH3002802)，胎牛血清(FBS)(Gibco，cat：10091‑148)，X‑VIVO(LONZA,cat：04‑418Q)，抗‑CD8荧光抗体(Biolegend，cat：344732)，抗‑CD45RO荧光抗体(Biolegend，cat：304220)，抗‑hIL‑10R荧光抗体(Biolegend，cat：501404)，PE Rat IgG1,κ同种型对照抗体(Isotype Ctrl Antibody)(Biolegend，cat：400407)，抗‑CD3鼠单抗(自产)，抗‑CD28鼠单抗(自产)，24孔板、移液管等细胞培养常规耗材。
[0184] 仪器设备：生物安全柜(ESCO,AC2‑4S1)，离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司，L530R)，流式细胞仪(Beckman Coulter,Cytoflex)，二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社，MCO‑18AC)
[0185] 实验方法
[0186] CD8+T细胞分离与培养：取新鲜分离来自正常人PBMC约1×108个，按照CD8+T分离试剂盒的说明书步骤分离得到CD8+T细胞。提前在24孔板中以1μg/mL的浓度包被抗‑CD3鼠6
单抗，用含10％ FBS的X‑VIVO培养基将细胞调整到3×10 个/mL，加入抗‑CD28鼠单抗使其浓度为1μg/mL。最终将细胞以1mL/孔的体积在二氧化碳培养箱中37℃下培养在24孔板中。
单抗，用含10％ FBS的X‑VIVO培养基将细胞调整到3×10 个/mL，加入抗‑CD28鼠单抗使其浓度为1μg/mL。最终将细胞以1mL/孔的体积在二氧化碳培养箱中37℃下培养在24孔板中。
[0187] 细胞检测：分别在第0天、第3天和第6天收取培养在24孔板中的CD8+T细胞，PBS清洗一遍后，加入抗‑CD8荧光抗体，CD45RO荧光抗体，抗‑hIL‑10R荧光抗体，对照组加入抗‑CD8荧光抗体，CD45RO荧光抗体，PE Rat IgG1,κ同种型对照抗体，4℃孵育30min后PBS再次清洗细胞一遍，流式细胞仪检测其IL‑10R的表达。
[0188] 实验结果：未活化的CD8+T细胞(CD8+,CD45RO‑)表达IL‑10R极少，经过刺激活化后的CD8+T细胞(CD8+,CD45RO+)在第三天就较高表达IL‑10R，且在第6天还会增加(见图4),灰色线表示anti IL‑10R抗体的同型对照，黑色线表示anti IL‑10R。使用anti‑CD3 antibody(10μg/mL，提前包被于96孔板)和anti‑CD28(1μg/mL，游离)培养从PBMC中分离出来的CD8+T 6天。图中表示的是在0天，3天和6天，用上述方法刺激的CD8+T细胞IL‑10R的表达情况：在第
1天CD8+T细胞IL‑10R较少，第3天CD8+T细胞IL‑10R明显增加，第6天CD8+T细胞IL‑10R持续显著增加。
1天CD8+T细胞IL‑10R较少，第3天CD8+T细胞IL‑10R明显增加，第6天CD8+T细胞IL‑10R持续显著增加。
[0189] 实施例5：活化的CD8+T细胞的INF‑γ分泌检测
[0190] 2)目的：IL‑10融合蛋白促进活化后CD8+T细胞INF‑γ的分泌
[0191] 实验材料：正常人来源的PBMC(本实验中所用血液为公司员工自愿捐献血液，编号为110)，CD8+T分离试剂盒(Miltenyi，cat：130‑045‑201)，DPBS(Hyclone，cat：SH3002802)，FBS(Gibco，cat：10091‑148)，X‑VIVO(LONZA,cat：04‑418Q)，CD8荧光抗体(Biolegend，cat：344732)，抗‑CD3鼠单抗(Merck,SAB4700048‑100TST))，抗‑CD28鼠单抗(Sino Biological,
11524‑R007)，INFγ检测试剂盒(invitrogen,88‑7316‑88)，24孔板、移液管等细胞培养常规耗材。
11524‑R007)，INFγ检测试剂盒(invitrogen,88‑7316‑88)，24孔板、移液管等细胞培养常规耗材。
[0192] 仪器设备：生物安全柜(ESCO,AC2‑4S1)，离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司，L530R)，流式细胞仪(Beckman Coulter,Cytoflex)，二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社，MCO‑18AC)，酶标仪(Molecular devices,spectramax i3x)
[0193] 实验方法
[0194] CD8+T细胞分离与培养：取新鲜分离来自正常人PBMC约1×108个，按照CD8+T分离试剂盒的说明书步骤分离得到CD8+T细胞。提前在24孔板中以1μg/mL的浓度包被抗‑CD3鼠6
单抗，用含10％ FBS的X‑VIVO培养基将细胞调整到3×10 个/mL，加入抗‑CD28鼠单抗使其浓度为1μg/mL。最终将细胞以1mL/孔的体积培养在24孔板中，二氧化碳培养箱37℃继续培养三天。
单抗，用含10％ FBS的X‑VIVO培养基将细胞调整到3×10 个/mL，加入抗‑CD28鼠单抗使其浓度为1μg/mL。最终将细胞以1mL/孔的体积培养在24孔板中，二氧化碳培养箱37℃继续培养三天。
[0195] 细胞检测：分离CD8+T细胞后取少量细胞，进行CD8表型鉴定，检测其分离细胞纯度。
[0196] IL‑10融合蛋白刺激活化后CD8+T细胞：收集活化三天后的CD8+T，用含10％ FBS的6
X‑VIVO重悬细胞使之密度为2×10个/mL，以250μL/孔的体积培养在96孔板中，同时加入一定剂量的IL‑10融合蛋白R0354、R0355、R0356以及同型对照蛋白R0359，二氧化碳培养箱37℃继续培养三天。在活化三天后再次加入抗‑CD3鼠单抗，使之浓度为1μg/mL，继续培养4h。
X‑VIVO重悬细胞使之密度为2×10个/mL，以250μL/孔的体积培养在96孔板中，同时加入一定剂量的IL‑10融合蛋白R0354、R0355、R0356以及同型对照蛋白R0359，二氧化碳培养箱37℃继续培养三天。在活化三天后再次加入抗‑CD3鼠单抗，使之浓度为1μg/mL，继续培养4h。
[0197] INFγ检测：到达培养终点后收集细胞培养上清，使用INFγ检测试剂盒按照INFγ检测试剂盒说明书步骤检测其INFγ的含量。
[0198] 实验结果：自产IL‑10融合蛋白R0354、R0355、R0356均能促进活化后CD8+T细胞分泌INFγ，不同供体之间存在一定的差异(见图5),左图表示本次实验中所分离donor的CD8+T细胞纯度，为99.75％。右图是本次实验中该donor的CD8+T细胞经过anti‑CD3 antibody(10μg/mL，提前包被于96孔板)和anti‑CD28(1μg/mL，游离)活化培养3天后，再使用IL‑10融合蛋白：R0354、R0355、R0356继续培养3天后细胞的INFγ的分泌情况(R0359为同型对照)。实验结果表明IL‑10融合蛋白的三个浓度梯度(10/1/0.1μg/mL)均能刺激活化后的CD8+T细胞使其分泌INFγ，且活性R0355>R0354>R0356。
[0199] 实施例6：肿瘤模型的建立
[0200] 1)目的：用不同细胞密度的CT26WT小鼠结肠癌细胞在Balb/c小鼠皮下建立肿瘤模型，观察肿瘤生长、肿瘤出现的关系，以确定建立稳定的CT26WT小鼠结肠癌模型所需要的细胞密度。
[0201] 实验材料：雌性，Balb/c小鼠；RPMI 1640培养基(Gibco,11875085)，FBS(Gibco,10091‑148)，0.25％胰蛋白酶‑EDTA(Gibco,25200056)，青霉素‑链霉素(Gibco,15140122)，DMSO(Sigma,D2650)，DPBS(Hyclone,SH30028.02),CT26WT细胞(上海细胞库，TCM37)[0202] 仪器设备：电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，JA12002)，游标卡尺(上海美耐特实业有限公司，MNT‑150T)，显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司，BDS200)，医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司，L530R)，数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司，HH‑S)，二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社，MCO‑18AC)，双人垂直型超净台(无锡易净化设备有限公司，SW‑CJ‑VS2)
[0203] 实验方法：CT26WT小鼠结肠癌体内肿瘤模型的建立：用完全培养基：RPMI 1640培养基+10％胎牛血清(Gibco，cat：10091‑148)+1％双抗生素(1：1的青霉素－链霉素)培养小鼠结肠癌细胞CT26WT，取对数生长期的细胞，用台盼蓝染色确定活细胞数。收集细胞后，用无血清RPMI 1640培养基洗涤两次，以除去完全培养基。用75％酒精消毒雌性Balb/c小鼠前肢腋下皮肤，取已调整好密度的CT26WT小鼠结肠癌细胞接种于前肢腋下皮肤下，每只小鼠接种体积0.2mL。细胞密度设定：按细胞不同的接种数量，将Balb/c小鼠分成3组，每组5只，5 5 6
即：密度1(1×10个细胞/0.2mL/只)、密度2(5×10个细胞/0.2mL/只)、密度3(1×10个细胞/0.2mL/只)。
即：密度1(1×10个细胞/0.2mL/只)、密度2(5×10个细胞/0.2mL/只)、密度3(1×10个细胞/0.2mL/只)。
[0204] 实施例7：肿瘤模型中IL‑10融合蛋白的体内抗肿瘤评价
[0205] 实施例7.1：R0330,R0354，R0355，R0356对CT26小鼠结肠癌的体内抗肿瘤评价[0206] 1)目的：观察R0330,R0354，R0355，R0356对CT26小鼠结肠癌的抗肿瘤活性，同时设置同型对照R0359组和溶媒对照PBS组。
[0207] 实验材料：雌性，Balb/c小鼠；CT26WT细胞；RPMI 1640培养基(Gibco,11875085)，FBS(Gibco,10091‑148)，0.25％胰蛋白酶‑EDTA(Gibco,25200056)，青霉素‑链霉素(Gibco,15140122)，DMSO(Sigma,D2650)，DPBS(Hyclone,SH30028.02)
[0208] 仪器设备：电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，JA12002)，游标卡尺(上海美耐特实业有限公司，MNT‑150T)，显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司，BDS200)，医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司，L530R)，数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司，HH‑S)，二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社，MCO‑18AC)，双人垂直型超净台(无锡易净化设备有限公司，SW‑CJ‑VS2)
[0209] 实验方法
[0210] 细胞培养：将小鼠结肠癌细胞(CT26WT，)培养在含有10％胎牛血清(Gibco)、1％谷氨酰胺与1％青霉素‑链霉素(1:1)的RPMI 1640培养基(Gibco)中。
[0211] 接种：收集对数生长期的CT26WT细胞，调节细胞浓度为1X105/mL。取雌性BALB/C小5
鼠70只，皮下接种CT26WT细胞，接种体积为0.1mL/小鼠，即1X10/小鼠。
鼠70只，皮下接种CT26WT细胞，接种体积为0.1mL/小鼠，即1X10/小鼠。
[0212] 给药：接种当天记为第0天(D0)，第9天，将小鼠按瘤体积随机分为6组，每组10只，开始给药(给药方案见下表2)。
[0213] 表2 CT26WT肿瘤模型给药剂量，方式以及频率
[0214]
[0215] 记录：
[0216] D9开始测量肿瘤体积并记录，之后每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公2
式：(1/2)X长径X(短径)计算肿瘤体积(见表3；图6a)。每只小鼠达到实验终点时(肿瘤体积
3
超过2000mm达到仁慈终点)，颈椎脱臼法处死小鼠，记录生存曲线(见图6b)。
式：(1/2)X长径X(短径)计算肿瘤体积(见表3；图6a)。每只小鼠达到实验终点时(肿瘤体积
3
超过2000mm达到仁慈终点)，颈椎脱臼法处死小鼠，记录生存曲线(见图6b)。
[0217] 表3 R0330，R0354，R0355，R0356以及R0359 CT26WT模型抗肿瘤活性评价[0218]
[0219] 实验结果：与溶媒对照PBS及同型对照R0359组相比，R0354和R0356只腹腔给药1次就对CT26WT模型肿瘤生长有显著的抑瘤作用(R0330组TGI＝70.35％，R0354组TGI＝66.0％,R0356组TGI＝82.71％)(见表3；图6a)。生存期曲线见图6b，R356生存期最长，其余依次是R0354,R355、R0330。
[0220] 实施例7.2：R0356对B16‑F1小鼠黑色素瘤的体内抗肿瘤评价
[0221] 1)目的：观察R0356对B16‑F1小鼠黑色素瘤的抗肿瘤活性，同时设置同型对照R0359组。
[0222] 实验材料：雌性，C57BL/6小鼠；B16‑F1细胞(国家实验细胞资源共享平台)；DMEM(Gibco,11965084)，FBS(Gibco,10091‑148)，0.25％胰蛋白酶‑EDTA(Gibco,25200056)，青霉素‑链霉素(Gibco,15140122)，DMSO(Sigma,D2650)，DPBS(Hyclone,SH30028.02)[0223] 仪器设备：电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，JA12002)，游标卡尺(上海美耐特实业有限公司，MNT‑150T)，显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司，BDS200)，医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司，L530R)，数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司，HH‑S)，二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社，MCO‑18AC)，双人垂直型超净台(无锡易净化设备有限公司，SW‑CJ‑VS2)
[0224] 实验方法
[0225] 细胞培养：小鼠黑色素瘤细胞(B16‑F1)培养在含有10％ FBS(Gibco)、1％谷氨酰胺与1％青霉素‑链霉素的DMEM培养基(Gibco)中。
[0226] 接种：收集对数生长期的B16‑F1细胞，调节细胞浓度为2X106/mL。(1)取雌性5
C57BL/6小鼠20只，皮下接种B16‑F1细胞，接种体积为0.1mL/小鼠，即2X10/小鼠。
C57BL/6小鼠20只，皮下接种B16‑F1细胞，接种体积为0.1mL/小鼠，即2X10/小鼠。
[0227] 给药：接种当天记为第0天(D0)，将小鼠按体重随机分为2组，每组10只，开始给药(给药方案见下表4)。
[0228] 表4 B16‑F1肿瘤模型给药剂量，方式以及频率
[0229]
[0230] 记录：
[0231] D10开始测量肿瘤体积并记录，之后每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以2
公式：(1/2)X长径X(短径) 计算肿瘤体积(见表5)。
公式：(1/2)X长径X(短径) 计算肿瘤体积(见表5)。
[0232] 表5 R0356以及R0359 B16‑F1模型抗肿瘤活性评价
[0233]
[0234]
[0235] 实验结果：与同型对照R0359组相比，R0356腹腔给药2次对B16‑F1模型肿瘤生长有显著的抑瘤作用(TGI＝76.94％)(见表5；图7c)。
[0236] 实施例7.3：R0354，R0355，R0356对MC38小鼠结肠癌的抗肿瘤活性评价[0237] 1)目的：观察R0354，R0355，R0356对MC38小鼠结肠癌的抗肿瘤活性，同时设置同型对照R0359组。
[0238] 实验材料：雌性，C57BL/6小鼠；MC38细胞(国家实验细胞资源共享平台)；RPMI Medium 1640(Gibco,11875085)，FBS(Gibco,10091‑148)，0.25％trypsin‑EDTA(Gibco,25200056)，Penicillin Streptomycin(Gibco,15140122)，DMSO(Sigma,D2650)，DPBS(Hyclone,SH30028.02)
[0239] 仪器设备：电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，JA12002)，游标卡尺(上海美耐特实业有限公司，MNT‑150T)，显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司，BDS200)，医用离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司，L530R)，数显恒温水浴锅(普瑞斯机械有限公司，HH‑S)，二氧化碳培养箱(日本松下健康医疗器械株式会社，MCO‑18AC)，双人垂直型超净台(无锡易净化设备有限公司，SW‑CJ‑VS2)
[0240] 实验方法
[0241] 细胞培养：小鼠结肠癌细胞(MC38)培养在含有10％胎牛血清(Gibco)、1％谷氨酰胺与1％青‑链霉素的RPMI 1640培养基(Gibco)中。
[0242] 接种：收集对数生长期的MC38细胞，调节细胞浓度为1X107/mL。(1)取雌性BALB/C6
小鼠30只，皮下接种MC38细胞，接种体积为0.1mL/小鼠，即1X10/小鼠。
小鼠30只，皮下接种MC38细胞，接种体积为0.1mL/小鼠，即1X10/小鼠。
[0243] 给药：接种当天记为D0，在第5天，挑选肿瘤大小较均一的小鼠入组，将小鼠按瘤体积随机分为4组，每组5只，开始给药(给药方案见下表6)。
[0244] 表6 MC38肿瘤模型给药剂量，方式以及频率
[0245]
[0246]
[0247] 记录：
[0248] D5开始测量肿瘤体积并记录，之后每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公2
式：(1/2)X长径X(短径) 计算肿瘤体积(见表7)。
式：(1/2)X长径X(短径) 计算肿瘤体积(见表7)。
[0249] 表7 R0354，R0355，R0356以及R0359 MC38模型抗肿瘤活性评价
[0250]
[0251] 实验结果：与同型对照R0359组相比，低剂量1mg/kg的R0354、R0355和R0356仅腹腔给药1次对MC38模型肿瘤生长有显著的抑瘤作用(R0354组TGI＝65.32％,R0355组TGI＝54.28，R0356组TGI＝74.77％)(见表7；图7d)。
[0252] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。