一种高羊茅组织培养和分化再生的方法

摘要

本发明提出了一种高羊茅组织培养和分化再生的方法，包括如下步骤：S1、种子的消毒灭菌；S2、外植体胚性愈伤组织的诱导培养；S3、愈伤组织增殖培养；S4、胚性愈伤组织的分化培养及幼胚的快速增殖；S5、壮苗生根培养及无菌苗的移栽。本发明操作简单，种子胚芽易形成胚性愈伤组织，通过分化培养基上形成具有根茎叶的完整植株，形成的组培苗移栽成活率高。经过胚状体增殖培养，可在短短的2个月内形成大量的胚状体丛生芽或小植株。丛生芽或小植株只需在基本培养基中培养20天左右就可形成具有根、茎、叶的完整的健壮种苗。

权利要求

1.一种高羊茅组织培养和分化再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、种子的消毒灭菌：去除颖片和稃片，采用70％酒精以及30％次氯酸钠对种子进行消毒灭菌；

S2、外植体胚性愈伤组织的诱导培养：纵切每粒种子，接种于愈伤组织诱导培养基上，于25℃环境下暗培养；

S3、愈伤诱导组织增殖培养：培养4周，选择饱满结实的胚性愈伤组织转接到继代培养基上，每3‑4周继代一次；

S4、胚性愈伤组织的分化培养及种苗幼胚的快速增殖：采用分化培养基对胚性愈伤组织进行培养得到胚状体，胚状体置于增殖培养基中光照培养；

S5、壮苗生根培养及无菌苗的移栽：采用胚状体培养基光照培养，将组培苗室内炼苗1‑

2d之后移栽到穴盘中，适当遮荫，及时浇水，10‑20d即可成活；

所述S2中愈伤组织诱导培养基中包括8mg/L MS，8mg/L 2,4‑D，2mg/LNAA，0.5g/L水解酪蛋白，50g/L蔗糖以及7g/L琼脂粉；

所述S4中的分化培养基中包括0.5mg/L MS，0.5mg/L KT，0.5mg/LNAA，50g/L蔗糖以及

10g/L琼脂；

所述S5中的胚状体增殖培养基中包括0.5mg/LMS，0.5mg/L 2,4‑D，0.5mg/LNAA以及

0.2mg/L 6‑BA。

2.根据权利要求1所述的高羊茅组织培养和分化再生的方法，其特征在于，所述S2‑S5中培养温度为25‑30℃，光照强度为1500‑2000LX，光照时间为8‑12h/d，pH为5.8‑6.0，和

30g/L蔗糖。

3.根据权利要求1所述的高羊茅组织培养和分化再生的方法，其特征在于，所述S1中种子的消毒灭菌具体如下：50％硫酸振荡浸泡25min，无菌水漂洗去除分离的颖片和稃片，再用70％酒精消毒45s，无菌水漂洗3次，最后用30％次氯酸钠振荡灭菌20min，无菌水漂洗5次。

4.根据权利要求3所述的高羊茅组织培养和分化再生的方法高羊茅组织培养和遗传转化方法，其特征在于，所述30％次氯酸钠中有效氯含量大于5％。

说明书

一种高羊茅组织培养和分化再生的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种高羊茅组织培养和分化再生的方法。

背景技术

[0002] 高羊茅(Festuca elata Keng ex E.Alexeev)属禾本科羊茅亚属多年生草本植物，因其适应性强，抗逆性突出，耐践踏和抗病力强，且夏季不休眠等特性而成为适宜广泛推广和使用的草种，是冷季型园林绿化中不可或缺的构景草坪地被植物。

[0003] 高羊茅通过种子繁殖很困难，所以生产上往往采用分株繁殖，但分株繁殖不但繁殖系数很低，生长也很缓慢，还易引起种质严重衰退的现象，从而影响了高羊茅优良种质的快繁及推广应用。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种高羊茅组织培养和分化再生的方法，快速培养遗传背景一致、品质优良的高羊茅。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高羊茅组织培养和分化再生的方法，包括如下步骤：

[0006] S1、种子的消毒灭菌：去除分离颖片和稃片，采用70％酒精以及30％次氯酸钠对种子进行消毒灭菌；

[0007] S2、外植体胚性愈伤组织的诱导培养：纵切每粒种子，接种于愈伤组织诱导培养基上，于25℃环境下暗培养；

[0008] S3、愈伤诱导组织增殖培养：培养4周，选择饱满结实的胚性愈伤组织转接到继代培养基上，每3‑4周继代一次；

[0009] S4、胚性愈伤组织的分化培养及种苗幼胚的快速增殖：采用分化培养基对胚性愈伤组织进行培养得到胚状体，胚状体置于增殖培养基中光照培养；

[0010] S5、壮苗生根培养及无菌苗的移栽：采用胚状体培养基光照培养，将组培苗室内炼苗1‑2d之后移栽到穴盘中，适当遮荫，及时浇水，10‑20d即可成活；

[0011] 所述S2中愈伤组织诱导培养基中包括8mg/L MS，8mg/L 2,4‑D，2mg/LNAA，0.5g/L水解酪蛋白，50g/L蔗糖及7g/L琼脂；

[0012] 所述S4中的分化培养基中包括0.5mg/L MS，0.5mg/L KT，0.5mg/LNAA，50g/L蔗糖以及10g/L琼脂；

[0013] 所述S5中的胚状体增殖培养基中包括0.5mg/LMS，0.5mg/L 2,4‑D，0.5mg/LNAA及0.2mg/L 6‑BA。

[0014] 进一步地，所述S2‑S5中培养温度为25℃，光照强度为1500‑2000LX，光照时间为8‑12h/d，pH为5.8‑6.0，蔗糖30g/L。

[0015] 进一步地，所述S1中种子的消毒灭菌具体如下：50％硫酸振荡浸泡25min，无菌水漂洗去除分离的颖片和稃片，再用70％酒精消毒45s，无菌水漂洗3次，最后用30％次氯酸钠振荡灭菌20min，无菌水漂洗5次。

[0016] 进一步地，所述30％次氯酸钠中有效氯含量大于5％。

[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：操作简单，种子胚芽易形成胚性愈伤组织，进而通过转接在分化培养基上形成具有根、茎、叶的完整植株，形成的组培苗即可移栽成活。经过胚状体增殖培养，可在短短的2个月内大量地获得胚状体丛生芽或小植株，丛生芽或小植株只需在基本培养基中培养20天左右就可形成具有根茎叶的健壮种苗，且极易移栽成活，成活率高达100％。此项发明技术既解决了高羊茅繁殖困难，分株繁殖系数低，生长缓慢，良种种质衰退严重等问题，也有利于大规模工厂化生产良种，为生产上提供源源不断的整齐健壮的优良种苗及优良种苗的示范推广应用。

具体实施方式

[0018] 容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。

[0019] 一种高羊茅组织培养和分化再生的方法，具体包括如下步骤：

[0020] S1、种子的消毒灭菌:50％硫酸振荡浸泡25min，用无菌水漂洗去除分离的颖片和稃片等杂物，再用70％酒精消毒45s，无菌水漂洗3次，最后用30％次氯酸钠(有效氯>5％)，振荡灭菌20min，无菌水漂洗5次，用灭菌吸水纸擦干水分，准备接种。

[0021] S2、外植体胚性愈伤组织的诱导培养，确定获得胚性愈伤组织的最适2,4‑D培养基配方:将每粒种子进行纵切，接种于愈伤组织诱导培养基上，在25℃条件下暗培养；将无菌萌发的外植体接种到诱导胚性愈伤组织的培养基即为不同2,4‑D浓度梯度的配方:即8mg/L MS，8mg/L 2,4‑D，2mg/L，NAA，0.5g/L水解酪蛋白，50g/L蔗糖，7g/L琼脂粉，pH为5.8中，每瓶接种5个外植体，共接种10瓶，暗培养30天后，观察在2,4‑D不同浓度梯度下外植体胚性愈伤组织生长发育的状况，并统计胚性愈伤组织形成率。下表1为不同浓度的2,4‑D培养基配方及对胚性愈伤组织发育的影响，其中胚性愈伤组织形成率＝形成胚性愈伤组织的外植体/供试外植体*100％；

[0022] 表1不同浓度的2,4‑D培养基配方及对胚性愈伤组织发育的影响

[0023]

[0024] 由表1结果所表明：2,4‑D对胚性愈伤组织的形成影响很大，若2,4‑D浓度过低，则基本无胚性愈伤组织形成；2,4‑D浓度过高，愈伤组织生长过快过大，水渍化程度高，也不利于胚性愈伤组织的形成；所以2,4‑D浓度的高低对胚性愈伤组织的形成率及形成时间影响很大，过低过高都不利于胚性愈伤组织的发育成熟，实验结果表明，最适的2,4‑D浓度是表1中的组合5，即MS+2,4‑D 8mg/L+NAA2mg/L+0.5g/L水解酪蛋白，在此培养条件下所获得胚性愈伤组织发育中等正常大小，形成时间也短，总体缩短了生长发育时期，加快了组培快繁时间。

[0025] S3、愈伤诱导组织继代培养：培养4周，选择饱满结实的胚性愈伤组织转接到继代培养基上，以后每隔3‑4周继代一次。

[0026] S4、胚性愈伤组织的分化培养，确定最适的胚性愈伤组织的分化培养条件：将实施案例1所获得的愈伤组织转接到不同KT浓度梯度的分化培养配方：即0.5mg/L MS，0.5mg/L KT，0.5mg/LNAA，50g/L蔗糖，10g/琼脂粉，pH为5.8的培养基上，在1500‑2000LX光下培养12h/d，培养30天。观察在不同KT浓度梯度下胚性愈伤分化的情况，并统计胚性愈伤组织分化率。下表2为不同浓度的KT培养基配方及对胚性愈伤组织分化的影响。

[0027] 表2不同浓度的KT培养基配方及胚性愈伤组织分化情况

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[0030] 由表2可得，KT和NAA对胚性愈伤组织的分化影响不大，但对丛生芽的形成率及植株的健壮程度影响很大。KT过低不利于丛生芽的形成及植株的生长健壮及发育成熟。实验结果表明，最佳的KT浓度即组合6，即MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L。在此条件下，胚性愈伤组织即可分化出大量的丛生芽，又能生长出旺盛的生长健壮的完整植株。

[0031] S5、壮苗生根培养：将上述分化的丛生芽苗分成单株，剪去老根老叶转入壮苗生根培养基(即1/2MS+7％琼脂++20g白糖)，在1500‑2000LX光下培养12h/d，20天左右待种苗长成具有完整根茎叶的正常健壮植株进行移栽。

[0032] 无菌苗的移栽与成活:将上述生根的组培苗揭开瓶口的封口膜室内炼苗1‑2d,之后取出小苗，洗净根上附着的培养基，移栽到装有蛙石和泥炭土的混合基质的穴盘中，适当遮荫，并及时浇水，保持种苗处在湿润状态直到长出新根，15d左右统计成活率可达100％。

[0033] 本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。