LOC663462基因在防治害虫中的应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及LOC663462基因在害虫防治中的应用。本发明以LOC663462基因为靶标，设计dsRNA并注射入昆虫体内，观察对昆虫生殖和发育的影响，发现注射LOC663462 dsRNA后，昆虫体型变小，体长和体宽都有一定程度的减小；自交后产卵数和孵化率明显降低，并且LOC663462基因是通过影响卵黄原蛋白受体VgR的表达，影响VgR识别卵黄原蛋白，从而影响卵黄原蛋白进入卵子内参与卵子的成熟过程，这在影响昆虫生殖尤其是害虫生殖方面有重要的作用。

权利要求

1.LOC663462基因的应用，其特征在于，所述LOC663462基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述应用包括：调控昆虫滞育、制备调控昆虫滞育的产品、防治害虫或制备防治害虫的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述害虫为鞘翅目昆虫。

3.LOC663462基因作为制备特异性干扰有害昆虫基因表达或抑制有害昆虫生长的干扰分子的抑制靶标或沉默靶标的应用，其特征在于，所述LOC663462基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述干扰分子是LOC663462基因或其转录本为抑制靶标或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物，或者能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，合成所述dsRNA的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

6.一种防治有害昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括：下调有害昆虫体内LOC663462基因的表达或活性；其中，所述LOC663462基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述下调有害昆虫体内LOC663462基因的表达或活性的方法包括：在有害昆虫的基因组中敲除或沉默LOC663462基因；或将下调LOC663462基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入有害昆虫体内。

说明书

LOC663462基因在防治害虫中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及LOC663462基因在害虫防治中的应用。

背景技术

[0002] 赤拟谷盗(Tribolium castaneum)属鞘翅目拟步甲科，拟谷盗属，分布于世界热带与较温暖地区。赤拟谷盗食性复杂，多生活在干燥的环境中，具有寿命长、繁殖快、适应性广
等特点，是一种重要的世界性储粮害虫。除了直接为害外，赤拟谷盗成虫的体表上的臭腺还
能分泌含有致癌物质苯醌的臭液，使被害物发生腥霉臭气，导致变色发臭不能食用。

[0003] 赤拟谷盗是公认的鞘翅目昆虫中易于实验操作的代表性昆虫，也是一种在遗传进化和发育研究方面易于驾驭的模式昆虫。其完整的基因组测序表明，赤拟谷盗基因组包括
大约2亿个核苷酸，基因(或蛋白)数量大约有16000个。该基因组的全面分析，将对发现新的
药品和抗生素提供帮助，为抗性种类、杀虫剂药效及生物药剂控制农业昆虫和病菌等提供
帮助，最终为昆虫分子生态学、昆虫分类学和昆虫毒理学等各个学科的发展带来巨大的推
动作用。

[0004] RNAi指靶基因同源的双链RNA(dsRNA)引起该基因编码的mRNA降解，从而特异性抑制该基因的表达，RNAi具有高效性和特异性的特点，广泛存在于动、植物等各种生物体内。
赤拟谷盗是具有高效RNAi机制的昆虫，即将dsRNA注射到赤拟谷盗幼虫、蛹、成虫和胚胎的
任何时期，可使目的基因的表达受到抑制，而且此抑制效应还可以延续至其下一代。因此，
筛选出影响赤拟谷盗发育、存活等的关键标靶，对于加速RNAi技术在害虫防治方面有重要
意义。

发明内容

[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明人以LOC663462基因为靶标，设计dsRNA，将其注入赤拟谷盗体内，发现明显抑制赤拟谷盗的卵巢发育，产卵数
和孵化率显著减少，并且孵化后成虫的虫体明显偏小。表明LOC663462是影响赤拟谷盗的重
要靶标基因。

[0006] 本发明的技术方案如下文所示。

[0007] 本发明一方面提供了LOC663462的应用，其中，所述LOC663462基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述应用包括：调控昆虫滞育、制备调控昆虫滞育的产品、防治害虫或
制备防治害虫的产品。

[0008] 根据本发明的一些实施方式，所述害虫为鞘翅目昆虫，优选为赤拟谷盗。

[0009] 根据本发明的一些实施方式，所述昆虫为鞘翅目昆虫，优选为赤拟谷盗。

[0010] 本发明另一方面还提供了LOC663462基因作为制备特异性干扰有害昆虫基因表达或抑制有害昆虫生长的干扰分子的抑制靶标或沉默靶标的应用，其中，所述LOC663462基因
的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0011] 根据本发明的一些实施方式，所述干扰分子是LOC663462基因或其转录本为抑制靶标或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物，或者能表达或形成所述
dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

[0012] 根据本发明的一些实施方式，所述有害昆虫为鞘翅目昆虫，优选为赤拟谷盗。

[0013] 本发明另一方面还提供一种防治有害昆虫的方法，所述方法包括：下调有害昆虫体内LOC663462基因的表达或活性；其中，所述LOC663462基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
所示。

[0014] 根据本发明的一些实施方式，所述下调有害昆虫体内LOC663462基因的表达或活性的方法包括：在有害昆虫的基因组中敲除或沉默LOC663462基因；或将下调LOC663462基
因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入有害昆虫体内。

[0015] 根据本发明的一些实施方式，所述有害昆虫为鞘翅目昆虫，优选为赤拟谷盗。

[0016] 本发明又一方面还提供了一种用于抑制LOC663462基因表达的dsRNA，所述LOC663462基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0017] 根据本发明的一些实施方式，合成所述dsRNA的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

[0018] 本发明又一方面还提供了一种生物制品，包括如上所述的dsRNA。

[0019] 根据本发明的一些实施方式，所述生物制品为喷洒式制剂或饵剂。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] 本发明以LOC663462基因为靶标，设计dsRNA并注射入昆虫体内，观察对昆虫生殖和发育的影响，发现，注射LOC663462dsRNA后，昆虫体型变小，体长和体宽都有一定程度的
减小；自交后产卵数和孵化率明显降低，并且LOC663462基因是通过影响卵黄原蛋白受体
VgR的表达，影响VgR识别卵黄原蛋白，从而影响卵黄原蛋白进入卵子内参与卵子的成熟过
程，这在影响昆虫生殖尤其是害虫生殖方面有重要的作用。

附图说明

[0022] 图1为LOC663462基因在赤拟谷盗不同时期的表达情况图；

[0023] 图2为合成的dsRNA的电泳图；

[0024] 图3为注射dsRNA后LOC663462基因在不同时间的表达情况图；

[0025] 图4为注射dsRNA后赤拟谷盗成虫1h的表型图；

[0026] 图5为注射dsRNA后赤拟谷盗成虫1天的表型图；

[0027] 图6为注射dsRNA后赤拟谷盗成虫体长和体宽的统计结果图；

[0028] 图7为注射dsRNA后赤拟谷盗产卵数和孵化率统计图；

[0029] 图8为注射dsRNA后赤拟谷盗卵巢的变化图；

[0030] 图9为注射dsRNA后赤拟谷盗卵巢的另一种变化图；

[0031] 图10为注射dsRNA后卵子观察图；

[0032] 图11为注射dsRNA后单个卵子观察图；

[0033] 图12为注射dsRNA后成虫血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白含量图；

[0034] 图13为注射dsRNA后成虫卵巢内LOC663462、卵黄原蛋白受体表达量的变化情况图。

具体实施方式

[0035] 以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规
方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

[0036] 昆虫：来源于华南师范大学昆虫科学与技术研究所饲养的赤拟谷盗。

[0037] 试剂：RNA提取试剂TRIzol Reagent(ambion by life technologies，产品编号230011)、基因表达定量试剂iTaq Universal SYBR Green Supermix(BIO‑RAD，产品编号
1725121)、反转录试剂盒High‑Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase 
Inhibitor(applied biosystems by Thermo Fisher Scientific，产品编号00978080)、
dsRNA合成试剂盒HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit E2050S(New 
England Biolabs，产品编号10056893)。

[0038] 实验中，每批次实验分别对每个组30头虫子进行观察和统计。提RNA的材料则是每批次实验的每个时间点都有3个重复，收集3头虫子为一个样品。

[0039] 实施例1LOC663462基因在赤拟谷盗不同时期的表达情况

[0040] 用定量PCR在赤拟谷盗整虫中检测了LOC663462基因的表达情况，定量引物为：

[0041] F’：GCAGTTCAAGCGCAAAGACA(SEQ ID NO:4)，

[0042] R’：TTTCACCGGTTGAGAGACGG(SEQ ID NO:5)；

[0043] 内参基因为RP3，引物序列为：

[0044] F’：TCAAATTGATCGGAGGTTTG(SEQ ID NO:6)，

[0045] R’：GTCCCACGGCAACATAATCT(SEQ ID NO:7)；

[0046] 检测的时期包括卵期第1天(EggD1)、卵期第4天(EggD4)、幼虫期第18‑20天(L‑D18～20)、蛹期第1‑5天(P1～5)、成虫羽化后0.5‑1小时(Ad 0.5～1h)、成虫羽化后1天‑6天(Ad 
1～6)。

[0047] 如图1所示，为LOC663462基因在赤拟谷盗不同时期的表达情况图，可以看出，LOC663462基因在卵期和幼虫期表达量较低，在蛹期第一天有较高水平的表达，而蛹期2‑5
天则维持在中等水平的表达量，在成虫1天内表达量又有明显增加，至3天和6天时表达量下
降。

[0048] 实施例2 LOC663462基因dsRNA的合成及其干扰效率

[0049] 合成dsRNA的引物为：

[0050] F’：TAATACGACTCACTATAGGGATGGATACGATTGTGCAAGG(SEQ ID NO:2)，

[0051] R’：TAATACGACTCACTATAGGGCCGTTTCCTGGTCAGTTAT(SEQ ID NO:3)；

[0052] 如图2所示，为合成的dsRNA的电泳图；其中从左至右，第一泳道是marker，第二泳道为合成dsRNA所用的DNA模板，第三泳道为合成的dsRNA，其中dsRNA为500bp。

[0053] 以GFP的dsRNA为对照，合成GFP dsRNA的引物为：

[0054] F’：TAATACGACTCACTATAGGGTGGTCCCAATTCTCGTGGAAC(SEQ ID NO:8)，

[0055] R’：TAATACGACTCACTATAGGGCTTGAAGTTGACCTTGATGCC(SEQ ID NO:9)；

[0056] 根据LOC663462基因在赤拟谷盗不同时期的表达情况，选择在蛹期第二天进行dsRNA注射。分别给每头赤拟谷盗蛹注射200ng dsRNA，并在注射后0h、48h、72h、96h和120h
取材料检测LOC663462基因的表达量以检测RNA干扰效率。

[0057] 如图3所示，为注射dsRNA后LOC663462基因在不同时间的表达情况图，可以看出，在注射LOC663462 dsRNA 96小时后，LOC663462基因表达量与注射GFP dsRNA对照相比显著
降低。

[0058] 实施例3 LOC663462基因dsRNA对赤拟谷盗表型的影响

[0059] 在dsRNA注射96小时后，蛹羽化成成虫。

[0060] 观察羽化后1h的成虫，如图4所示，发现其外表与对照组无明显差异。

[0061] 观察羽化后1天的成虫，如图5所示，发现无论是雌虫还是雄虫，注射LOC663462 dsRNA的虫体其外表与对照组相比也无明显区别，只是肉眼可见体型比对照组略微减小。

[0062] 对羽化后1天的成虫的体长和体宽进行统计，结果如图6所示，可以看出，雄虫中，野生型(WT)和注射GFP dsRNA(dsGFP)的体型较为接近，注射LOC663462 dsRNA
(dsLOC663462)的成虫的体长和体宽均小于注射GFP dsRNA(dsGFP)的虫体，且具有统计学
差异；在雌虫中，野生型(WT)、注射GFP dsRNA(dsGFP)的成虫、注射LOC663462 dsRNA
(dsLOC663462)的成虫，三者体长和体宽均依次降低，但不存在统计学差异。

[0063] 实施例4LOC663462基因dsRNA对赤拟谷盗生殖情况的影响

[0064] 1、LOC663462基因dsRNA对赤拟谷盗产卵数和孵化率的影响

[0065] 观察并统计赤拟谷盗自交后产卵数和孵化率情况发现，结果如图7所示，可以看出，注射LOC663462 dsRNA(dsLOC663462)的虫子产卵数和孵化率都有显著减少。对照组
(dsGFP)平均每只虫子每日产卵8颗，注射LOC663462 dsRNA的平均每只虫子每日产卵1颗，
产卵数比对照组减少了约87.5％，对照组平均孵化率为82％，注射LOC663462 dsRNA的平均
孵化率为6％，孵化率也比对照组减少了约92％。

[0066] 2、LOC663462基因dsRNA对赤拟谷卵巢的影响

[0067] 解剖赤拟谷盗成虫第7天卵巢并进行观察，结果如图8和9所示，可以看出，对照组(dsGFP)的卵巢发育形态良好，卵管内可见不同发育时期的卵子，而注射LOC663462 dsRNA
(ds LOC663462)的虫子卵巢出现两种形态，一种是卵巢内含有较大量发育晚期的卵子，但
部分卵子外形呈现不规则形状(图8)，另一种则是卵巢明显变小，里面只含有少量在发育中
的卵子，且有单侧卵巢发育缓慢(图9)，两种类型卵巢的雌虫均只能产出极少量卵。

[0068] 3、LOC663462基因dsRNA对赤拟谷盗产卵数和孵化率的影响

[0069] 取出赤拟谷盗成虫第7天卵巢内的发育较成熟卵子并进行观察，如图10所示，可以看到，对照组(dsGFP)的卵子发育形态良好，呈长椭圆形，表面富有光泽，卵颜色均一，而注
射LOC663462 dsRNA(dsLOC663462)的成虫卵巢内的卵子呈现外表不规则的形态，比对照组
稍短稍圆，且卵壳部分透明，卵内颜色不均一。

[0070] 进一步观察单个卵子，如图11所示，可以发现对照组(dsGFP)的卵子表面可见规则纹路，而注射LOC663462 dsRNA(dsLOC663462)的卵子表面不可见纹路，卵壳部分透明，卵内
容物分布不均一。

[0071] 4、LOC663462基因dsRNA对赤拟谷盗卵黄蛋白原的影响

[0072] 通过上述结果，分析注射LOC663462 dsRNA(dsLOC663462)的成虫卵巢内卵子的卵黄蛋白积累应少于对照组(dsGFP)，由于赤拟谷盗在成虫1天卵巢开始发育，至5天卵巢成
熟。卵黄原蛋白由脂肪体合成而后分泌到血淋巴中，由血淋巴运送至卵巢内，被卵黄原蛋白
受体识别并吸收进卵巢内参与卵子的成熟过程。

[0073] 为研究LOC663462是否影响卵黄蛋白原的合成过程，分别取了对照组与注射LOC663462 dsRNA成虫的血淋巴，并进行了SDS‑PAGE分析，结果如图12所示，表明注射
LOC663462 dsRNA成虫的血淋巴中卵黄原蛋白含量比对照组多(图12A)，而注射LOC663462 
dsRNA的成虫5天和成虫7天卵巢内的卵黄原蛋白含量显著低于对照组(图12B)，表明注射
LOC663462 dsRNA后并未影响卵黄原蛋白的合成，而影响了卵巢内的卵黄原蛋白含量，导致
卵黄原蛋白在血淋巴中积累。

[0074] 5、LOC663462基因影响赤拟谷盗卵黄蛋白原的机制

[0075] 根据上述结果，推测LOC663462很有可能影响卵子的卵黄蛋白原的积累从而影响卵子的发育，为进一步研究LOC663462影响卵黄原蛋白进入卵子的机制，分别检测注射
dsRNA后成虫卵巢内LOC663462、卵黄原蛋白受体(VgR)的表达量，结果如图13所示，发现，在
注射LOC663462 dsRNA成虫卵巢内，LOC663462(图13A)、VgR(图13B)的表达量都显著低于对
照组，表明LOC663462通过影响卵黄原蛋白受体VgR的表达，影响VgR识别卵黄原蛋白，从而
影响卵黄原蛋白进入卵子内参与卵子的成熟过程，这在影响昆虫生殖尤其是害虫生殖方面
有重要的作用。

[0076] 尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变
化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文
引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。