沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗转让专利
申请号 : CN202011315483.6
文献号 : CN112618706B
文献日 : 2021-09-14
发明人 : 郭莉莉 , 赵永达 , 马丽华
申请人 : 青岛博霖生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种鼠伤寒沙门氏菌S01株,其特征在于:于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心,地址:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山,保藏编号为CCTCC M 2020515。
2.一种如权利要求1中的鼠伤寒沙门氏菌S01株作为灭活疫苗抗原的用途。
3.一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗,其特征在于:抗原为灭活的鼠伤寒沙门氏菌S01株、鸭疫里默氏杆菌R01株和大肠埃希氏杆菌E01株;所述鼠伤寒沙门氏菌S01株于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心,地址:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山,保藏编号为CCTCC M 2020515;
所述鸭疫里默氏杆菌R01株于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心,地址:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山,保藏编号为CCTCC M 2020516;
所述大肠埃希氏杆菌E01株于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心,地址:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山,保藏编号为CCTCC M 2020514。
4.如权利要求3所述的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗,其特征在于:抗原的灭活采用甲醛灭活。
5.如权利要求3所述的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗,其特征在于:制备方法如下:
1)抗原制备:将纯粹检验合格的S01株、R01株和E01株抗原,将菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中,稀释、灭活后,检验合格后,将三种抗原按1:1:1体积混合,备用;
2)佐剂准备:Montanide GEL 02佐剂,121℃高压15min,备用;
3)抗原和佐剂混合后,搅拌机低速搅拌均匀;
4)分装:定量分装,加盖密封,并粘贴标签,置2~8℃保存。
说明书 :
沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗
技术领域:
背景技术:
重要公共 卫生意义。抗菌药物的使用本是治疗沙门菌感染的重要措施,但由于人类滥用、
乱用抗菌药 物导致了细菌的严重耐药,以往的数据表明,全球每年有90%的抗生素被用于
食品性动物, 这使得动物成为耐药菌的重要贮存宿主,且耐药菌及耐药基因原件正从动物
或环境向人类跨 物种传播。因此疫苗成为防控沙门氏菌病的十分重要的手段。
性病 变为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、关节炎、输卵管炎和脑膜炎等,给养鸭场造成
了严 重的经济损失。
征。该病 可发生于各种年龄的鸡,发病率和死亡率不一。一旦发生该病,可在整个鸡群内迅
速传播。 该病没有明显的季节性,四季均可发生,雏鸡的发病率和死亡率均高于成年鸡。另
外,饲料 营养不均、养殖场饲养环境差、舍内温湿度差异大、突然更换饲料以及其他应激因
素等均可 诱发该病。
埃希氏 杆菌的流行情况进行系统研究,并迫切需要研制出一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆
菌、大肠埃 希氏杆菌病三联灭活疫苗,来防治这三种疫病对养殖业造成的危害。
发明内容:
型培养物保 藏中心,地址:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山,保藏编号为CCTCC M
2020515。
型培养物保 藏中心,地址:湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山,保藏编号为CCTCC M
2020515。
编号 为CCTCC M 2020514。
菌R01 株和大肠埃希氏杆菌E01株。
量 灭菌的生理盐水中,均稀释至9.0×10CFU/ml灭活后,检验合格后,将三种抗原按1:1:1
体 积混合,备用;
好,未 出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、
效力试 验数据的分析,各项指标均稳定有效;效力试验结果证明,三联灭活疫苗能产生良
好抗体, 并能产生较好的攻毒保护力。
具体实施方式:
部的实 施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下
所获得的 所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
集脏 器并剪碎,置于装有BPW的无菌均质袋中,37℃、150r/min振荡培养8h进行预增菌,再
取 1mL增菌液于10mLTTB中42℃静置培养20~24h进行选择性增菌,然后用接种环蘸取10 μ
L选择性增菌液三区划线于XLT4琼脂平板上,37℃静置培养24h,挑取XLT4平板上圆形 无色
透明、边缘整齐的针尖大小单个菌落或以黑色为中心边缘透明的典型菌落,转种于沙门 菌
显色平板37℃培养24h后,疑似沙门菌的分离株在沙门显色平板上显紫色,其后作进一步
的鉴定。
种至 XLT4琼脂平板进行纯化培养。
5′‑TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC‑3′,P2:5′‑GCATTATCGATCAGTACCAGCC GTCT‑3′,扩增片
段大小为331bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
毒 力最强,10只鸭均在14日内死亡。该鼠伤寒沙门氏菌于2019年10月9日分离于山东潍坊
种鸭场的蛋鸭肝脏中。
1.0×10CFU/ml,甲醛灭活后,按抗原与gel02佐剂按体积比95:5混合乳化,制备单价灭活
疫 苗,每种疫苗分别肌肉注射7日龄SPF鸭,0.5ml/只,每组10只。免疫后21日采血并分离
血清,使用微量凝集试验方法测定血清的抗体效价;并用本菌株进行腿部肌肉注射攻毒(活
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菌 量均约为1.0×10CFU)。观察试验鸭的发病及死亡情况。抗体检测结果表明,免疫组5/5
均大 于等于1:32,对照组5/5均小于等于1:4;攻毒保护结果表明,免疫组5/5保护,对照组
5/5发病。
苗分别 肌肉注射7日龄SPF鸭,0.5ml/只,每组10只。免疫后21日用本菌株进行腿部肌肉注
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射攻 毒(活菌量均约为1.0×10 CFU)。观察试验鸭的发病及死亡情况。试验结果表明,免疫
组鸭均 未发病或死亡,均5/5保护;而对照组鸭,均5/5发病。表明用S01株所制备的灭活疫
苗能 抵御各地方分离株的攻击而起到保护作用。
GTGCCGTGAGGTGTTAGGTT;364bp),共分离到43株 鸭疫里默氏杆菌。
的革兰 阴性短杆(球杆)菌。菌落的乳糖发酵试验、半乳糖发酵试验、甲基红试验、VP试验、
硫化 氢产生试验、硝酸盐还原试
白胨大豆 琼脂固体培养基上,37℃培养24~48小时,形成直径0.3~2.0mm、圆形、光滑、湿
润、无 色透明的露珠样菌落。
株毒力最强,10只鸭均在14日内死亡。该鸭疫里默氏杆菌于2019年3月15日分离于河南 开
封樱桃谷鸭的肝脏中。
鸭,0.5ml/ 只,每组10只。免疫后21日采血并分离血清,使用微量凝集试验方法测定血清的
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抗体效价; 并用本菌株进行腿部肌肉注射攻毒(活菌量均约为1.0×10CFU)。观察试验鸭
的发病及死亡情 况。抗体检测结果表明,免疫组5/5均大于等于1:32,对照组5/5均小于等
于1:4;攻毒保护结 果表明,免疫组5/5保护,对照组5/5发病。
伊红 美蓝平板上37℃培养16~20小时;
肠埃希 氏杆菌。
E01 株毒力最强,10只鸭均在5日内死亡。该鸭疫里默氏杆菌于2019年3月15日分离于河南
开 封樱桃谷鸭的肝脏中。该大肠埃希氏杆菌于2019年7月4日分离于广州佛山鸭场的肠道
中。
鸭,0.5ml/ 只,每组10只。免疫后21日采血并分离血清,使用微量凝集试验方法测定血清的
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抗体效价; 并用本菌株进行腿部肌肉注射攻毒(活菌量均约为1.0×10CFU)。观察试验鸭
的发病及死亡情 况。抗体检测结果表明,免疫组5/5均大于等于1:32,对照组5/5均小于等
于1:4;攻毒保护结 果表明,免疫组5/5保护,对照组5/5发病。
38℃时,加入1%二级种子液进行发酵培养。培养温度36~37℃、搅拌转速100r/min、pH值
7.2~7.4,整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60%~80%,菌液培养4小时后,
取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液,导入柱式离心机离心,收获菌泥,
置于2~8℃保存,不超过24小时。
38℃时,加入1%二级种子液进行发酵培养。培养温度36~37℃、搅拌转速100r/min、pH值
7.2~7.4,整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60%~80%,菌液培养6小时后,
取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液,导入柱式离心机离心,收获菌泥,
置于2~8℃保存,不超过48小时。
38℃时,加入1%二级种子液进行发酵培养。培养温度36~37℃、搅拌转速100r/min、pH值
7.2~7.4,整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60%~80%,菌液培养4小时后,
取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液,导入柱式离心机离心,收获菌泥,
置于2~8℃保存,不超过48小时。
3.0×10CFU/ml,分别计量加入10%甲醛溶液,使其终浓度为0.2%,37℃搅拌灭活
照。 免疫后21日对所有鸭采血并分离血清,分别检测沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌和大肠埃
希氏杆 菌抗体效价。沙门氏菌的微量凝集抗体:免疫组10只鸭的抗体效价均≥1:32,对照
组10只鸭 的抗体效价均≤1:4;鸭疫里默氏杆菌的微量凝集抗体:免疫组10只鸭的抗体效
价均≥1:32,对 照组10只鸭的抗体效价均≤1:4。大肠埃希氏杆菌的微量凝集抗体:免疫组
10只鸭的抗体效 价均≥1:32,对照组10只鸭的抗体效价均≤1:4。
0.5ml/只,其余D、E、F三组作非免疫对照。免疫后21日对所有鸭采血并分离血清; 并进行攻
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毒试验,其中,A、D组试验鸭腿部肌肉注射S01株1.0ml(活菌量约为1×10CFU/ 只);B、E组
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试验鸭腿部肌肉注射R01株株菌液1.0ml(活菌量约为1×10CFU/只),C、F组试 验鸭腿部肌
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肉注射E01株株菌液1.0ml(活菌量约为1×10CFU/只)。观察14日,观察试验鸭 的发病和死
亡情况。鼠伤寒沙门氏菌:免疫组鸭均至少9只保护,对照组鸭至少9只发病; 鸭疫里默氏杆
菌:免疫组鸭均至少9只保护,对照组鸭均至少9只发病;大肠埃希氏杆菌: 免疫组鸭均至少
9只保护,对照组鸭均至少9只发病。
并 设置30只SPF鸭为未免疫对照鸭。根据各自疫苗的免疫程序进行免疫,免疫后进行攻毒。
攻毒保护试验结果表明,市场上出售的鸭沙门氏菌病灭活疫苗和鸭疫里默氏灭活疫苗,均
比 本发明的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗的效果较差。试
验结 果见表1。