一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂转让专利
申请号 : CN201910947763.X
文献号 : CN112618698B
文献日 : 2021-10-08
发明人 : 白义 , 孟艳敏 , 孙宇石
申请人 : 北京东方百泰生物科技股份有限公司
摘要 :
本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，该制剂包括人白细胞介素10‑Fc融合蛋白、缓冲盐、蛋白保护剂、等渗透调节剂、非离子型表面活性剂；其中，制剂的pH值为5.0‑6.0。本发明提供的注射制剂具有稳定性更好、制备工艺简单、成本低廉、无需特殊设备和苛刻条件、易于规模化生产等优点；本发明制剂中的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白通过连接肽将人白细胞介素10与免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成，延长了人白细胞介素10在生物体内的半衰期，增加了人白细胞介素10在体内的稳定性，有利于其在疾病治疗中的应用。
权利要求 :
1.一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述制剂包括以下含量的成分：
a)蛋白含量为2‑30mg/ml的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白；
b)浓度为20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐；
c)3％(w/v)的甘露醇；
d)浓度为50mM的氯化钠溶液；
e)0.01％(w/v)的吐温20；
其中，所述制剂的pH值为5.5；
所述人白细胞介素10‑Fc融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，所述Fc片段为人IgG1的Fc部分；
所述人白细胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
所述连接肽通式为[GlyGlyGlyGlyX]n；
所述X为Ser；所述n为6；
所述Fc片段的氨基酸序列为SEQ ID No:2。
2.如权利要求1所述的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，其特征在于，所述人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的含量为2‑15mg/ml。
3.一种权利要求1或2所述的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂用于制备治疗免疫疾病和癌症药物中的应用。
说明书 :
一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂。
背景技术
[0002] 白细胞介素‑10(IL‑10)是1989年被发现的一种细胞因子，自从其被发现以后，很多研究深入剖析了这个细胞因子的生物学特性。人类IL‑10是一个35KD的二聚体，由两个单
体通过非共价键形式结合，在单体内有两个二硫键来维持因子的结构和生物学活性，在连
接其2个单体亚基的非共价相互作用破坏后成为生物学上失活的。
体通过非共价键形式结合，在单体内有两个二硫键来维持因子的结构和生物学活性，在连
接其2个单体亚基的非共价相互作用破坏后成为生物学上失活的。
[0003] IL‑10是一种多细胞源(巨噬细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞及肥大细胞等均可表达)、多功能、多向性的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免
疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。IL‑10可通过抑制活化的单核细胞和活化的巨
噬细胞的IL‑1、IL‑6、IL‑8、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、粒细胞集落刺激因子
(G‑CSF)、肿瘤坏死因子(TNF‑α)的表达来抑制免疫应答；IL‑10可抑制TH1淋巴细胞产生的
细胞因子如IL‑2及IFN‑γ的合成，抑制TH2淋巴细胞产生IL‑4和IL‑5；同时近年来研究发现
Treg细胞和IL‑10的免疫抑制作用有关，肿瘤相关的CD4+Treg细胞和CD8+Treg细胞均可以
产生IL‑10并抑制肿瘤相关抗原特异性T细胞的免疫应答。由此看见，IL‑10可以通过多种细
胞发挥免疫抑制作用，诱导肿瘤免疫逃逸。
疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。IL‑10可通过抑制活化的单核细胞和活化的巨
噬细胞的IL‑1、IL‑6、IL‑8、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、粒细胞集落刺激因子
(G‑CSF)、肿瘤坏死因子(TNF‑α)的表达来抑制免疫应答；IL‑10可抑制TH1淋巴细胞产生的
细胞因子如IL‑2及IFN‑γ的合成，抑制TH2淋巴细胞产生IL‑4和IL‑5；同时近年来研究发现
Treg细胞和IL‑10的免疫抑制作用有关，肿瘤相关的CD4+Treg细胞和CD8+Treg细胞均可以
产生IL‑10并抑制肿瘤相关抗原特异性T细胞的免疫应答。由此看见，IL‑10可以通过多种细
胞发挥免疫抑制作用，诱导肿瘤免疫逃逸。
[0004] 多年来，人们对IL‑10的认识主要集中在免疫抑制方面，而忽视了它的免疫刺激作用，尤其是它对胸腺细胞、B细胞和肥大细胞的活化作用。近年来，不断有研究表明IL‑10的
免疫活化作用对于肿瘤的抑制起到了至关重要的作用，研究表明聚乙二醇化IL‑10对移植
瘤有排斥作用，并可提高颗粒酶B和IFN‑γ的表达。IL‑10不仅可以通过提高NK细胞的细胞
毒性活性增强肿瘤杀伤效应，还可以通过介导肿瘤内特异性细胞毒性CD8+T细胞的浸润和
激活、IFN‑γ和颗粒蛋白酶的表达和增强肿瘤抗原提呈等而提高瘤内CD8+T细胞的肿瘤杀
伤能力和IFN‑γ诱导的抗原提呈能力，从而提高机体的肿瘤杀伤效应。
免疫活化作用对于肿瘤的抑制起到了至关重要的作用，研究表明聚乙二醇化IL‑10对移植
瘤有排斥作用，并可提高颗粒酶B和IFN‑γ的表达。IL‑10不仅可以通过提高NK细胞的细胞
毒性活性增强肿瘤杀伤效应，还可以通过介导肿瘤内特异性细胞毒性CD8+T细胞的浸润和
激活、IFN‑γ和颗粒蛋白酶的表达和增强肿瘤抗原提呈等而提高瘤内CD8+T细胞的肿瘤杀
伤能力和IFN‑γ诱导的抗原提呈能力，从而提高机体的肿瘤杀伤效应。
[0005] 作为一种多功能的细胞因子，IL‑10已与众多疾病、病症和病状包括炎性病状、免疫相关疾病及癌症关联。IL‑10的双向免疫调控作用为肿瘤免疫治疗提供了新的思路与方
向。但重组人IL‑10在体内半衰期只有2个小时，很快会被清除，这将严重影响了其在疾病治
疗中的应用，为了克服重组人IL‑10半衰期短的问题，目前有些研究机构采用PEG化修饰方
法延长其在体内的半衰期，但是PEG化修饰位点较多，人IL‑10经过PEG化修饰后产物不均
一，这给生产工艺和质量控制带来了很大的难度。同时，还有一些研究者开始研究人白细胞
介素10‑Fc融合蛋白，但是人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的结构设计及合适的用药剂量、生
产工艺和质量控制都将面临巨大的挑战，目前为止，还没有人IL‑10‑Fc融合蛋白处于临床
开发阶段。
向。但重组人IL‑10在体内半衰期只有2个小时，很快会被清除，这将严重影响了其在疾病治
疗中的应用，为了克服重组人IL‑10半衰期短的问题，目前有些研究机构采用PEG化修饰方
法延长其在体内的半衰期，但是PEG化修饰位点较多，人IL‑10经过PEG化修饰后产物不均
一，这给生产工艺和质量控制带来了很大的难度。同时，还有一些研究者开始研究人白细胞
介素10‑Fc融合蛋白，但是人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的结构设计及合适的用药剂量、生
产工艺和质量控制都将面临巨大的挑战，目前为止，还没有人IL‑10‑Fc融合蛋白处于临床
开发阶段。
[0006] 此外，和大多数蛋白分子一样，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白具有不稳定性，会经历多种化学和物理降解，尤其是人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的高级结构非常脆弱，在运
输、保存和使用过程中很容易发生构象变化，如变性、聚集和沉淀，这些降解及聚集的产物
会对生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，
轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡。为此，急需开发一种不仅能够在
生产中得到高纯度的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白产品，而且能够保证融合蛋白在运输、储
存和使用过程中保持结构长期稳定性的注射制剂。
输、保存和使用过程中很容易发生构象变化，如变性、聚集和沉淀，这些降解及聚集的产物
会对生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，
轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡。为此，急需开发一种不仅能够在
生产中得到高纯度的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白产品，而且能够保证融合蛋白在运输、储
存和使用过程中保持结构长期稳定性的注射制剂。
发明内容
[0007] 为了解决现有技术中存在的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白具有不稳定性，会经历多种化学和物理降解，尤其是人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的高级结构非常脆弱，在运输、
保存和使用过程中很容易发生构象变化，如变性、聚集和沉淀，这些降解及聚集的产物会对
生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者
会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡等问题，本发明通过特殊的结构设计
和辅料选择提供了一种能够有效保证人白细胞介素10‑Fc融合蛋白稳定性的注射制剂。
保存和使用过程中很容易发生构象变化，如变性、聚集和沉淀，这些降解及聚集的产物会对
生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者
会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡等问题，本发明通过特殊的结构设计
和辅料选择提供了一种能够有效保证人白细胞介素10‑Fc融合蛋白稳定性的注射制剂。
[0008] 本发明具体技术方案如下：
[0009] 本发明提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，所述制剂包括以下含量的成分：
[0010] a)蛋白含量为2‑30mg/ml的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白；
[0011] b)浓度为5‑100mM的缓冲盐；
[0012] c)3％‑10％(w/v)的蛋白保护剂；
[0013] d)浓度为0‑100mM的等渗透调节剂；
[0014] e)0.005％‑0.02％(w/v)的非离子型表面活性剂；
[0015] 其中，所述制剂的pH值为5.0－6.0。
[0016] 本发明提供的注射制剂专门适用于人白细胞介素10‑Fc融合蛋白，制剂中通过缓冲盐、蛋白保护剂、等渗透调节剂、非离子型表面活性剂的协同配比，并调节制剂的pH值为
5.0－6.0，为人白细胞介素10‑Fc融合蛋白提供了适宜的储存环境，能够避免融合蛋白在运
输和存储过程中变性、聚集和沉淀，从而能够保证蛋白纯度，提高蛋白制剂的稳定性。
5.0－6.0，为人白细胞介素10‑Fc融合蛋白提供了适宜的储存环境，能够避免融合蛋白在运
输和存储过程中变性、聚集和沉淀，从而能够保证蛋白纯度，提高蛋白制剂的稳定性。
[0017] 进一步的，所述人白细胞介素10‑Fc融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，所述Fc片段选自人IgG1、IgG2或IgG4中的一种；
[0018] 所述人白细胞介素10的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
[0019] 优选的，所述人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的含量为2‑15mg/ml。
[0020] 本发明的制剂中提供的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白将人白细胞介素10与免疫球蛋白Fc融合，不仅保留了人白细胞介素10的生物学活性，而且能够通过免疫球蛋白Fc有效
延长了半衰期，克服了人白细胞介素10半衰期短的缺陷，免疫球蛋白Fc片段选自人IgG1、
IgG2或IgG4，其中IgG2和IgG4使用野生型序列，IgG2和IgG4亚型的ADCC作用和CDC作用相对
较弱，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白并不需要ADCC和CDC作用，相反，ADCC和CDC作用会带来
一些不必要的副作用，因此IgG2和IgG4使用野生型氨基酸序列；此外，本发明通过连接肽与
免疫球蛋白IgG的Fc连接，不仅保证大分子融合蛋白的稳定性，而且能够保证得到唯一的融
合蛋白产物，便于生产和质量控制。
延长了半衰期，克服了人白细胞介素10半衰期短的缺陷，免疫球蛋白Fc片段选自人IgG1、
IgG2或IgG4，其中IgG2和IgG4使用野生型序列，IgG2和IgG4亚型的ADCC作用和CDC作用相对
较弱，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白并不需要ADCC和CDC作用，相反，ADCC和CDC作用会带来
一些不必要的副作用，因此IgG2和IgG4使用野生型氨基酸序列；此外，本发明通过连接肽与
免疫球蛋白IgG的Fc连接，不仅保证大分子融合蛋白的稳定性，而且能够保证得到唯一的融
合蛋白产物，便于生产和质量控制。
[0021] 进一步的，所述Fc片段为人IgG1的Fc部分，所述Fc片段的氨基酸序列选自SEQ ID No:2或SEQ ID No:3。
[0022] 进一步的，所述连接肽通式为[GlyGlyGlyGlyX]n；
[0023] 其中，所述X为Ser或Ala，所述n为1‑6的整数。
[0024] 优选的，所述X优选Ser；所述n为6。
[0025] 连接肽的结构设计能够保证药物分子结构的稳定性。
[0026] 进一步的，所述缓冲盐包括L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐、乙酸‑乙酸钠或柠檬酸‑柠檬酸钠中的一种或多种组合；
[0027] 优选的，所述缓冲盐在所述制剂中的含量为10‑20mM；
[0028] 优选的，所述制剂的pH值为5.5‑6.0。
[0029] 本发明通过大量实验筛选了适用于人白细胞介素10‑Fc融合蛋白药物分子的缓冲盐，有效保证了药物分子的稳定性，避免分子变性、聚集或沉淀，保证了药物分子的纯度。
[0030] 进一步的，所述蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的一种或几种组合；
[0031] 优选的，所述蛋白保护剂为甘露醇。
[0032] 蛋白保护剂用于为药物分子提供了营养成分，为人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的长期保存提供了良好的环境。
[0033] 进一步的，所述等渗透调节剂为氯化钠溶液；
[0034] 优选的，所述等渗透调节剂在所述制剂中的含量为50‑100mM。
[0035] 特定含量范围的等渗透调节剂能够为人白细胞介素10‑Fc融合蛋白提供适宜的渗透压，保证了融合蛋白药物分子的长期稳定性。
[0036] 进一步的，所述非离子型表面活性剂包括吐温20、吐温80或泊洛沙姆中的一种或组合；
[0037] 优选的，所述非离子型表面活性剂在所述制剂中的含量为0.01％‑0.02％(w/v)。
[0038] 本发明通过大量实验验证，非离子表面活性剂在含量范围为0.01％‑0.02％(w/v)内能够满足制剂需求，非离子型表面活性剂含量太低起不到分散作用，含量太高可能产生
副作用，影响制剂输注的安全性。
副作用，影响制剂输注的安全性。
[0039] 本发明还提供了一种所述的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂用于制备治疗免疫疾病和癌症药物中的应用。
[0040] 本发明的有益效果如下：本发明提供的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂通过大量实验筛选不同制剂辅料，为人白细胞介素10‑Fc融合蛋白提供适宜的存储环境，该
制剂具有稳定性更好、制备工艺简单、成本低廉、无需特殊设备和苛刻条件、易于规模化生
产等优点，具有极强的实用价值；此外，本发明制剂中的药效成分人白细胞介素10‑Fc融合
蛋白通过连接肽将人白细胞介素10与免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成，在保留了人白细
胞介素10生物活性的同时，延长了人白细胞介素10在生物体内的半衰期，增加了人白细胞
介素10在体内的稳定性，有利于其在疾病治疗中的应用，其次，从纯化工艺和生产角度而
言，本发明采用基因工程技术进行人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的制备，提高了大分子融合
蛋白的稳定性，产品均一性较好，克服了IL‑10PEG化带来的生产工艺和质量控制的麻烦。
制剂具有稳定性更好、制备工艺简单、成本低廉、无需特殊设备和苛刻条件、易于规模化生
产等优点，具有极强的实用价值；此外，本发明制剂中的药效成分人白细胞介素10‑Fc融合
蛋白通过连接肽将人白细胞介素10与免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成，在保留了人白细
胞介素10生物活性的同时，延长了人白细胞介素10在生物体内的半衰期，增加了人白细胞
介素10在体内的稳定性，有利于其在疾病治疗中的应用，其次，从纯化工艺和生产角度而
言，本发明采用基因工程技术进行人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的制备，提高了大分子融合
蛋白的稳定性，产品均一性较好，克服了IL‑10PEG化带来的生产工艺和质量控制的麻烦。
附图说明
[0041] 图1为本发明人白细胞介素10‑Fc融合蛋白分子结构示意图；
[0042] 图2为本发明人白细胞介素10‑Fc融合蛋白表达载体结构示意图；
[0043] 图3为本发明人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0044] 图4为本发明人白细胞介素10‑Fc融合蛋白刺激小鼠肥大细胞MC/9增殖；
[0045] 图5为本发明人白细胞介素10‑Fc融合蛋白对SK‑BR‑3肿瘤细胞的杀伤；
[0046] 图6为本发明人白细胞介素10‑Fc融合蛋白在小鼠H1975肿瘤模型中的药效作用。
具体实施方式
[0047] 下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
[0048] 实施例1‑8
[0049] 本发明实施例1‑8提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，制剂包括以下含量的成分：
[0050] a)蛋白含量为2‑30mg/ml的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白；
[0051] b)浓度为5‑100mM的缓冲盐；
[0052] c)3％‑10％(w/v)的蛋白保护剂；
[0053] d)浓度为0‑100mM的等渗透调节剂；
[0054] e)0.005％‑0.02％(w/v)的非离子型表面活性剂；
[0055] 其中，制剂的pH值为5.0－6.0；
[0056] 人白细胞介素10‑Fc融合蛋白是由人白细胞介素10通过连接肽与免疫球蛋白IgG的Fc片段融合而成；其中，Fc片段选自人IgG1、IgG2或IgG4中的一种；人白细胞介素10的氨
基酸序列如SEQ ID No:1所示。连接肽通式为[GlyGlyGlyGlyX]n；
基酸序列如SEQ ID No:1所示。连接肽通式为[GlyGlyGlyGlyX]n；
[0057] 其中，X为Ser或Ala，n为1‑6的整数。
[0058] 人白细胞介素10‑Fc融合蛋白分子构型图如图1所示。
[0059] 实施例1‑8提供的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂具体成分如下表1所示：
[0060] 表1实施例1‑8注射制剂成分表
[0061]
[0062] 其中，SEQ ID No:1(实施例1‑8中人白细胞介素10的氨基酸序列)；
[0063] SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKG YLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSK AVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSE
FDIFINYIEAYMTMKIRN。
FDIFINYIEAYMTMKIRN。
[0064] SEQ ID No:2(实施例1和3中人IgG1的Fc部分氨基酸序列)；
[0065] DKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK。
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK。
[0066] SEQ ID No:3(实施例2中人IgG1的Fc部分氨基酸序列)；
[0067] EPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK。
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK。
[0068] SEQ ID No:4(实施例1、2、4和7中连接肽Linker的氨基酸序列)；
[0069] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
[0070] SEQ ID No:5(实施例4、5和6中人IgG2的Fc部分氨基酸序列)；
[0071] ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK。
SLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK。
[0072] SEQ ID No:6(实施例7和8中人IgG4的Fc部分氨基酸序列)；
[0073] ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSLGK。
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSLGK。
[0074] SEQ ID No:7(实施例5中连接肽Linker的氨基酸序列)；
[0075] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
[0076] SEQ ID No:8(实施例8中连接肽Linker的氨基酸序列)；
[0077] GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA。
[0078] SEQ ID No:9(实施例3中连接肽Linker的氨基酸序列)；
[0079] GGGGSGGGGSGGGGS。
[0080] SEQ ID No:10(实施例6中连接肽Linker的氨基酸序列)；
[0081] GGGGAGGGGAGGGGA。
[0082] 实施例9
[0083] 本发明实施例9提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，该注射制剂在实施例1‑8的基础上优选的限定了人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的蛋白含量为2‑15mg/
ml。
ml。
[0084] 实施例10
[0085] 本发明实施例10提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，该注射制剂在实施例1‑8的基础上优选的限定了缓冲盐在制剂中的含量为10‑20mM。
[0086] 实施例11
[0087] 本发明实施例11提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，该注射制剂在实施例1‑8的基础上优选的限定了制剂的pH值为5.5‑6.0。
[0088] 实施例12
[0089] 本发明实施例12提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，该注射制剂在实施例1‑8的基础上优选的限定了蛋白保护剂为甘露醇。
[0090] 实施例13
[0091] 本发明实施例13提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，该注射制剂在实施例1‑8的基础上优选的限定了等渗透调节剂在制剂中的含量为50‑100mM。
[0092] 实施例14
[0093] 本发明实施例14提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂，该注射制剂在实施例1‑8的基础上优选的限定了非离子型表面活性剂在制剂中的含量为0.01％‑
0.02％(w/v)。
0.02％(w/v)。
[0094] 实施例15
[0095] 本发明实施例15还提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂用于制备治疗免疫疾病和癌症药物中的应用。本发明这里所说的疾病包括免疫疾病和癌症等，免疫
疾病包括但不限于多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、克罗恩病等；癌症包括但不限于
胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤。
疾病包括但不限于多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、克罗恩病等；癌症包括但不限于
胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤。
[0096] 实验1、人白细胞介素10和人白细胞介素10‑Fc融合蛋白表达载体的构建
[0097] 按照实施例1‑8并参考如图1所示的分子构型示意图，选择pTSE作为表达载体，基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因合成时，在合成基因两侧分别引入EcoRl、
BamHI酶切位点，然后对pTSE表达载体和合成的抗体基因均进行EcoRl、BamHI双酶切，并将
pTSE表达载体和抗体基因的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的片段回收，最后将回收的
目的片段分别连接到pTSE表达载体中，转化到TOP感受态细胞(汇天东方，货号HT702‑03)，
测序正确后得到基因表达载体(如图2所示)，质粒分别命名为：r1L‑10、IL‑10‑Fc‑A、IL‑10‑
Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑10‑Fc‑H。
BamHI酶切位点，然后对pTSE表达载体和合成的抗体基因均进行EcoRl、BamHI双酶切，并将
pTSE表达载体和抗体基因的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳和目的片段回收，最后将回收的
目的片段分别连接到pTSE表达载体中，转化到TOP感受态细胞(汇天东方，货号HT702‑03)，
测序正确后得到基因表达载体(如图2所示)，质粒分别命名为：r1L‑10、IL‑10‑Fc‑A、IL‑10‑
Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑10‑Fc‑H。
[0098] 实验2、人白细胞介素10和人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的表达和纯化
[0099] 1)、人白细胞介素10和人白细胞介素10‑Fc融合蛋白表达质粒的获得。
[0100] 利用无内毒素大提试剂盒(购买于康为世纪生物科技有限公司，CW2104)进行质粒大提，具体操作步骤如下：
[0101] (1)取200μl活化的菌液置于500ml摇瓶(含200ml amp+的LB培养基)中，37℃，220rpm摇床过夜培养；
[0102] (2)取200ml过夜培养的菌液，加入离心管中，在7000rpm下离心5分钟收集细菌，尽量除尽全部上清；
[0103] (3)向留有菌体沉淀的离心管中加入12.5ml Buffer P 1(已加入RNase A)，使用涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀；
[0104] (4)向离心管中加入12.5ml Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8‑10次，使菌体充分裂解，室温放置3‑5分钟，待溶液应变得清亮粘稠；
[0105] (5)向离心管中加入12.5ml Buffer E3，立即上下颠倒混匀8‑10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟；在7000rpm下离心15分钟，将上清全部倒入除内毒素过滤器
(Endo‑Remover FQ)中，慢慢推动推柄(Plungers)过滤，滤液收集在干净的50ml离心管(自
备)中；
(Endo‑Remover FQ)中，慢慢推动推柄(Plungers)过滤，滤液收集在干净的50ml离心管(自
备)中；
[0106] (6)向滤液中加入10ml、0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀；
[0107] (7)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱(Spin Columns DQ)中加入2ml Buffer PS，在7000rpm下离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0108] (8)将步骤6中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱(已装入收集管)中；
[0109] (9)在7000rpm下离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0110] (10)向吸附柱中加入10ml Buffer PW(已加入无水乙醇)，在7000rpm下离心2分钟，倒掉收集管中的废液；
[0111] (11)重复步骤(10)一次；
[0112] (12)将吸附柱重新放回收集管中，7000rpm离心5分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液；
[0113] (13)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入1ml无内毒素用水，室温放置2‑5分钟，在7000rpm下离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中；测定浓度后，
于‑20℃保存质粒。
于‑20℃保存质粒。
[0114] 2)、人白细胞介素10和人白细胞介素10‑Fc融合蛋白表达质粒的瞬时转染。
[0115] 人胚肾细胞(HEK293ES悬浮细胞)在FreeStyle 293Expression Medium(Gibco)中6
培养，细胞每隔一到两天传代一次，传代后细胞起始密度维持在0.2‑0.6×10个/ml，细胞
培养体积为摇瓶容积的15‑35％，细胞培养瓶放在摇床(摇床转速:135rpm，温度:37℃，CO2:
5％)中培养。转染前一天，将处于对数生长期，生长状态良好的HEK293ES细胞，传代到细胞
6
密度为0.5×10个/ml，放置摇床(135rpm，37℃，5％CO2)培养过夜，待第二天进行转染。
培养，细胞每隔一到两天传代一次，传代后细胞起始密度维持在0.2‑0.6×10个/ml，细胞
培养体积为摇瓶容积的15‑35％，细胞培养瓶放在摇床(摇床转速:135rpm，温度:37℃，CO2:
5％)中培养。转染前一天，将处于对数生长期，生长状态良好的HEK293ES细胞，传代到细胞
6
密度为0.5×10个/ml，放置摇床(135rpm，37℃，5％CO2)培养过夜，待第二天进行转染。
[0116] 转染前将准备好的1×106个/ml细胞悬液在摇床(135rpm，39℃，5％CO2)培养2h，转染时，依次加入上述步骤1)得到的9种质粒(终浓度1μg/ml)、聚乙烯亚胺PEI(终浓度2μg/
ml)，混匀，一起共转染到HEK293ES悬浮细胞中，之后，置于摇床(135rpm，39℃，5％CO2)培养
40min。转染后的细胞继续在135rpm，37℃，5％CO2摇床中培养，表达人白细胞介素10和人白
细胞介素10‑Fc融合蛋白。转染96小时后离心收获上清液体。
ml)，混匀，一起共转染到HEK293ES悬浮细胞中，之后，置于摇床(135rpm，39℃，5％CO2)培养
40min。转染后的细胞继续在135rpm，37℃，5％CO2摇床中培养，表达人白细胞介素10和人白
细胞介素10‑Fc融合蛋白。转染96小时后离心收获上清液体。
[0117] 3)、人白细胞介素10和人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的纯化。
[0118] 人白细胞介素10的纯化：上清液体用0.22uM滤膜过滤，利用Ni柱从表达上清中获得带有His标签结构域的人白细胞介素10。平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为50mM Tris‑
Hcl、0.5M NaCl、20mM咪唑、PH7.6和50mM Tris‑Hcl、0.5M NaCl、0.5M咪唑、pH7.6。设置梯度
洗脱条件：100％洗脱液，30min，5ml/min流速梯度洗脱，根据咪唑不同浓度变化，收集UV280
检测到的蛋白峰，标记好收峰位置，用PBS缓冲液进行换液浓缩。
Hcl、0.5M NaCl、20mM咪唑、PH7.6和50mM Tris‑Hcl、0.5M NaCl、0.5M咪唑、pH7.6。设置梯度
洗脱条件：100％洗脱液，30min，5ml/min流速梯度洗脱，根据咪唑不同浓度变化，收集UV280
检测到的蛋白峰，标记好收峰位置，用PBS缓冲液进行换液浓缩。
[0119] 人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的纯化：上清液体用0.22uM滤膜过滤，利用HiTrap rProtein A亲和层析柱从表达上清中获得带有Fc结构域的融合蛋白。平衡缓冲液和洗脱缓
冲液分别为50mM Tris‑Hcl、0.15M Nacl、pH 7.0和0.1M柠檬酸‑柠檬酸钠、pH 3.0。通过阳
离子交换柱HiTrap‑SPFF获得目标抗体，最后用PBS缓冲液进行换液浓缩，得到纯化后的人
白细胞介素10和人白细胞介素10‑Fc融合蛋白，如图3所示，从左侧到右侧依次为蛋白质分
子量Marker、rIL‑10、IL‑10‑Fc‑A、IL‑10‑Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑
10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑10‑Fc‑H，每条带的分子量大小与理论一致。
冲液分别为50mM Tris‑Hcl、0.15M Nacl、pH 7.0和0.1M柠檬酸‑柠檬酸钠、pH 3.0。通过阳
离子交换柱HiTrap‑SPFF获得目标抗体，最后用PBS缓冲液进行换液浓缩，得到纯化后的人
白细胞介素10和人白细胞介素10‑Fc融合蛋白，如图3所示，从左侧到右侧依次为蛋白质分
子量Marker、rIL‑10、IL‑10‑Fc‑A、IL‑10‑Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑
10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑10‑Fc‑H，每条带的分子量大小与理论一致。
[0120] 实验3、人白细胞介素10‑Fc融合蛋白刺激小鼠肥大细胞MC/9增殖
[0121] 1、实验细胞
[0122] 名称：小鼠肥大细胞MC/9
[0123] 细胞培养基：RPMI1640(Gibico，A10491‑01)+10％FBS(VisTech，SE200‑ES)
[0124] 来源：上海子实生物科技有限公司
[0125] 细胞特性：该细胞表达内源性鼠白细胞介素10(IL‑10)受体(R1和R2)，在小鼠白细胞介素4(IL‑4)(mIL‑4)存在的情况下，IL‑10可刺激MC/9小鼠肥大细胞株增殖。而单一的
mIL‑4或hIL‑10则仅有很低的增殖刺激活性。
mIL‑4或hIL‑10则仅有很低的增殖刺激活性。
[0126] 2、细胞铺板及加药
[0127] 取对数生长期的MC/9细胞用空白1640培养基洗涤2次，悬于20％FCS‑1640培养液，5 4
并调制浓度为2×10个/ml，加入96孔板，1×10个/孔，设置对照组和实验组，分别给药，具
体给药情况如下表2所示。
并调制浓度为2×10个/ml，加入96孔板，1×10个/孔，设置对照组和实验组，分别给药，具
体给药情况如下表2所示。
[0128] 表2刺激小鼠肥大细胞MC/9增殖设置对照组和实验组情况
[0129]
[0130] 37℃，5％CO2培养箱中培养72小时后，加入CCK‑8检测液，37℃孵育2‑4小时后在450nm处检测OD值。
[0131] 实验结果如图4所示，通过细胞增殖情况得知，本发明提供的融合蛋白IL‑10‑Fc‑A、IL‑10‑Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑10‑Fc‑
H保留了人白细胞介素10生物活性，不同类型的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白均能刺激小鼠
肥大细胞MC/9的增值，通过小鼠白细胞介素4(IL‑4)共刺激，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白
能够显著刺激细胞增殖显著。
H保留了人白细胞介素10生物活性，不同类型的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白均能刺激小鼠
肥大细胞MC/9的增值，通过小鼠白细胞介素4(IL‑4)共刺激，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白
能够显著刺激细胞增殖显著。
[0132] 实验4、人白细胞介素10‑Fc融合蛋白对SK‑BR‑3肿瘤细胞体外杀伤作用
[0133] 1、靶细胞
[0134] 名称：人乳腺癌细胞SK‑BR‑3
[0135] 维持培养基：RPMI1640(Gibico，A10491‑01)+10％FBS(VisTech，SE200‑ES)
[0136] 实验培养基：RPMI1640(Gibico，A10491‑01)+10％灭活FBS(VisTech，SE200‑ES)
[0137] 来源：ATCC
[0138] 2、靶细胞铺板及血清灭活
[0139] 提前一天将SK‑BR‑3细胞消化后，维持培养基重悬计数，铺于平底96孔板中，5×3
10个/100μl/孔，过夜培养，待细胞贴壁。
10个/100μl/孔，过夜培养，待细胞贴壁。
[0140] 取一管完全融化的FBS，置于60℃水浴锅中，作用40min，即获得灭活血清。
[0141] 3、效应细胞——人单个核细胞(PBMC)分离
[0142] 在50ml管中加入20ml单个核细胞分离液；用全血稀释液将采集到的血液按1:1比例进行稀释处理，混匀后沿康宁管内壁匀速缓慢的铺至分离液上层，每管内加入稀释后全
血体积为20ml；待各管加液完毕后放入提前预冷至22℃的离心机内，600g水平离心15min
(加减速设置为1)；离心完成后取出离心管，用移液器小心吸取置于分离液和血清间呈圆弧
状分布的细胞层—单个核细胞(PBMC)，置于新的50ml管中；按照1:5比例在细胞液中加入细
胞洗涤液，充分混匀后离心，弃上清，再重复洗涤一次，收集细胞沉淀，用RPMI‑1640培养基
6
重悬；将单个核细胞(PBMC)调整细胞数目为2.5×10个/ml；
血体积为20ml；待各管加液完毕后放入提前预冷至22℃的离心机内，600g水平离心15min
(加减速设置为1)；离心完成后取出离心管，用移液器小心吸取置于分离液和血清间呈圆弧
状分布的细胞层—单个核细胞(PBMC)，置于新的50ml管中；按照1:5比例在细胞液中加入细
胞洗涤液，充分混匀后离心，弃上清，再重复洗涤一次，收集细胞沉淀，用RPMI‑1640培养基
6
重悬；将单个核细胞(PBMC)调整细胞数目为2.5×10个/ml；
[0143] 4、药物稀释及铺板加药
[0144] 将实施例2中得到的8种药物分子(IL‑10‑Fc‑A、IL‑10‑Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑10‑Fc‑H)用实验培养基稀释，使其作用终
浓度为200μg/ml，设置3个复孔。将96孔板内的生长培养基弃去，灭菌PBS轻柔洗一次，每孔
加入100μl实验用培养基。将调整数目的PBMC细胞和稀释后的药物分子先后加入96孔板内，
PBMC与靶细胞的效靶比为50:1。
浓度为200μg/ml，设置3个复孔。将96孔板内的生长培养基弃去，灭菌PBS轻柔洗一次，每孔
加入100μl实验用培养基。将调整数目的PBMC细胞和稀释后的药物分子先后加入96孔板内，
PBMC与靶细胞的效靶比为50:1。
[0145] 设置空白靶细胞、空白PBMC对照组，每组分别只含有靶细胞和效应细胞，每组3个复孔；同时设置效应细胞/靶细胞混合作用孔，共计6孔。其中3孔设为最大杀伤组，在检测前
30min加入裂解液，完全裂解杀死细胞；其余3孔为自然杀伤组(自然杀伤组中分别加入IL‑
10‑Fc‑A、IL‑10‑Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑
10‑Fc‑H)，作为融合蛋白杀伤作用的对照(TARGET+PBMC)。空白靶细胞、空白PBMC及最大杀
伤组均用于进行细胞死亡率计算。标示清晰后，置于37℃细胞培养箱孵育。
30min加入裂解液，完全裂解杀死细胞；其余3孔为自然杀伤组(自然杀伤组中分别加入IL‑
10‑Fc‑A、IL‑10‑Fc‑B、IL‑10‑Fc‑C、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑E、IL‑10‑Fc‑F、IL‑10‑Fc‑G、IL‑
10‑Fc‑H)，作为融合蛋白杀伤作用的对照(TARGET+PBMC)。空白靶细胞、空白PBMC及最大杀
伤组均用于进行细胞死亡率计算。标示清晰后，置于37℃细胞培养箱孵育。
[0146] 5、检测及杀伤率计算
[0147] 3天后镜检可见明显靶细胞数目减少，取上清液进行LDH检测，酶标仪读取OD490后，进行细胞死亡率计算。计算公式为：
[0148]
[0149] 实验结果如图5所示，与对照组PBMC+TARGET相比，本发明实施例1‑8提供的8种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白均能特异性杀伤SK‑BR‑3肿瘤细胞，其中IL‑10‑Fc‑A、IL‑10‑Fc‑
B、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑G的杀伤能力较强，细胞死亡率均在60％以上，杀伤能力最强的为
本发明实施例1中提供的IL‑10‑Fc‑A融合蛋白。
B、IL‑10‑Fc‑D、IL‑10‑Fc‑G的杀伤能力较强，细胞死亡率均在60％以上，杀伤能力最强的为
本发明实施例1中提供的IL‑10‑Fc‑A融合蛋白。
[0150] 实验5、人白细胞介素10‑Fc融合蛋白在小鼠H1975肿瘤模型中的药效
[0151] 1、实验动物：
[0152] 种属品系：Mus Musculus，NCG，小鼠
[0153] 周龄：6‑8周
[0154] 实验动物提供商:江苏集萃药康生物科技有限公司。
[0155] 2、细胞培养：用含有灭活的10％胎牛血清，100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素以及2mM谷氨酰胺的RPMI‑1640培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养肿瘤细胞，每隔3至4
天待细胞长满后分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。
天待细胞长满后分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。
[0156] 3、肿瘤细胞的接种与分组：
[0157] 将H1975用PBS洗涤细胞两次，然后重悬肿瘤细胞于PBS，得到NCI‑H1975人非小细胞肺癌细胞，并将NCI‑H1975人非小细胞肺癌细胞接种于PBMC人源化的雌性NOD/SCID小鼠
皮下，细胞接种量为5x10e6/小鼠；PBMC来源于正常人外周血，于H1975细胞接种前三天接种
3
至荷瘤鼠体内，2x10e6/小鼠。在肿瘤接种后待肿瘤生长至约100mm时分组给药，共6组，每
组8只动物，分别为溶酶对照组、IL‑10组、IL‑10‑Fc‑A组、IL‑10‑Fc‑B组、IL‑10‑Fc‑D组、IL‑
10‑Fc‑G组(1mg/kg，i.p.，biw×4weeks)。
皮下，细胞接种量为5x10e6/小鼠；PBMC来源于正常人外周血，于H1975细胞接种前三天接种
3
至荷瘤鼠体内，2x10e6/小鼠。在肿瘤接种后待肿瘤生长至约100mm时分组给药，共6组，每
组8只动物，分别为溶酶对照组、IL‑10组、IL‑10‑Fc‑A组、IL‑10‑Fc‑B组、IL‑10‑Fc‑D组、IL‑
10‑Fc‑G组(1mg/kg，i.p.，biw×4weeks)。
[0158] 4、检测指标：每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次的测量，测量肿瘤的长径和短2
径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径 ；记录荷瘤鼠肿瘤体积的变化与给药时间
的关系，实验结果如图6所示。
径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径 ；记录荷瘤鼠肿瘤体积的变化与给药时间
的关系，实验结果如图6所示。
[0159] 通过图6中数据显示，与溶酶对照组相比，明显给药组对肿瘤生长的抑制能力较强，与给药IL‑10相比，随着时间的延长，给药本发明实施例1提供的IL‑10‑Fc‑A、给药本发
明实施例2提供的IL‑10‑Fc‑B、给药本发明实施例4提供的IL‑10‑Fc‑D和给药本发明实施例
7提供的IL‑10‑Fc‑G对肿瘤生长的抑制作用都比较强，对肿瘤生长的抑制效果明显优于人
白细胞介素10，本发明实施例1提供的IL‑10‑Fc‑A对肿瘤生长的抑制效果最好。
明实施例2提供的IL‑10‑Fc‑B、给药本发明实施例4提供的IL‑10‑Fc‑D和给药本发明实施例
7提供的IL‑10‑Fc‑G对肿瘤生长的抑制作用都比较强，对肿瘤生长的抑制效果明显优于人
白细胞介素10，本发明实施例1提供的IL‑10‑Fc‑A对肿瘤生长的抑制效果最好。
[0160] 实验6、人白细胞介素10‑Fc融合蛋白制剂的稳定性实验测试
[0161] 人白细胞介素10‑Fc蛋白制剂制备方法：首先通过实验例1‑5筛选出对肿瘤抑制性效果最好的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白IL‑10‑Fc‑A备用，然后通过超滤管将纯化后的人
白细胞介素10‑Fc融合蛋白IL‑10‑Fc‑A换液至不同缓冲液体系中，并将浓缩后的样品稀释
至5mg/ml，用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，装量为1.1ml/瓶。
白细胞介素10‑Fc融合蛋白IL‑10‑Fc‑A换液至不同缓冲液体系中，并将浓缩后的样品稀释
至5mg/ml，用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，装量为1.1ml/瓶。
[0162] (1)不同缓冲盐对制剂稳定性影响
[0163] 通过上述方法配置成不同成分含量的18种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射
制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
[0164] 表3不同pH值和不同缓冲盐制备的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂的具体成分含量表
[0165] 实验例 药效分子 缓冲盐 蛋白保护剂 等渗透调节剂 非离子型表面活性剂 pH值实验例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 4.8
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.0
实验例3 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例4 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
实验例5 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.0
实验例6 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.3
实验例7 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 4.8
实验例8 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.0
实验例9 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例10 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
实验例11 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.0
实验例12 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.3
实验例13 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 4.8
实验例14 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.0
实验例15 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例16 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
实验例17 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.0
实验例18 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.3
对照例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的磷酸 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.0
实验例3 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例4 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
实验例5 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.0
实验例6 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.3
实验例7 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 4.8
实验例8 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.0
实验例9 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例10 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
实验例11 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.0
实验例12 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的乙酸‑乙酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.3
实验例13 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 4.8
实验例14 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.0
实验例15 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例16 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
实验例17 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.0
实验例18 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的柠檬酸‑柠檬酸钠 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 6.3
对照例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的磷酸 5％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.7
[0166] 将表3中的实验例样品和对照例样品同时放置40℃条件下进行加速稳定性试验，并分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC‑HPLC和CEX‑HPLC。分析检测
方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交
换色谱法测定电荷异构体主峰含量。以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主
峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表4所示。
方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交
换色谱法测定电荷异构体主峰含量。以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主
峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表4所示。
[0167] 表4、实验例和对照例在不同pH值和不同缓冲盐下稳定性数据汇总表
[0168]
[0169] 通过图表4数据可知，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白在40℃条件下加速4周，从总聚集体及电荷异构体主峰含量下降速率考察，对照例1相比，本发明实验例1‑18选择的缓冲盐
为L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐、乙酸‑乙酸钠或柠檬酸‑柠檬酸钠中的一种较为稳定，缓冲盐
选择其他一种，将会导致总聚集体及电荷异构体主峰含量下降速度增高，蛋白稳定性降低，
实验例1‑6、实验例7‑12及实验例13‑18相比，缓冲盐选择L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸的蛋白较
为稳定，同时实验例1‑6相比，本发明提供的制剂最适宜pH范围在5.5～6.0。
为L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐、乙酸‑乙酸钠或柠檬酸‑柠檬酸钠中的一种较为稳定，缓冲盐
选择其他一种，将会导致总聚集体及电荷异构体主峰含量下降速度增高，蛋白稳定性降低，
实验例1‑6、实验例7‑12及实验例13‑18相比，缓冲盐选择L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸的蛋白较
为稳定，同时实验例1‑6相比，本发明提供的制剂最适宜pH范围在5.5～6.0。
[0170] (2)不同蛋白稳定剂及等渗透调节剂对制剂稳定性影响
[0171] 选择对肿瘤抑制性效果最好的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白IL‑10‑Fc‑A，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的15种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂作
为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射
制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射
制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
[0172] 表5、不同蛋白保护剂和不同等渗透调节剂制备的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂成分表
[0173] 实验例 药效分子 缓冲盐 蛋白保护剂 等渗透调节剂 非离子型表面活性剂 pH值实验例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)精氨酸 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的脯氨酸 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例3 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的甘露醇 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例4 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 10％(w/v)的蔗糖 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例5 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 10％(w/v)的α‑海藻糖 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例6 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例7 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的脯氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例8 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例9 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的蔗糖 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例10 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的α‑海藻糖 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例11 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的精氨酸 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例12 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的脯氨酸 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例13 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的甘露醇 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例14 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的蔗糖 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例15 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的α‑海藻糖 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
对照例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的果糖 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的脯氨酸 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例3 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 5％(w/v)的甘露醇 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例4 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 10％(w/v)的蔗糖 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例5 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 10％(w/v)的α‑海藻糖 ‑ 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例6 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的精氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例7 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的脯氨酸 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例8 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例9 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的蔗糖 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例10 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的α‑海藻糖 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例11 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的精氨酸 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例12 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的脯氨酸 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例13 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的甘露醇 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例14 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的蔗糖 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例15 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 1％(w/v)的α‑海藻糖 100mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
对照例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的果糖 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
[0174] 将上述表5中提供的实验例1‑15和对照例样品同时放置40℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC‑HPLC和CEX‑HPLC，，计算主峰下降速率(％/
周)；数据汇总如下表6所示。
周)；数据汇总如下表6所示。
[0175] 表6、实验例和对照例在不同蛋白保护剂和不同等渗透调节剂下稳定性数据汇总表
[0176]
[0177] 从外观来看，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂在40℃放置4周，F1‑F15溶液均无色澄清，无可见异物，对照例1有丝状悬浮物产生。从表6中可以看出，综合SEC‑HPLC和
CEX‑HPLC的结果，在L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸，且pH5.5条件下，添加不同等渗透调节剂，通
过对照例1与其他实验例相比，对照例1的纯度和主峰含量下降均较快，稳定性较差，其他实
验例中添加的蛋白保护剂和等渗透调节剂与对照例1相比较为稳定，尤其实验例8，其纯度
和主峰含量的变化率较小，所以本发明提供的蛋白保护剂任意更换一种将有可能导致稳定
性降低，而通过实验例1‑15相比，实验例8提供的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂中，
蛋白保护剂为含3％(w/v)的甘露醇，等渗透调节剂为含有50mM的氯化钠，其在放置4周后，
纯度和主峰含量下降较少，说明其稳定性较高，为此，本发明优选的，蛋白保护剂优选为3％
(w/v)的甘露醇，等渗透调节剂优选为50mM的氯化钠。
CEX‑HPLC的结果，在L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸，且pH5.5条件下，添加不同等渗透调节剂，通
过对照例1与其他实验例相比，对照例1的纯度和主峰含量下降均较快，稳定性较差，其他实
验例中添加的蛋白保护剂和等渗透调节剂与对照例1相比较为稳定，尤其实验例8，其纯度
和主峰含量的变化率较小，所以本发明提供的蛋白保护剂任意更换一种将有可能导致稳定
性降低，而通过实验例1‑15相比，实验例8提供的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂中，
蛋白保护剂为含3％(w/v)的甘露醇，等渗透调节剂为含有50mM的氯化钠，其在放置4周后，
纯度和主峰含量下降较少，说明其稳定性较高，为此，本发明优选的，蛋白保护剂优选为3％
(w/v)的甘露醇，等渗透调节剂优选为50mM的氯化钠。
[0178] (3)不同非离子型表面活性剂对制剂稳定性影响
[0179] 选择对肿瘤抑制性效果最好的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白IL‑10‑Fc‑A，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的9种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂作
为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射
制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射
制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
[0180] 表7不同非离子型表面活性剂制备的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂的具体成分含量表
[0181] 实验例 药效分子 缓冲盐 蛋白保护剂 等渗透调节剂 非离子型表面活性剂 pH值实验例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.005％(w/v)吐温20 5.5
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例3 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.02％(w/v)吐温20 5.5
实验例4 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.005％(w/v)吐温80 5.5
实验例5 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例6 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.02％(w/v)吐温80 5.5
实验例7 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.005％(w/v)泊洛沙姆 5.5
实验例8 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)泊洛沙姆 5.5
实验例9 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.02％(w/v)泊洛沙姆 5.5
对照例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温40 5.5
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例3 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.02％(w/v)吐温20 5.5
实验例4 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.005％(w/v)吐温80 5.5
实验例5 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温80 5.5
实验例6 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.02％(w/v)吐温80 5.5
实验例7 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.005％(w/v)泊洛沙姆 5.5
实验例8 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)泊洛沙姆 5.5
实验例9 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.02％(w/v)泊洛沙姆 5.5
对照例1 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温40 5.5
[0182] 将表8提供的实验例样品和对照例样品同时放置40℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC‑HPLC和CEX‑HPLC，计算主峰下降速率(％/周)；数据
汇总如下表8所示。
汇总如下表8所示。
[0183] 表8实验例和对照例提供的蛋白制剂在不同非离子表面活性剂下稳定性数据汇总表
[0184]
[0185] 通过表8可以看出，本发明提供的非离子表面活性剂包含的吐温80、吐温20和泊洛沙姆均能够保证本发明提供的制剂的稳定性，通过上述实验例与对照例1相比，说明非离子
表面活性剂中任意选择其他一种将有可能导致制剂在4周后纯度和主峰含量下降，同时，实
验例1‑9相比，说明本发明优选的表面活性剂为吐温20时，其纯度和主峰含量在4周后下降
较小，相对吐温80和泊洛沙姆较稳定，通过实验例1‑9相比，说明实验例2中选择的表面活性
剂为吐温20且含量为0.01％(w/v)时，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂均具有很好的
稳定性。
表面活性剂中任意选择其他一种将有可能导致制剂在4周后纯度和主峰含量下降，同时，实
验例1‑9相比，说明本发明优选的表面活性剂为吐温20时，其纯度和主峰含量在4周后下降
较小，相对吐温80和泊洛沙姆较稳定，通过实验例1‑9相比，说明实验例2中选择的表面活性
剂为吐温20且含量为0.01％(w/v)时，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂均具有很好的
稳定性。
[0186] (4)不同融合蛋白浓度对制剂的影响
[0187] 选择对肿瘤抑制性效果最好的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白IL‑10‑Fc‑A，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的5种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂作
为实验例样品，不同实验例提供的制剂包括以下含量的成分：
为实验例样品，不同实验例提供的制剂包括以下含量的成分：
[0188] 表9不同含量的融合蛋白制备的注射制剂的具体成分含量表
[0189] 实验例 药效分子 缓冲盐 蛋白保护剂 等渗透调节剂 非离子型表面活性剂 pH值实验例1 2mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例3 10mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例4 15mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例5 30mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例2 5mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例3 10mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例4 15mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
实验例5 30mg/ml的IL‑10‑Fc‑A 20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸盐 3％(w/v)的甘露醇 50mM氯化钠溶液 0.01％(w/v)吐温20 5.5
[0190] 将表9提供的实验例样品和对照例样品同时放置40℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC‑HPLC和CEX‑HPLC，计算主峰下降速率(％/周)；数据
汇总如下表10所示。
汇总如下表10所示。
[0191] 表10不同含量的融合蛋白制备的制剂稳定性数据汇总表
[0192]
[0193] 从表10可以看出，在不同的蛋白浓度下，上述不同浓度的融合蛋白的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白注射制剂的纯度和电荷异构体主峰含量均有很好的稳定性，但是通过对
比，随着浓度的增加，总聚集体也在增加，本发明提供的最优抗体蛋白浓度为2‑15mg/ml为
最适宜制剂浓度。
比，随着浓度的增加，总聚集体也在增加，本发明提供的最优抗体蛋白浓度为2‑15mg/ml为
最适宜制剂浓度。
[0194] 通过实验六，筛选出能够使人白细胞介素10‑Fc融合蛋白结构最稳定的注射液成分及最优选的成分含量，通过上述制备方法制备成人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制
剂，制剂包括以下含量的成分：
剂，制剂包括以下含量的成分：
[0195] a)蛋白含量为2‑15mg/ml的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白；
[0196] b)浓度为20mM的L‑组氨酸/L‑组氨酸盐酸；
[0197] c)3％(w/v)的甘露醇；
[0198] d)浓度为50mM氯化钠溶液；
[0199] e)0.01％(w/v)吐温20；
[0200] 其中，制剂的pH值为5.5。
[0201] 实验7、处方验证实验
[0202] 将实验六中筛选得到的最优的辅料和药效成分制成的人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂进行处方验证试验，处方验证试验包括冻融稳定性试验和振摇稳定性试验。
[0203] (1)冻融稳定性试验
[0204] 将上述人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂浓缩至5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、30mg/ml，进行冻融稳定性试验，分别冻融1、2、3次。考察制剂外观、蛋白总聚集体和电荷
异构体主峰含量，结果如下表11所示。
异构体主峰含量，结果如下表11所示。
[0205] 表11注射制剂冻融稳定性结果汇总
[0206]
[0207] (2)振摇稳定性试验：
[0208] 将上述人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的注射制剂浓缩至5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、30mg/ml，进行振摇稳定性试验，分别进行室温水平振摇(80‑120rpm)和圆周振摇
(30rpm)3天。考察制剂外观、蛋白总聚集体和电荷异构体主峰含量，结果如下表12所示。
(30rpm)3天。考察制剂外观、蛋白总聚集体和电荷异构体主峰含量，结果如下表12所示。
[0209] 表12注射制剂振摇稳定性试验结果汇总
[0210]
[0211]
[0212] 从表11至12可以看出，不同浓度蛋白经过冻融试验及振摇试验均澄清透明，无可见异物，蛋白物理稳定性良好；从总聚集体可以看出，不同浓度蛋白冻融均很稳定，聚集体
未增加，振摇试验可以看出，不同浓度蛋白均很稳定，但随着浓度增加，总聚集体产生越多；
从电荷异构体主峰含量可以看出，不同浓度蛋白及对照组经过冻融试验及振摇试验均未有
明显变化。
未增加，振摇试验可以看出，不同浓度蛋白均很稳定，但随着浓度增加，总聚集体产生越多；
从电荷异构体主峰含量可以看出，不同浓度蛋白及对照组经过冻融试验及振摇试验均未有
明显变化。
[0213] 由以上实验证明，人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的蛋白浓度在2‑30mg/ml，均很稳定，更优选为2‑15mg/ml。经过冻融试验及振摇试验，进一步验证了JY010融合蛋白在最终制
剂处方中具有很好的稳定性。
剂处方中具有很好的稳定性。
[0214] 本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技
术方案，均落在本发明的保护范围之内。
术方案，均落在本发明的保护范围之内。