一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达

摘要

本发明公开了一种分枝杆菌的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达，属于酶基因工程及酶工程领域。本发明提供一种来自于分枝杆菌的放线菌17β‑羟基类固醇脱氢酶17β‑HSDy1及其基因序列，以pMA5为表达质粒，以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主，实现了分枝杆菌LY‑1的17β‑HSDy1的外源表达。对软件模拟获得的该酶关键T239位点，突变成了酪氨酸，酶活提高了19.2％，达到9571.77U·mg‑1。对突变获得的重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y进行酶活‑生长曲线的测定，在发酵28h时，重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y的比酶活达到最高。该异源表达菌株可用于雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮转化宝丹酮的生产，具有潜在的工业应用。

权利要求

1.一种17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

2.一种17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，其特征在于：核苷酸序列为以下任意一种：a)如SEQ ID NO:3所示的碱基序列；

b)编码由如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.一种用于编码17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体的重组表达质粒，其特征在于：含有权利要求2所述的核苷酸序列。

4.一株表达17β‑羟基类固醇脱氢酶的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株含有权利要求2所述的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体的基因表达载体，或含有权利要求3所述的重组表达质粒。

5.根据权利要求4所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的宿主微生物为枯草芽孢杆菌WB600。

6.一种制备宝丹酮的方法，其特征在于，利用如权利要求4或5所述的工程菌株进行底物转化制备宝丹酮，其中，所述底物为雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮，底物浓度为3g/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述工程菌株转接至含3g/L雄甾烯‑1，‑1

4‑烯‑3，17‑二酮的培养基中，30‑37℃，220r·min 转化24‑30h，得到宝丹酮。

说明书

一种分枝杆菌的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达

技术领域

[0001] 本发明属于遗传工程和发酵工程领域，具体涉及一种来源于分枝杆菌的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达。

背景技术

[0002] 甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，在医疗领域具有广泛的应用，临床中常用于治疗过敏性疾病、风湿性关节炎、避孕及手术麻醉等。常见的甾体药物中间体分为C19类与C22类，其中以宝丹酮(BD)、雄甾烯‑4‑烯‑3，17‑二酮(AD)、雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮(ADD)、9α‑羟基雄甾烯‑4‑烯‑3，17‑二酮(9α‑OH‑AD)和睾酮(T)为主的甾体药物中间体在医药领域市场的需求逐年上升。

[0003] 宝丹酮(BD)是雄激素合成代谢类固醇和睾丸激素(TS)衍生物，可促进蛋白质合成，支持氮保留并刺激肾脏促红细胞生成素释放。BD通常是由雄甾烯‑4‑烯‑3，17‑二酮(AD)通过化学合成制得的。然而，微生物转化法具有高立体选择性、绿色环保等优点，在已逐渐在甾体药物中间体的应用中发挥着越来越大的作用，近年来通过生物合成BD成了研究的热点。

[0004] 17β‑羟基类固醇脱氢酶(17β‑HSD)，是一类氧化还原酶，能够催化甾体中C‑17的羟基与酮基之间的相互转化，反应时需要辅因子NAD(P)H/NAD(P)+。许多微生物可以利用雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)作为底物通过17β‑羟基类固醇脱氢酶还原反应以产生BD，但它们的低底物浓度和转化率不能满足工业生产要求。迄今为止，研究人员共鉴定出15种类型的17β‑HSD同工酶，除17β‑HSD5属于醛、酮还原酶即AKR超家族之外，其他的同工酶都属于短链脱氢酶/还原酶即SDR超家族。

[0005] 针对此酶在实际转化甾体药物中间体中的应用，鉴定更多的、高效的17β‑羟基类固醇脱氢酶用于宝丹酮的生物转化是具有非常重要的意义。

发明内容

[0006] 发明目的：本发明的目的在于提供一种来源于分枝杆菌的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其异源表达，通过对酶活性位点的模拟分析，获得高酶活突变体，并研究了该突变体的相关性质；利用异源表达突变体工程菌成功实现了从雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮(ADD)到宝丹酮的转化。

[0007] 本发明通过软件模拟获得17β‑羟基类固醇脱氢酶的关键活性T239位点，将其突变成了酪氨酸，酶活提高了19.2％。将其突变体在枯草芽孢杆菌异源表达，对该突变体的相关性质进行了研究，用于指导后续的工业化应用。利用该突变体异源表达菌株成功实现了从雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮(ADD)到宝丹酮的转化，为其进一步的工业化应用奠定基础。

[0008] 本发明的第一个目的是提供一种17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体，所述的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β‑羟基类固醇脱氢酶的第239位苏氨酸替换为酪氨酸。

[0009] 进一步地，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β‑羟基类固醇脱氢酶的第239位苏氨酸替换为酪氨酸时，突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0010] 所述17β‑羟基类固醇脱氢酶的基因来源于分枝杆菌Mycobacterium sp LY‑1 CGMCC No.13031。

[0011] 本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。核苷酸序列为以下任意一种：

[0012] a)如SEQ ID N0:3所示的碱基序列；

[0013] b)编码由如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。

[0014] 本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达质粒。进一步地，所述的质粒是以pMA5为载体。所述重组表达质粒为pMA5‑17βHSDy1‑T239Y。

[0015] 本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的重组工程菌株，所述工程菌株整合有上述的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，或含有上述的重组表达质粒。

[0016] 进一步地，所述的重组工程菌株是以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主。得到的工程菌株为枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y。

[0017] 本发明的第五个目的是提供所述的重组工程菌株或/和该工程菌株分泌表达的粗酶液，在微生物转化雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮(ADD)生成宝丹酮的应用。

[0018] 进一步的，所述制备宝丹酮是以雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮为底物，生成宝丹酮。

[0019] 更进一步的，所述粗酶液的发酵条件为：温度30℃，pH6，发酵时间30h。

[0020] 更进一步的，将所述工程菌株转接至含3g/L雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮的培养基‑1中，30‑37℃，220r·min 转化24‑30h，得到宝丹酮。

[0021] 本发明的第六个目的是提供上述的工程菌株的应用制备得到的宝丹酮。

[0022] 有益效果：本发明通过对分枝杆菌LY‑1的基因进行注释，挖掘到一种17β‑羟基类固醇脱氢酶17β‑HSDy1。通过分子对接模拟确定17β‑羟基类固醇脱氢酶活性中心氨基酸，并对关键氨基酸残基进行了定点突变，提高了17β‑羟基类固醇脱氢酶的酶活。本发明改造的‑117β‑羟基类固醇脱氢酶突变体的酶活提高了19.2％，达到9571.77U·mg 。改造后的基因工程菌成功实现了从雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮(ADD)到宝丹酮的转化，提高生产效率，具有工业应用的潜在价值。
附图说明:

[0023] 图1不同17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体在枯草芽孢杆菌中异源表达的酶活比较；

[0024] 图2为重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y的酶活‑生长曲线；

[0025] 图3为17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体粗酶液的最适温度；

[0026] 图4为17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体粗酶液的最适pH。

具体实施方式

[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0028] 实施例

[0029] 根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0030] (1)培养基：

[0031] LB液体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 5.0g/L。

[0032] ADD转化培养基：ADD 3g/L，羟丙基‑β‑环糊精20g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 5.0g/L。

[0033] (2)17β‑羟基类固醇脱氢酶及其突变体的酶活测定

[0034] 将含有0.3mmol·L‑1底物ADD的2％甲醇溶液与1mL含有1.5mmol·L‑1NADPH的50mmol·L‑1磷酸钾缓冲液(pH＝6.0)混合，并置于30℃金属浴中保温，随后加入500μL破碎后上清粗酶液，置于对应温度的金属浴中反应5min，记录OD340变化。

[0035] 酶活：将每分钟催化反应消耗1μmol NADPH所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。其中，εNADPH＝6.22L·(mmol·cm)‑1。

[0036] 实施例1：分枝杆菌LY‑1中17β‑HSD基因的挖掘

[0037] 根据分枝杆菌LY‑1的全基因注释结果的最终测序分析报告。得到了一个17β‑HSD基因，碱基序列如SEQ ID N0:1所示，完整的目的基因推导的对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，命名为17β‑HSDy1。通过Blastp，比对17β‑HSDy1序列，确认存在序列高度一致的编码17β‑HSD酶的DNA序列。

[0038] 实施例2：分枝杆菌LY‑1基因组DNA的提取

[0039] (1)分枝杆菌LY‑1菌株在液体种子培养基(15.0g·L‑1酵母粉，0.6g·L‑1(NH4)‑1 ‑12HPO4，5.4g·L NaNO3，2.0g·L 甘油)中培养2‑3天，培养温度30℃，转速为120rpm/min。将生长良好的菌液吸取1mL于1.5mL EP管中，12000rpm，离心1min，彻底弃净培养基。

[0040] (2)于离心管中加入150μL PH 8.0的TE缓冲液充分悬浮细菌，并加入8μL 3mg·‑1mL 的溶菌酶，使用枪头对菌体进行碾压，使其充分裂解；

[0041] (3)于离心管中依次加入300μL Digestion Solution，4μL RNase A混匀后，置于55℃金属浴保温10min；再加入4μL Proteinase K，置于55℃金属浴保温30min。

[0042] (4)依次添加300μL Ext solution、300μL PB solution并充分振荡后，于12000rpm室温离心5min，将下层溶液全部转移至2mL的收集柱中。

[0043] (5)8000rpm室温离心1min后将收集的液体再次倒回收集柱中，8000rpm室温离心1min。

[0044] (6)将收集柱放回收集管中，加入500μL Wash solution，8000rpm室温离心1min。

[0045] (7)将步骤(6)重复一次后，收集柱重新放回收集管中，于室温12000rpm离心1min后，将收集柱放入灭菌的1.5mL EP管中，置于烘箱中烘3‑5min后，在收集柱中央加入100μL Elution Buffer，室温放置2min后12000rpm室温离心1min。离心管中的液体即为基因组DNA。

[0046] 实施例3：分枝杆菌LY‑1的17β‑HSDy1基因的克隆及质粒pMA5‑17β‑HSDy1的构建[0047] 根据分枝杆菌LY‑1全基因组的测序结果分析获得的17β‑HSDy1基因序列设计引物。

[0048] 引物P1：aaagtgaaatcagggggatccTCATCGGGGTGCCATCCT

[0049] 引物P2：atttcgacctctagaacgcgtGTGCACCACCACCACCACCACAAGTTAGAGAACTCCATCGCA

[0050] 以上述提取的分枝杆菌LY‑1基因组为模板，用上述引物pcr扩增17β‑HSD的编码基因。PCR反应在25μL的体系中进行，反应条件为：95℃预变性3min后开始循环；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸l min，共34个循环；72℃终延伸l0 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。

[0051] 选用一步克隆试剂盒构建重组枯草芽孢杆菌的质粒pMA5‑17βHSDy1。

[0052] 将构建成功的质粒通过化学转化法转化入枯草芽孢杆菌WB600，涂布于含有50mg/L的卡那霉素的LB培养基过夜培养，挑取阳性转化子，获得异源表达重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1。

[0053] 实施例4：分枝杆菌LY‑1来源17β‑羟基类固醇脱氢酶晶体结构模拟

[0054] 以已报道的来自Thermus thermophilus HB8的II型3‑羟酰基辅酶A脱氢酶(PDB code：1UAY)为模板(两者氨基酸相似度为54.36％)，利用分子模拟对接软件Autodock，模拟底物雄甾烯‑1，4‑烯‑3，17‑二酮(ADD)与17β‑HSDy1的对接，选择该酶第239位苏氨酸为本研究的17β‑HSDy1的活性位点。

[0055] 实施例5：17β‑羟基类固醇脱氢酶活性位点突变对酶活表达的影响

[0056] 利用定点突变试剂盒，设计引物T239‑F，T239‑R如表1所示，以已经构建的pMA5‑17β‑HSDy1为模板，进行PCR，17β‑羟基类固醇脱氢酶的第239位酪氨酸分别替换为谷氨酰胺，酪氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，亮氨酸。PCR反应条件为：95℃3min，34个循环(95℃30S、58℃30S、72℃1.5min)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，Prime Star Max(Premix)DNA20μL，ddH2O 17μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。将其转化到感受态E.coil JM109，涂布氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，再转入枯草芽孢杆菌WB600，得到定点突变的重组菌株。

[0057] 表1引物序列

[0058]

[0059]

[0060] T239代表无突变。

[0061] T239Q代表将位置239的氨基酸由亲本的苏氨酸(Thr，T)替换为谷氨酰胺(Gln，Q)，[0062] T239Y代表将位置239的氨基酸由亲本的苏氨酸(Thr，T)替换为酪氨酸(Tyr，Y)，重组表达质粒为pMA5‑17βHSDy1‑T239Y，得到的工程菌株为枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y。

[0063] T239V代表将位置239的氨基酸由亲本的苏氨酸(Thr，T)替换为缬氨酸(Val，V)，T239G代表将位置239的氨基酸由亲本的苏氨酸(Thr，T)替换为甘氨酸(Gly，G)，

[0064] T239A代表将位置239的氨基酸由亲本的苏氨酸(Thr，T)替换为丙氨酸(Ala，A)，[0065] T239L代表将位置239的氨基酸由亲本的苏氨酸(Thr，T)替换为亮氨酸(Leu，L)，[0066] 将发酵生长良好的不同突变体重组菌B.Subtilis‑pMA5‑17β‑HSDy1进行超声细胞破碎，超声细胞破碎20min，8000rpm离心20min，取上清制得粗酶液。将上清粗酶液用于酶活测定。不同突变体的酶活如图1所示，其中突变体2的酶活最高，将17β‑羟基类固醇脱氢酶的‑1第239位苏氨酸突变为酪氨酸，其酶活提高了19.2％，达到9571.77U·mg 。

[0067] 实施例6：重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y酶活‑生长曲线的测定[0068] 将重组菌接种至LB液体种子培养基(10.0g·L‑1蛋白胨，5g·L‑1酵母粉，10.0g·L‑1NaCl)中培养，培养温度37℃，转速为220rpm/min。自发酵12h起，每隔8h取样，测定菌体的OD，并进行对应的每个时间取样的酶活测定。绘制酶活‑生长曲线，如图2所示，在发酵28h‑1
时，重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y的比酶活为9571.77U·mg ，此时重组菌的OD600为13.29。随着重组菌的发酵时间的延长，菌株的生长及产酶能力均呈现衰退趋势。

[0069] 实施例7：17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体粗酶液的相关性质考察

[0070] (1)粗酶的最适反应温度探究

[0071] 将含有0.3mmol·L‑1底物ADD的2％甲醇溶液与1mL含有1.5mmol·L‑1NADPH的‑150mmol·L 磷酸钾缓冲液(pH＝6.0)混合，并置于20、25、30、35、40℃的金属浴中保温，随后加入500μL破碎后上清粗酶液，置于对应温度的金属浴中反应5min，每组做三个平行，记录OD340变化。

[0072] 粗酶液的最适反应温度结果如图3所示，粗酶液的最适反应温度为30℃。

[0073] (2)酶的最适反应pH探究

[0074] 分将含有0.3mmol·L‑1底物ADD的2％甲醇溶液与1mL含有1.5mmol·L‑1NADPH的‑150mmol·L 不同pH的磷酸钾缓冲液(pH＝5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)混合，并置于30℃的金属浴中保温，随后加入500μL破碎后上清粗酶液，置于对应的金属浴中反应5min，每组做三个平行，记录OD340变化。

[0075] 粗酶液的最适反应pH结果如图4所示，粗酶液的最适反应pH为6。

[0076] (3)粗酶的底物谱分析

[0077] 根据分枝杆菌LY‑1中17β‑HSDy1的作用底物，利用重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y异源表达菌株的破碎后上清，对17β‑HSDy1进行相对底物特异性分析。以AD作为参照底物，将其酶活设为100％，用以表征酶对ADD和9α‑OH‑AD的相对活性。其中，重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1的构建方法如实施例3。

[0078] 表2酶对ADD和9α‑OH‑AD的相对活性

[0079]

[0080] 重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y特征底物为ADD，其次为AD与9α‑OH‑AD，与突变前的异源表达菌株相比，底物偏好性未变。

[0081] 实施例7：WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y转化ADD生成宝丹酮

[0082] 由于ADD为脂溶性物质，本发明在利用重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSD y1‑T239Y进行底物ADD转化的过程中，添加助溶剂，使得ADD的终浓度为3.0g/L。最终在利用重组菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1‑T239Y成功实现了转化ADD生成宝丹酮，结果如表3所示，相较于原始枯草芽孢杆菌，异源表达17βHSDy1后的重组枯草芽孢杆菌(重组枯草芽孢杆菌WB600‑pMA5‑17βHSDy1的构建方法如实施例3)实现了转化ADD生成宝丹酮，说明17βHSDy1在枯草芽孢杆菌中实现了成功表达；而通过突变后的17βHSDy1‑T239Y在枯草芽孢杆菌中也实现了成功表达，并且ADD生成宝丹酮的转化率得到大大提升，是未突变17βHSDy1重组工程菌株的150％。

[0083] 表3ADD生成宝丹酮的转化率

[0084]

[0085] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。