一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法及其应用

摘要

本发明提供一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法及其应用，属于蛋白肽提取纯化技术领域。所述方法包括所述方法包括：将金枪鱼肉搅碎打浆后置于沸水中进行两次过筛过滤，将两次滤液合并进行三次超滤膜过滤，取第三次获得的截留液，浓缩粉粹，加热回流提取即得。本发明提供方法充分利用我国丰富的金枪鱼渔业资源及其鱼肉所含鹅肌肽的医用保健功能，有效提高金枪鱼鹅肌肽产品的工业生产加工技术水平和附加值，简化生产制备工艺，提高生产效率，同时降低生产该类产品的污染问题和生产成本，丰富市场上金枪鱼鹅肌肽产品的种类，因此具有良好的实际应用之价值。

权利要求

1.一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括：S1、将搅碎打浆后的金枪鱼肉置于沸水中进行第一次过筛过滤，得滤液a，将第一次筛网过滤后的鱼浆继续置于沸水进行第二次提取进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液合并得最终滤液c；

第一次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:10～12，温度控制在100℃，提取时间为2‑2.5h，所述筛网目数控制为150‑250目；

第二次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:8～10，温度控制在100℃，提取时间为2‑2.5h，所述筛网目数控制为150‑250目；

S2、将步骤S1所得到的滤液c采用3000‑5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d；

S3、将步骤S2所得的透过液d采用300‑350Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e；

S4、将步骤S3所得的透过液e采用150‑200Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液f；

S5、将步骤S4所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎，进行加热回流提取，过滤冷却结晶；

所述步骤S5中，加热回流提取具体方法为：将超微粉碎粉末加入乙醇采用加热回流提取1‑3h；

所述乙醇浓度为70‑90％；

S6、将步骤S5制得的结晶进一步过滤、干燥粉粹即得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇浓度为80％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，金枪鱼肉原料为袋包装的新鲜冷冻金枪鱼鱼肉，便于原料冰水解冻，不含金枪鱼鱼头，鱼尾，内脏。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:10，所述筛网目数控制为200目。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:10，所述筛网目数控制为200目。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行步骤S1前，对金枪鱼肉采用冰水解冻方法进行原料解冻。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S5中，加热回流提取具体方法为：将超微粉碎粉末加入乙醇采用加热回流提取2h；

所述乙醇浓度为80％。

说明书

一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白肽提取纯化技术领域，具体涉及一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法及其应用。

背景技术

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技
术。

[0003] 金枪鱼是一种重要的世界经济鱼类，也是我国最重要的海洋捕捞鱼种之一，广泛分布于世界各大暖水海域渔场，在渔业经济发展中占有重要的经济地位。金枪鱼又叫鲔鱼，
英文名为Tunas，属于硬骨鱼纲，鲈形目，鲭科，为大洋性高度洄游鱼类。鱼肉肉质鲜美，口感
柔嫩，营养成分丰富，研究报道金枪鱼的鱼肉中富含蛋白质，氨基酸，矿质元素，不饱和脂肪
酸、牛磺酸以及在其鱼肉组织中存在近年来国内外研究非常热门的肌肽、鹅肌肽等多肽类
成分，因此，金枪鱼具有较高的经济价值和药用价值。

[0004] 鹅肌肽(β‑丙氨酰‑1‑甲基‑L‑组氨酸，Anserine)是一种存在于水产动物组织中的组氨酸游离二肽，分子式是C10H16N4O3，分子量是240.26，具有高度稳定的水溶性，由于金枪
鱼是一种高度洄游鱼类，鱼体肌肉发达，因此，在金枪鱼鱼肉组织中存在丰富的鹅肌肽活性
成分，近十多年来，鹅肌肽在人体中的作用已经引起科学界的高度重视，大量研究结果表
明，鹅肌肽具有优异的抗疲劳、抗衰老、活性细胞免疫机能、改善人体痛风、调节人体血糖、
治疗肾病和抗肿瘤等生理功能，其医用和保健作用非常明显。

[0005] 目前，国内外有关金枪鱼鹅肌肽的研究较少，例如2009年4月29日公开的CN101417119发明专利申请公开“用于快速降低血液中的尿酸的医药组合物与包装和鹅肌
肽用于快速降低血液中尿酸的用途”，2018年9月28日公开的CN108576367A发明专利申请公
开“含鹅肌肽的鱼多肽干粉、降尿酸肽组合物、饮料及制备方法”，2018年11月2日公开的
CN108727269A发明专利申请公开“一种N(τ)‑甲基‑L‑组氨酸衍生物的制备方法及其在合成
鹅肌肽中的应用”，又如2019年5月14日公开的CN109748874A发明专利申请公开“一种鹅肌
肽及其中间体的制备方法”和2019年10月18日公开的CN110346471A发明专利申请公开“一
种测定鱼头中肌肽和鹅肌肽含量的高效液相色谱法”以及2020年4月14日公开的
CN111004181A发明专利申请公开“一种金枪鱼鹅肌肽的制备方法”，但发明人发现，无论从
天然原料中分离鹅肌肽还是化学或生物方法合成鹅肌肽，都存在因原料预处理技术和分离
工艺技术导致的成本非常高的问题，合成的鹅肌肽还存在纯度问题，而且上述制备方法使
用原料较多，制备过程复杂，不利于大规模工业化生产和获得高纯度的金枪鱼鹅肌肽。

发明内容

[0006] 针对上述现有技术，经长期的技术与实践探索，本发明提供一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法及其应用。本发明提供方法充分利用我国丰富的金枪鱼渔业资
源及其鱼肉所含鹅肌肽的医用保健功能，有效提高金枪鱼鹅肌肽产品的工业生产加工技术
水平和附加值，简化生产制备工艺，提高生产效率，同时降低生产该类产品的污染问题和生
产成本，丰富市场上金枪鱼鹅肌肽产品的种类，因此具有良好的实际应用之价值。

[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：

[0008] 本发明的第一个方面，提供一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，所述方法包括：将金枪鱼肉搅碎打浆后置于沸水中进行两次过筛过滤，将两次滤液合并进行
三次超滤膜过滤，取第三次获得的截留液，浓缩粉粹，加热回流提取即得。

[0009] 具体的，所述方法包括：

[0010] S1、将搅碎打浆后的金枪鱼肉置于沸水中进行第一次过筛过滤，得滤液a，将第一次筛网过滤后的鱼浆继续置于沸水进行第二次提取进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次
所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c；

[0011] S2、将步骤S1所得到的滤液c采用1500‑5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d；

[0012] S3、将步骤S2所得的透过液d采用300‑500Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e；

[0013] S4、将步骤S3所得的透过液e采用150‑300Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液f；

[0014] S5、将步骤S4所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎，进行加热回流提取，过滤冷却结晶；

[0015] S6、将步骤S5制得的结晶进一步过滤、干燥粉粹即得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

[0016] 本发明的第二个方面，提供上述方法制备得到的高含量金枪鱼鹅肌肽。

[0017] 本发明的第三个方面，提供上述高含量金枪鱼鹅肌肽在医用保健食品领域(如特医食品)中的应用。

[0018] 上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

[0019] 上述技术方案将金枪鱼肉通过冰水解冻、搅碎、打浆、高温提取和膜浓缩、过滤处理等制备工艺，加工成性能稳定的特医食品原料。通过物理手段根据分子量大小运用膜分
离处理对金枪鱼鹅肌肽提取的粗提液进行浓缩、分离、提纯，使金枪鱼鹅肌肽的提取及提纯
率显著增加，同时物理提纯鹅肌肽也能保证工业生产工艺绿色环保，对产品自身及生态环
境都不会造成污染，人们可以对金枪鱼鹅肌肽加工的医用保健食品放心食用。

[0020] 综上，上述技术方案提供了一种适于工业获得高含量深海金枪鱼肽的绿色制备工艺，为金枪鱼鹅肌肽的开发利用和工业化生产提供了参考依据，适于大规模工业生产，具有
重要的社会和经济效益。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域
普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附
图。

[0022] 图1为本发明实施例1中鹅肌肽标准品HPLC分析图谱；

[0023] 图2为本发明实施例1中鹅肌肽标准品HPLC分析图谱；

[0024] 图3为本发明实施例1中鹅肌肽、肌肽标准品混合标准液HPLC分析图谱；

[0025] 图4为本发明实施例1中采用200Da膜分子量膜分离后截留液HPLC分析图谱。

具体实施方式

[0026] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常
理解的相同含义。

[0027] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范
围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描
述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

[0028] 结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试
剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径
得到。

[0029] 本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种采用膜分离制备高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，所述方法包括：将金枪鱼肉搅碎打浆后置于沸水中进行两次过筛过滤，将两次滤
液合并进行三次超滤膜过滤，取第三次获得的截留液，浓缩粉粹，加热回流提取即得。

[0030] 本发明的又一具体实施方式中，所述方法包括：

[0031] S1、将搅碎打浆后的金枪鱼肉置于沸水中进行第一次过筛过滤，得滤液a，将第一次筛网过滤后的鱼浆继续置于沸水进行第二次提取进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次
所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c；

[0032] S2、将步骤S1所得到的滤液c采用1500‑5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d；

[0033] S3、将步骤S2所得的透过液d采用300‑500Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e；

[0034] S4、将步骤S3所得的透过液e采用150‑300Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液f；

[0035] S5、将步骤S4所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎，进行加热回流提取，过滤冷却结晶；

[0036] S6、将步骤S5制得的结晶进一步过滤、干燥粉粹即得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

[0037] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，

[0038] 金枪鱼肉原料为袋包装的新鲜冷冻金枪鱼鱼肉，便于原料冰水解冻，不含金枪鱼鱼头，鱼尾，内脏等金枪鱼附属物。

[0039] 本发明的又一具体实施方式中，第一次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:10～12，优选为1:10，温度控制在100℃，提取时间为2‑2.5h，所述筛网目数控制为150‑
250目，优选为200目。

[0040] 本发明的又一具体实施方式中，第二次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:8～10，优选为1:10，温度控制在100℃，提取时间为2‑2.5h，所述筛网目数控制为150‑250
目，优选为200目。

[0041] 本发明的又一具体实施方式中，进行步骤S1前，对金枪鱼肉采用冰水解冻方法进行原料解冻；具体的，上述冰水解冻方法先将大型冰箱提前放置冰块备用，然后将金枪鱼原
料连着包装放进水里(一般0.5‑1h保持水里有冰)，解冻后打开包装在低温车间切片、打浆。

[0042] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，控制陶瓷膜孔径为3000‑5000Da。

[0043] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，控制有机膜孔径为300‑350Da。

[0044] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S4中，控制有机膜孔径为150‑200Da。

[0045] 本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S5中，加热回流提取具体方法为：将超微粉碎粉末加入乙醇采用加热回流提取1‑3h(优选为2h)。

[0046] 所述乙醇浓度为70‑90％，进一步优选为80％。

[0047] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法制备得到的高含量金枪鱼鹅肌肽。

[0048] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述高含量金枪鱼鹅肌肽在医用保健食品领域(如特医食品)中的应用。

[0049] 上述采用不同膜截留分子量的陶瓷膜和超滤膜对金枪鱼沸水提取液进行超滤，为防止膜分离过程中截留液浓度太高导致提取液中的鹅肌肽出现沉淀包裹，过滤不充分，需
加水对膜浓缩液进行反复稀释过滤。

[0050] 上述本发明采用不同截留分子量的超滤膜对金枪鱼鹅肌肽提取液进行分级分离，膜过滤通过物理手段对料液进行浓缩、分离、提纯、除菌等工艺实验，可根据鹅肌肽分子量
大小以及工厂对提取鹅肌肽纯度的要求控制有机膜设备的实验参数，而且该膜还具有耐高
温、耐腐蚀以及耐用率高，制备工艺简单，适于工业大型生产制备高纯度金枪鱼鹅肌肽的需
要，符合工业绿色环保生产及本发明绿色制备金枪鱼鹅肌肽的要求。

[0051] 以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0052] 实施例1

[0053] 一种采用膜分离获得高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，具体步骤如下：

[0054] S1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

[0055] S2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

[0056] S3、将金枪鱼肉迅速搅碎打浆。

[0057] S4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第
一次过筛过滤，得滤液a，第一次筛网过滤后的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次
金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200
目的筛网进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液
c。

[0058] S5、将步骤S4所得到的最终滤液c采用5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

[0059] S6、将步骤S5所得到的透过液d采用250Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得透过液e，保留截留液待测。

[0060] S7、将步骤S6所得的透过液e采用150Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液k，保留透过液待测。

[0061] S8、将步骤S7所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎。

[0062] S9、将超微粉碎粉末通过加入80％乙醇采用加热回流提取2h,立即趁热过滤，冷却至室温结晶。

[0063] S10、过滤、干燥粉碎，得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

[0064] 实施例2

[0065] 一种采用膜分离获得高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，具体步骤如下：

[0066] S1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

[0067] S2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

[0068] S3、将金枪鱼肉迅速搅碎打浆。

[0069] S4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第
一次过筛过滤，得滤液a，第一次筛网过滤后的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次
金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200
目的筛网进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液
c。

[0070] S5、将步骤S4所得到的最终滤液c采用5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

[0071] S6、将步骤S5所得到的透过液d采用350Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得透过液e，保留截留液待测。

[0072] S7、将步骤S6所得的透过液e采用150Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液k，保留透过液待测。

[0073] S8、将步骤S7所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎。

[0074] S9、将超微粉碎粉末通过加入80％乙醇采用加热回流提取2h,立即趁热过滤，冷却至室温结晶。

[0075] S10、过滤、干燥粉碎，得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

[0076] 实施例3

[0077] 一种采用膜分离获得高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，具体步骤如下：

[0078] S1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

[0079] S2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

[0080] S3、将金枪鱼肉迅速搅碎打浆。

[0081] S4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第
一次过筛过滤，得滤液a，剩余的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次金枪鱼普通肉
鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行
第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c。

[0082] S5、将步骤S4所得到的最终滤液c采用5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

[0083] S6、将步骤S5所得到的透过液d采用300Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得透过液e，保留截留液待测。

[0084] S7、将步骤S6所得的透过液e采用150Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液k，保留透过液待测。

[0085] S8、将步骤S7所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎。

[0086] S9、将超微粉碎粉末通过加入80％乙醇采用加热回流提取2h,立即趁热过滤，冷却至室温结晶。

[0087] S10、过滤、干燥粉碎，得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

[0088] 实施例4

[0089] 一种采用膜分离获得高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，具体步骤如下：

[0090] S1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

[0091] S2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

[0092] S3、将金枪鱼肉迅速搅碎打浆。

[0093] S4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第
一次过筛过滤，得滤液a，剩余的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次金枪鱼普通肉
鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行
第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c。

[0094] S5、将步骤S4所得到的最终滤液c采用5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

[0095] S6、将步骤S5所得到的透过液d采用250Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得透过液e，保留截留液待测。

[0096] S7、将步骤S6所得的透过液e采用200Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液k，保留透过液待测。

[0097] S8、将步骤S7所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎。

[0098] S9、将超微粉碎粉末通过加入80％乙醇采用加热回流提取2h,立即趁热过滤，冷却至室温结晶。

[0099] S10、过滤、干燥粉碎，得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

[0100] 实施例5

[0101] 一种采用膜分离获得高含量金枪鱼鹅肌肽的方法，具体步骤如下：

[0102] S1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

[0103] S2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

[0104] S3、将金枪鱼肉迅速搅碎打浆。

[0105] S4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第
一次过筛过滤，得滤液a，剩余的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次金枪鱼普通肉
鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行
第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c。

[0106] S5、将步骤S4所得到的最终滤液c采用5000Da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

[0107] S6、将步骤S5所得到的透过液d采用300Da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得透过液e，保留截留液待测。

[0108] S7、将步骤S6所得的透过液e采用200Da有机膜进行第三次超滤膜过滤，得截留液k，保留透过液待测。

[0109] S8、将步骤S7所得的截留液浓缩干燥，超微粉碎。

[0110] S9、将超微粉碎粉末通过加入80％乙醇采用加热回流提取2h,立即趁热过滤，冷却至室温结晶。

[0111] S10、过滤、干燥粉碎，得高含量金枪鱼鹅肌肽最终产物。

[0112] HPLC检测试例

[0113] 1、鹅肌肽含量检测

[0114] 1.1混合标准使用液的配制

[0115] 肌肽，鹅肌肽准溶液：称取肌肽，鹅肌肽标准品各25.5mg(纯度≥98.0％)，用超纯水溶解并稀释至25.0mL，摇匀，配置成1.0mg/mL的标准储备液，置于‑4℃下密封保存。再分
别取标准储备液，用超纯水稀释至50，100，200，400，800μg/mL的标准使用液。

[0116] 1.2混合标准使用液的配制

[0117] 肌肽，鹅肌肽混合标准溶液：称取肌肽，鹅肌肽标准品各25.5mg(纯度≥98.0％)，用超纯水溶解并稀释至25.0mL，摇匀，配置成1.0mg/mL的混合标准储备液，置于‑4℃下密封
保存。再分别取混合标准储备液，用超纯水稀释至50，100，200，400，800μg/mL的混合标准使
用液。

[0118] 2、色谱条件

[0119] 鹅肌肽检测方法为本实验室自己试验考察优化建立，具体检测方法：EasySepTM‑1020分析型液相色谱仪(上海通微分析技术有限公司)，4.6x250mm x 5μm(Agilent，ZORBAX 
SB‑C18)，甲醇：磷酸二氢钾溶液(0.05mol/L)＝10:90(pH＝8.21)，流速为0.6mL/min，柱温
35℃，紫外检测器波长为210nm。

[0120] 出率计算

[0121] 占比＝目标物质金枪鱼鹅肌肽含量/相应的金枪鱼鹅肌肽终产物含量*100％

[0122] 提取率＝膜分离后终产物中金枪鱼鹅肌肽含量/膜分离前初始粗提物中金枪鱼鹅肌肽含量*100％

[0123] 根据鹅肌肽标准品溶液在高效液相HPLC检测值制作标准曲线，测得实例1‑5所制备的金枪鱼鹅肌肽中各组分含量如下表1‑1。

[0124] 表1‑1鹅肌肽含量

[0125]

[0126] 实施例由表1‑1可以看出，实施例1与实例4制备的金枪鱼鹅肌肽含量均有所下降，这是因为这两个实例采用的上限有机滤膜孔径大小为250Da，由于鹅肌肽的分子量为
240.26，因此可能此处用膜大小与鹅肌肽的分子量太接近，超滤有机膜并没有那么精准，导
致部分鹅肌肽透过超滤膜，因此损失了很少量的一部分鹅肌肽。分析表1‑1可以发现5个实
施例的金枪鱼鹅肌肽的占比明显偏高，均在47％以上，这说明金枪鱼鹅肌肽的制备过程中，
超滤有机膜的上限和下限范围越接近鹅肌肽的分子量，其制备的鹅肌肽纯度越高。为了保
证鹅肌肽出现不必要的损失，分析表1‑1可以发现，实施例1、实施例3和实施例5的金枪鱼鹅
肌肽提取率均超过了70％，这也说明，在实际工厂生产中，为了将金枪鱼鹅肌肽的得率尽量
提高，应结合实验和实际膜过滤的效果，调整超滤有机膜的上限大小为300‑350Da和下限大
小为150‑200Da，并结合80％乙醇进行最后精制，可以获得高含量的金枪鱼鹅肌肽。综上，基
于绿色环保理念，利用物理手段通过采用膜分离方法可以获得高含量的金枪鱼鹅肌肽。

[0127] 最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然
可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发
明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围
之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围
的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需
要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。