一种靶向c-Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR-T细胞及应用

摘要

本发明提供了一种靶向c‑Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR‑T细胞及应用，属于肿瘤治疗技术领域，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述嵌合抗原受体包括顺次连接的CD8a信号肽、Flag标签、所述的单链抗体、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区；所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体能够高特异性结合c‑Met抗原，以所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体修饰的T细胞可以高效靶向杀伤c‑Met高表达肿瘤细胞，在体内与体外均取得了较为理想的疗效。

权利要求

1.一种靶向c‑Met的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.编码权利要求1所述的单链抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.一种靶向c‑Met的嵌合抗原受体，其特征在于，包括顺次连接的CD8a信号肽、Flag标签、权利要求1所述的单链抗体、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

5.编码权利要求4所述的嵌合抗原受体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

6.一种靶向c‑Met的重组载体，其特征在于，包括权利要求5所述的嵌合抗原受体的基因和初始载体。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为慢病毒载体。

8.一种靶向c‑Met的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，由权利要求6或7所述的靶向c‑Met的重组载体转染T细胞获得。

说明书

一种靶向c‑Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR‑T

细胞及应用

[0001] 本发明是申请号为CN202010697872.3，发明名称为“一种靶向c‑Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR‑T细胞及应用”，申请日为2020年07月20日的发明专利的分案
申请。

技术领域

[0002] 本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种靶向c‑Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR‑T细胞及应用。

背景技术

[0003] c‑Met基因位于7号染色体(7q21‑q31)上，由21个外显子和20个内含子构成，长度约为120kDa。c‑Met初级转录本生成150kDa的多肽，然后部分糖基化形成170kDa的单链前体
蛋白。该前体蛋白进一步糖基化形成由50kDa的胞外链(α链)与145kDa的跨膜链(β链)连结
而成的约190kDa的异二聚体(Maulik G,Shrikhande A,Kijima T,et al.Role of the 
hepatocyte growth factor receptor,c‑Met,in oncogenesis and potential for 
therapeutic inhibition.Cytokine Growth Factor Rev,2002,13(1):41‑59.；Sattler 
M,Ma PC,Salgia R.Therapeutic targeting of the receptor tyrosine kinase 
Met.Cancer  Treat  Res,2004,119:121‑138.)。跨膜链(β链)包括SEMA结构域
(semahomologyregion,SEMA)、PSI结构域(plexinsemaphorin‑integrin,PSI)、4个免疫球
蛋白样重复结构域(immunoglobulin‑likeregionsinplexinsandtranscriptionfactors,
IPT)、一个跨膜域、一个近膜域(juxtamembranedomain,JM)、酪氨酸激酶结构域
(tyrosinekinase,TK)和一个羧基末端的尾部区域(Carboxylterminal,CT)。其中SEMA结构
域是配体结合的重要元素之一，被认为是HGF的结合位点，而PSI结构域的功能是使c‑Met的
胞外片段很好地与配体结合。近膜域(JM)包含两个蛋白磷酸化位点：S985和Y1003。S985位
点发生磷酸化可负调控激酶活性，Y1003残基磷酸化后与c‑Cbl结合。c‑Cbl是一种E3泛素连
接酶，可以通过指环结构域与E2泛素结合酶结合，进而支配细胞内摄并最终导致底物泛素
化和降解。酪氨酸激酶结构域活化位点Y1230、Y1234和Y1235的磷酸化促进酪氨酸激酶的激
活。c‑Met与HGF结合后，c‑Met的活化残基Y1234和Y1235发生磷酸化，进而招募胞内SH2结构
域(Srchomology‑2,SH2)和其他特异的信号效应分子激活下游信号通路(Cecchi F,Rabe 
DC,Bottaro DP.Targeting the HGF/Met signaling pathway in  cancer 
therapy.Expert Opin Ther Targets,2012,16(6):553‑572.)。

[0004] c‑Met除了参与调节正常细胞粘附、分化和迁移外，也参与细胞的恶性转化。HGF激活的c‑Met受体与细胞内的一些靶蛋白直接作用，可激活包括Ras/MAPK和PI3K/PKB等信号
转导的各级联途径，调节多种恶性肿瘤细胞的增殖分化、形态变化和运动侵袭等，从而促进
肿瘤的浸润与转移。多项研究表明，c‑Met异常表达与多种肿瘤的发生、发展和转移密切相
关。

[0005] CAR‑T，即嵌合抗原受体修饰的T细胞，是一种通过体外基因编辑技术将CAR基因稳定整合至基因组的人T淋巴细胞。CAR‑T联合了抗体的靶向作用和T淋巴细胞的效应功能，以
非MHC限制性方式高特异性识别靶抗原从而杀伤肿瘤细胞。目前，CAR‑T在血液癌症治疗方
面取得了突破性的进展，先后有两款靶向CD19的CAR‑T细胞产品上市。但对于实体瘤来说，
由于肿瘤微环境等因素的限制，影响了CAR‑T的应用效果，各国科学家都在试图解决此项难
题。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向c‑Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR‑T细胞及应用；所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体能够高特异性结合c‑Met抗原，
以所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体修饰的T细胞可以高效靶向杀伤c‑Met高表达肿瘤细胞，
在体内与体外均取得了较为理想的疗效。

[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0008] 本发明提供了一种靶向c‑Met的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

[0009] 本发明提供了编码所述的单链抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

[0010] 本发明提供了一种靶向c‑Met的嵌合抗原受体，包括顺次连接的CD8a信号肽、Flag标签、单链抗体、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区。

[0011] 优选的，所述单链抗体由铰链连接抗体轻链可变区和抗体重链可变区组合而成。

[0012] 优选的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。

[0013] 本发明提供了编码所述的嵌合抗原受体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

[0014] 本发明提供了一种靶向c‑Met的重组载体，包括所述的嵌合抗原受体的基因和初始载体。

[0015] 优选的，所述初始载体为慢病毒载体。

[0016] 本发明提供了一种靶向c‑Met的嵌合抗原受体T细胞，由所述的靶向c‑Met的重组载体转染T细胞获得。

[0017] 本发明提供了所述的单链抗体、编码所述单链抗体的基因、所述的嵌合抗原受体、编码所述嵌合抗原受体的基因、所述的重组载体、所述的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗肿
瘤的药物中的应用。

[0018] 本发明的有益效果：本发明提供的靶向c‑Met的单链抗体3D88，与c‑Met抗原有极强的结合能力，和对照抗原、细胞裂解液无显著结合；对c‑Met抗原有很好的特异性靶向功
能。本发明制备的靶向c‑Met的嵌合抗原受体T细胞，均对c‑Met阳性的H1299细胞有较为强
烈的杀伤作用，而对照细胞Mock‑T则无杀伤，其中2D81CAR‑T细胞展示了最强的杀伤效果，
相比positive control CAR‑T，2D81CAR‑T细胞分泌IFN‑γ、TNF等增强T细胞活性的细胞因
子的能力显著增强，且2D81CAR‑T细胞比positive control CAR‑T分泌更少的IL‑10(IL‑10
起免疫抑制作用)，2D81 CAR‑T显著延长了荷瘤小鼠的生存期，生理盐水组小鼠在42天时全
部死亡，Mock‑T组小鼠在47天时全部死亡，而2D81 CAR‑T组小鼠在实验终点55天时依然有
40％小鼠存活，可见2D81 CAR‑T细胞对c‑Met阳性肿瘤有很好的抑癌效果。

附图说明

[0019] 图1为ELISA检测结果；

[0020] 图2为CAR质粒图谱；

[0021] 图3为酶切电泳结果；

[0022] 图4为CAR表达率流式检测结果；

[0023] 图5为CAR‑T细胞对c‑Met阳性细胞H1299杀伤效果检测结果；

[0024] 图6为2D81 CAR‑T细胞中细胞因子检测结果；

[0025] 图7为小鼠肿瘤体积变化；

[0026] 图8为小鼠生存率结果。

具体实施方式

[0027] 本发明提供了一种靶向c‑Met的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3中的一种所示。

[0028] 在本发明中，所述靶向c‑Met的单链抗体包括2A45、2D81和3D88；所述单链抗体2A45的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

[0029] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQLGNTLFTFGSGTKLEIKSSGGGGSGGGGGGSSRSSEVQLQQSGPELVKPGSSVKI
SCKASGYSFTGYFMNWVMQSHGKSLEWIGRINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAHMEIRSLASEDSAVYYC
ARMKLIGSYMDYWGQGTSVTVSS。

[0030] 本发明中，所述单链抗体2A45包括顺次连接的轻链区、铰链区和重链区；所述轻链区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，具体如下：

[0031] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQLGNTLFTFGSGTKLEIK；

[0032] 所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，具体如下：

[0033] SSGGGGSGGGGGGSSRSS；

[0034] 所述重链区的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，具体如下：

[0035] EVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYSFTGYFMNWVMQSHGKSLEWIGRINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAHMEIRSLASEDSAVYYCARMKLIGSYMDYWGQGTSVTVSS。

[0036] 在本发明中，编码所述单链抗体2A45基因的核苷酸序列SEQ ID No.4所示，具体如下：

[0037] gatatccagatgactcaaactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattaacaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatc
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ttgggtcctatatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。

[0038] 在本发明中，所述单链抗体2D81的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

[0039] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWDSNPYLFGGGTKLEIKSSGGGGSGGGGGGSSRSSQVQLQQSGAELMKPGASVKI
SCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWMGEILPGSDYTNYNEQFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYC
ARPGYADYWGQGTTLTVSS。

[0040] 本发明中，所述单链抗体2D81包括顺次连接的轻链区、铰链区和重链区；所述轻链区的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，具体如下：

[0041] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWDSNPYLFGGGTKLEIK；

[0042] 所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，具体如下：

[0043] SSGGGGSGGGGGGSSRSS；

[0044] 所述重链区的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，具体如下：

[0045] QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWMGEILPGSDYTNYNEQFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARPGYADYWGQGTTLTVSS。

[0046] 在本发明中，编码所述单链抗体2D81基因的核苷酸序列SEQ ID No.5所示，具体如下：

[0047] caaattgttctctctcagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggagaaggtcacaatgacttgcagggccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaaccctggatttat
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aacacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagacccggctacg
cggactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca。

[0048] 在本发明中，所述单链抗体3D88的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

[0049] DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPERLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELKSSGGGGSGGGGGGSSRSSEVQLQQSGAELMKP
GASVKISCKATGDTISFNWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPESIISKKYNEKFKGKATFTADTSSNTVYMQLSSLTSE
DSAVYFCASGGYYGSLDFWGQGTPLTVSS。

[0050] 本发明中，所述单链抗体3D88包括顺次连接的轻链区、铰链区和重链区；所述轻链区的氨基酸序列如SEQ ID No.18所示，具体如下：

[0051] DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPERLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELK；

[0052] 所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，具体如下：

[0053] SSGGGGSGGGGGGSSRSS；

[0054] 所述重链区的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，具体如下：

[0055] EVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGDTISFNWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPESIISKKYNEKFKGKATFTADTSSNTVYMQLSSLTSEDSAVYFCASGGYYGSLDFWGQGTPLTVSS。

[0056] 在本发明中，编码所述单链抗体3D88基因的核苷酸序列SEQ ID No.6所示，具体如下：

[0057] gacgttgtgatgacccagactccgctcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggccaggccagtct
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tctgtgcaagcgggggttactacggtagccttgacttctggggccaaggcacccctctcacagtctcctca。

[0058] 本发明还提供了一种靶向c‑Met的嵌合抗原受体，包括顺次连接的CD8a信号肽、Flag标签、单链抗体、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区。

[0059] 在本发明中，所述CD8a信号肽、Flag标签、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.20～SEQ ID No.24所示，相应的编码所述CD8a信号
肽、Flag标签、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区的基因的核苷酸序列如SEQ 
ID No.25～SEQ ID No.29所示。

[0060] 在本发明中，所述单链抗体两侧优选的还包括第一酶切位点和第二酶切位点；所述第一酶切位点和第二酶切位点为不同的酶切位点。在本发明具体实施过程中，所述第一
酶切位点为EcoRI酶切位点(GAATTC，SEQ ID No.30)，所述第二酶切位点为BamHI酶切位点
(GGATCCA，SEQ ID No.31)。

[0061] 在本发明中，当所述单链抗体为单链抗体2A45时，所述嵌合抗原受体2A45的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，具体如下：

[0062] MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKEFDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQLGNTLFTFGSGTKLEIKSSGGGGS
GGGGGGSSRSSEVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYSFTGYFMNWVMQSHGKSLEWIGRINPNNGDTFYNQKFK
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LQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。

[0063] 在本发明中，编码所述嵌合抗原受体2A45的核苷酸序列如SEQ ID No.10，具体如下：

[0064] atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgattacaaggatgacgacgataaggaattcgatatccagatgactcaaactacatcctccctgtctgcctctctgggagac
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tctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctag。

[0065] 在本发明中，当所述单链抗体为单链抗体2D81时，所述嵌合抗原受体2D81的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，具体如下：MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKEFQIVLSQSPAILS
ASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQ
QWDSNPYLFGGGTKLEIKSSGGGGSGGGGGGSSRSSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSTYWIEWVKQR
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RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT。

[0066] 在本发明中，编码所述嵌合抗原受体2D81的核苷酸序列如SEQ ID No.11，具体如下：

[0067] atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgattacaaggatgacgacgataaggaattccaaattgttctctctcagtctccagcaatcctgtctgcatctccaggggag
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acagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagc
caccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctag。

[0068] 在本发明中，当所述单链抗体为单链抗体3D88时，所述嵌合抗原受体3D88的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，具体如下：

[0069] MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKEFDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPERLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELKS
SGGGGSGGGGGGSSRSSEVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGDTISFNWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPESIISK
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EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。

[0070] 在本发明中，编码所述嵌合抗原受体3D88的核苷酸序列如SEQ ID No.12，具体如下：

[0071] atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgattacaaggatgacgacgataaggaattcgacgttgtgatgacccagactccgctcactttgtcggttaccattggacaa
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cgctag。

[0072] 本发明提供了一种靶向c‑Met的重组载体，包括所述的嵌合抗原受体基因和初始载体。在本发明中，所述初始载体优选为慢病毒载体；所述嵌合抗原受体基因优选的重组于
所述慢病毒载体的XbaI和SalI位点之间。本发明对所述靶向c‑Met的重组载体的制备方法
没有特殊限定，采用本领域常规的重组慢病毒载体的制备方法即可。在本发明中，优选的将
CD8a信号肽、Flag标签、CD8a铰链区‑跨膜区、4‑1BB功能区和CD3功能区连接至初始载体上
后，再连接单链抗体。本发明对所述连接的方法没有特殊限定，采用本领域常规的连接方法
即可。

[0073] 本发明提供了一种靶向c‑Met的嵌合抗原受体T细胞，由所述的靶向c‑Met的重组载体转染T细胞获得。在本发明中，所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，优选
的包括以下步骤：1)将健康人体外周血中分离T细胞并培养；2)将所述慢病毒载体与步骤1)
中所述培养后的T细胞混合转染获得所述靶向c‑Met的嵌合抗原受体T细胞。本发明对所述T
细胞的分离方法没有特殊限定，采用本领域常规的T细胞分离方法即可；本发明在所述分离
后，将所述T细胞置于X‑VIVO+100U IL2完全培养液中悬浮，并加入CD3/CD28磁珠培养；所述
培养优选的在培养箱中进行，所述培养的温度优选为37℃，所述培养的二氧化碳体积浓度
优选为5％，所述培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述慢病毒载体与
所述培养后的T细胞混合的比例根据病毒的MOI计算，所述MOI优选为15。在本发明中，所述
转染的时间优选为2～4d，更优选为3d。

[0074] 本发明提供了所述的单链抗体、编码所述单链抗体的基因、所述的嵌合抗原受体、编码所述嵌合抗原受体的基因、所述的重组载体、所述的嵌合抗原受体T细胞在制备治疗肿
瘤的药物中的应用。在本发明中，所述单链抗体对c‑Met抗原有很好的特异性靶向功能；所
述靶向c‑Met的嵌合抗原受体T细胞，对c‑Met阳性细胞有较为强烈的杀伤作用，对c‑Met阳
性肿瘤有很好的抑癌效果；可以应用于制备治疗肿瘤的药物中。

[0075] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0076] 实施例1

[0077] 噬菌体展示筛选可变区序列

[0078] 从免疫c‑Met胞外抗原的小鼠脾脏和骨髓中用trizol法提取总RNA，用鼠抗体scFv基因扩增试剂盒(货号：P001Z)扩增鼠抗体可变区基因，以一段由多个甘氨酸(Gly)与丝氨
酸(Ser)构成的肽连接物Linker(铰链区序列：SSGGGGSGGGGGGSSRSS)连接抗体重链与轻链
可变区，形成单链抗体基因片段scFv，将scFv单链抗体基因片段克隆到噬菌粒载体
pCANTAB5E中，构建scFv噬菌体展示文库，使单链抗体scFv在噬菌体展示文库中展示表达。
8
之后经过质粒提取，将噬菌体质粒电转化建库，库容≥10 。随后，用ELISA板包被c‑Met蛋白
(来源：c‑MET Protein,Human,Recombinant(His Tag)Cat:10692‑H08H)对噬菌体库进行筛
选，采用“淘洗‑扩增‑富集”的循环方式，得到阳性克隆后，通过ELISA实验对挑选的阳性克
隆做进一步检测，将ELISA检测的阳性克隆PCR，酶切分型后送测序，根据测序结果挑选适合
的可变区序列，最终确定2A45、2D81、3D88三株效果最好的噬菌体克隆株，其ELISA结果如图
1所示。检测结果显示，2A45、2D81、3D88三个噬菌体克隆株与c‑Met抗原有极强的结合能力，
而与对照抗原、细胞裂解液无显著结合，说明上述三株克隆对c‑Met抗原有很好的特异性靶
向功能。

[0079] 实施例2

[0080] CAR质粒构建

[0081] CAR序列构建思路如图2所示。根据测序得到的3个靶向c‑Met的scFv序列设计以下的扩增引物，

[0082] 2A45‑F：taaggaattcgatgttgtgatgacc(SEQ ID No.32)

[0083] 2A45‑R：ggtggatcctgaggagacggtgac(SEQ ID No.33)

[0084] 2D81‑F：taaggaattccagattgttctctctc(SEQ ID No.34)

[0085] 2D81‑R：ggtggatcctgaggagactgtgag(SEQ ID No.35)

[0086] 3D88‑F：aaggaattcgacgttgtgatgacc(SEQ ID No.36)

[0087] 3D88‑R：gtggatcctgaggagactgtgag(SEQ ID No.37)

[0088] 经过PCR扩增分别得到携带酶切位点的2A45、2D81、3D88 scFv基因片段。将上述基因片段分别与PZX‑CAR载体(PZX‑CAR载体图谱如图2所示)分别进行EcoRI和BamHI双酶切处
理，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的基因与骨架质粒。之后，在室温下，用高效T4连接酶
连接15min，转化到Stbl3感受态中，冰上静置30min后42℃热激90s，并迅速放入冰中2min。
加入500μL LB液体培养基，37℃孵育60min。4000rpm离心3min收集菌体，将菌体均匀的涂布
在含抗生素平板上。隔夜挑取单克隆菌株，摇菌后提取质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图3
所示，1、2、3、4泳道分别对应2A45 CAR、2D81 CAR、3D88 CAR和阳性对照CAR，切下目的片段
大小在1500bp左右，与预期相符。将酶切鉴定成功的菌株送测序公司测序。

[0089] 实施例3

[0090] CAR‑T细胞构建

[0091] 1.慢病毒包装

[0092] 分别取20μL携带2A45 CAR、2D81 CAR、3D88 CAR和阳性对照CAR的菌液及慢病毒辅助质粒(SL3、SL4、SL5)的不同菌液，分别加入到含有100mL LB培养基(添加Amp，Amp的终浓
度为100μg/mL)的不同锥形瓶中，在摇床上培养16h，条件为37℃，180rpm。然后用无内毒素
质粒大提试剂盒(天根生物)进行质粒大提。分别将不同CAR质粒与包装质粒共转染到293T
细胞中，转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min。收集上清，用0.45μm的滤膜过滤，用
超速离心机收集慢病毒沉淀。离心条件为4℃，100000×g，无刹车，离心90min。将浓缩后的
慢病毒按每管200μl分装到0.5mL冻存管中，‑80℃分装冻存。

[0093] 2.T细胞分离

[0094] 从一份健康人外周血中取出20ml加入到50ml离心管中，向血液中加入1mL TM
RosetteSep Cocktail混匀，使抗体浓度为50μL/mL。将20mL GE Ficoll液加入新的50mL离
心管中，用吸管小心吸取20mL稀释好的血样按1:1缓慢加入Ficoll液的上层。将加好血样的
离心管放入离心机内，转速400g，离心30min。用无菌吸管吸掉上层血浆和血小板，不要碰到
单个核细胞层，小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到新的离心管内。每管淋巴细胞悬
液加入三倍体积PBS清洗细胞，400g离心10min。弃上清，用5mL PBS重悬所得细胞，1200rpm
离心10min。最后用X‑VIVO+100U IL2完全培养液悬浮细胞，细胞计数。将1mL分离的密度为1
6
×10 T淋巴细胞接种至24孔板的1个孔中，并加入25μl CD3/CD28磁珠。将细胞培养于5％
CO237℃培养箱中，48h后用于慢病毒感染。

[0095] 3.病毒感染T细胞

[0096] 按照MOI＝15加入相应的慢病毒，第二天细胞补液，每孔补加至30ml并转移至T 75瓶中，水平放置培养。3天后，将CAR‑T细胞转移至无菌流式管内，每管细胞放置于biolegend
磁铁上2min去除磁珠。之后去部分细胞染流式抗体检测CAR表达率，检测结果如图4所示，
2A45 CAR表达率为86.4％、2D81 CAR表达率为78.8％、3D88 CAR表达率为82.7％、阳性对照
CAR表达率为79.0％。

[0097] 实施例4

[0098] 细胞体外杀伤

[0099] 在检测白板中，样品孔接种H1299靶细胞个数为1×104个/孔，重复5个孔，同时设置5个对照孔，每孔100μl。过夜后，吸弃上清后，加入CAR‑T细胞，效靶比为E/T ratio＝5:1；
每孔100μl。6h后，1500rpm离心5min，所有孔尽量去掉上清。每孔加入100μl裂解液，室温裂
解10min，开始上机检测，每孔加入萤火虫荧光素酶检测试剂100μL。杀伤效率计算公式：杀
伤效率(％)＝(对照孔荧光强度‑杀伤荧光强度)/(对照孔荧光强度‑空白孔荧光强度)×
100％。杀伤结果如图5所示，所制备的四种CAR‑T细胞均对c‑Met阳性的H1299细胞有较为强
烈的杀伤作用，而对照细胞Mock‑T则无杀伤。在几种CAR‑T细胞中2D81 CAR‑T细胞展示了最
强的杀伤效果，比专利201810687119.9中涉及的CAR‑T细胞(positive control CAR‑T)效
果更好。

[0100] 实施例5

[0101] 细胞因子测定

[0102] 将Mocl‑T、positive control CAR‑T和2D81 CAR‑T与H1299共孵育6h后取上清溶解，用CBA法测定其中细胞因子含量，具体步骤如下：将标准品小球转移至15ml离心管中，加
入2mlAssay Dilute，于室温放置至少15min，用枪轻轻吹匀，不能涡旋或强烈混匀，标记为
最高浓度标准品。准备8个EP管，每管加入100μlAssay Dilute，从最高浓度标准品吸出100μ
l至下一管中，1：2梯度稀释一直到1：256，用枪轻轻吹匀，不能涡旋或强烈混匀，准备一管只
有Assay Dilute为0pg/ml，即为阴性对照。漩涡震荡capturebeads，所有实验管每管加入50
μl。加入50μl稀释后的标准品或样品到各自管中，之后加入50μl Detection Reagent到所
有实验管中。混匀后室温避光孵育3h，此时可以进行流式setup。每管中加入1ml wash 
buffer，200g离心5min，小心吸走上清，最后加入300μl wash buffer重悬bead沉淀。检测结
果如图6所示，2D81 CAR‑T细胞与positive control CAR‑T分泌IFN‑γ、TNF等增强T细胞活
性的细胞因子的能力显著增强，且2D81 CAR‑T细胞比positive control CAR‑T分泌更少的
IL‑10(IL‑10起免疫抑制作用)。

[0103] 实施例6

[0104] 小鼠体内实验

[0105] 选用6‑8周雄性NOG小鼠作为实验动物。H1299细胞消化后用无菌1×PBS重悬清洗6
细胞2次进行活细胞计数，调整细胞密度为5×10 /50μl/只，细胞注射时按照1：1体积每只
混合50μl基质胶，即最终每只小鼠注射100μl总体积的细胞混悬液。移植部位为小鼠背部右
下侧皮下。肿瘤移植后，肿瘤体积用卡尺每周三次进行测量，肿瘤体积计算公式为TV＝0.5a
2 3 7
×b。当肿瘤大小达到100mm时，按10/只回输CAR‑T细胞或生理盐水，并持续观察肿瘤大小
与小鼠存活状况。从图7可知，接种2D81CAR‑T后小鼠的肿瘤体积得到了有效的控制，而生理
盐水组与Mock‑T组肿瘤快速增大。从图8可知，2D81 CAR‑T显著延长了荷瘤小鼠的生存期，
生理盐水组小鼠在42天时全部死亡，Mock‑T组小鼠在47天时全部死亡，而2D81 CAR‑T组小
鼠在实验终点55天时依然有40％小鼠存活，证明2D81 CAR‑T细胞对c‑Met阳性肿瘤有很好
的抑癌效果。

[0106] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。