一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的制剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的制剂及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该制剂为由活性氧敏感材料和光敏材料通过自组装形成的纳米制剂，所述活性氧敏感材料是将苯硼酸酯基修饰在亲水性高分子材料上得到，光敏材料是将光敏剂修饰在亲水性高分子材料上得到。本发明先通过构建功能性的两亲性聚合物——活性氧敏感材料和光敏材料，然后通过自组装方法包封可抑制细胞线粒体呼吸的药物制成制剂。该制剂在肿瘤组织和细胞内具有良好的稳定性，当受到外部光刺激时，能迅速响应刺激释放药物。

权利要求

1.一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的纳米制剂，其特征在于：由活性氧敏感材料和光敏材料通过自组装形成；

所述活性氧敏感材料是将苯硼酸酯基修饰在亲水性高分子材料上糊精得到，光敏材料是将光敏剂二氢卟吩e6修饰在亲水性高分子材料糊精上得到；

所述活性氧敏感材料中，亲水性高分子材料的分子量为1000‑50000，苯硼酸酯基在亲水性高分子材料主链上的摩尔取代度为20%‑80%；

所述光敏材料中，亲水性高分子材料的分子量为1000‑50000，光敏剂在亲水性高分子材料主链上的摩尔取代度为1%‑50%。

2.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：在由活性氧敏感材料和光敏材料通过自组装形成的纳米制剂中包载有抑制细胞线粒体呼吸药物。

3.根据权利要求2所述的纳米制剂，其特征在于：所述抑制细胞线粒体呼吸药物选自双胍类药物、呼吸链抑制剂药物、阿托伐醌、小檗碱、吖啶、索拉菲尼、依米丁、普卡霉素、舒洛地尔、氨茶碱、伊利替康、伊曲康唑或非诺贝特。

4.权利要求1‑3任一项所述纳米制剂的制备方法，其特征在于：将活性氧敏感材料、光敏材料和抑制细胞线粒体呼吸药物溶于有机溶剂中，以在水溶液中透析的方式使其自组装为纳米制剂；

所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇、四氢呋喃中的一种或几种混合物。

5.权利要求1‑3任一项所述纳米制剂在制备乏氧肿瘤或乏氧相关疾病的治疗药物中的应用。

说明书

一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的制剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的制剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 目前，癌症是世界范围内最主要的致死疾病之一，严重威胁人类的生命健康，给全球造成了巨大的经济损失和社会压力。为了进一步提高药物对癌症的治疗效果，发展精准的药物递送系统成为癌症精准医疗最重要方向之一。基于纳米载体的药物递送系统能够显著提高药物的药代动力学和药效动力学性质，从而极大地促进癌症等重大疾病的治疗。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤微环境为发展智能生物响应性递药系统实现肿瘤特异性治疗提供了新的契机，肿瘤的各种特异性生理特征成为了设计针对肿瘤的智能生物响应性药物递送系统的理想对象。研究人员针对肿瘤血管、pH、氧化还原、酶、ATP、活性氧、葡萄糖、乏氧、温度和机械因素等生理特征，发展了各式各样、性能优异的生物响应性递药系统，且其中很多体系已经显示出良好的生物相容性和肿瘤特异性靶向效果。

[0003] 光动力疗法是一种可用于治疗各类癌症以及多种其它类型疾病的非侵入性疗法，已经成为肿瘤治疗中最活跃的研究领域之一。其基本原理是利用特定波长的光活化蓄积在肿瘤部位的光敏剂，利用激光激发氧气转化大量的活性氧（ROS）来杀死肿瘤细胞。与传统癌症治疗方法相比，光动力疗法是一种非侵入性的癌症治疗手段，具有耐药性低和治愈快等优点。光作为能量的载体可以在特定地点和时间产生触控信号以促进药物的释放；同时，光还能在肿瘤区域和短时间内诱导产生大量的活性氧物质以杀死肿瘤细胞。

[0004] 由于癌细胞的异常增殖，肿瘤中存在大量血管流通受阻和组织坏死的乏氧区域，而且在光动力治疗过程中会不断消耗肿瘤内氧气，同时大量的血管被ROS破坏，更进一步加剧肿瘤乏氧。目前已经有很多方法用于改善肿瘤乏氧，主要是从增加氧气供应的角度出发，分为修复肿瘤血管和设计各种运载氧气的纳米递药系统。这些策略虽然能有效缓解肿瘤乏氧，但是肿瘤内氧气水平不仅受血管限制导致供给不足，也和自身大量消耗氧气有关。因此，采用消耗细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的策略，可以有效降低肿瘤对光动力治疗的氧化应激耐受性。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的制剂，通过构建两种功能材料制成该制剂，以实现光刺激响应释放药物，消耗肿瘤细胞谷胱甘肽和抑制肿瘤线粒体呼吸，产生增强自由基和氧气的两种生理信号，达到增强乏氧肿瘤光动力治疗效果。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的纳米制剂，由活性氧（ROS）敏感材料和光敏材料通过自组装形成；

[0008] 所述活性氧敏感材料是将苯硼酸酯基修饰在亲水性高分子材料上得到，光敏材料是将光敏剂修饰在亲水性高分子材料上得到；

[0009] 所述亲水性高分子材料选自聚乙二醇、羟乙基淀粉、糊精、透明质酸、葡聚糖或壳聚糖中的一种，光敏剂为卟啉类及其衍生物，选自血红素、原卟啉Ⅸ、维替莫芬、叶绿素、二氢卟吩e6或吲哚菁绿中的一种。

[0010] 进一步地，所述ROS敏感材料中，亲水性高分子材料的分子量为1000‑50000，苯硼酸酯基在亲水性高分子材料主链上的摩尔取代度为20%‑80%；

[0011] 所述光敏材料中，亲水性高分子材料的分子量为1000‑50000，光敏剂在亲水性高分子材料主链上的摩尔取代度为1%‑50%。

[0012] 进一步地，在由ROS敏感材料和光敏材料通过自组装形成的纳米制剂中包载有抑制细胞线粒体呼吸药物。

[0013] 所述抑制细胞线粒体呼吸药物选自双胍类药物（如二甲双胍、苯乙双胍、丁二胍等）、呼吸链抑制剂药物（如抗霉素A、丝裂霉素，放线菌素，抗蠕虫药恩波维铵、氯硝柳胺，喷他脒）、阿托伐醌、小檗碱、吖啶、索拉菲尼、依米丁、普卡霉素、舒洛地尔、氨茶碱、伊利替康、伊曲康唑或非诺贝特。

[0014] 进一步地，所述亲水性高分子材料为糊精，光敏剂为二氢卟吩e6。

[0015] 上述纳米制剂的制备方法，是将ROS敏感材料、光敏材料和抑制细胞线粒体呼吸药物溶于有机溶剂中，以在水溶液中透析的方式使其自组装为纳米制剂；

[0016] 所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇、四氢呋喃中的一种或几种混合物。

[0017] 上述纳米制剂在制备乏氧肿瘤或乏氧相关疾病的治疗药物中的应用。

[0018] 所述乏氧肿瘤包括非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、膀胱癌、皮肤癌，所述乏氧相关疾病包括缺血性脑中风、心肌梗塞及与缺氧有关的皮肤浅表炎症，优选在乏氧肿瘤中的光动力治疗应用。

[0019] 本发明选用具有生物相容性的亲水性高分子材料作为主链，分别通过修饰苯硼酸酯基合成ROS敏感材料、通过修饰光敏剂合成光敏材料，这两种材料具有两亲性，可通过自组装形成纳米制剂，其中光敏材料可在光激发时产生自由基，ROS敏感材料可在近红外光激发光敏材料产生自由基后，释放消耗谷胱甘肽的药物甲基苯醌，同时实现自由基响应释放药物。

[0020] 用上述的两种功能性两亲性聚合物ROS敏感材料和光敏材料通过自组装方法包封可抑制细胞线粒体呼吸的药物，在近红外光激发下，可释放消耗谷胱甘肽的药物甲基苯醌，同时实现自由基响应释放抑制肿瘤线粒体呼吸的药物。

[0021] 上述纳米制剂可用于肿瘤光动力治疗中，所述激光光源为提供光敏剂激发波长的光源。进一步地，考虑到光对于组织的穿透能力，选择近红外激光更有利于临床应用，光源一般采用单波长激光，较连续普通光源能量更为集中，功率易控制。优选地，所述光敏制剂2
采用650nm的近红外激光作为光源。具体应用时，能量密度范围为0.05～0.5W/cm ，治疗时长范围为300～1800s。

[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0023] 1、本发明创新性的提出了一种增强乏氧肿瘤光动力治疗的材料和制剂。所述制剂在近红外光激发下，通过释放消耗谷胱甘肽的药物以削弱肿瘤抗氧化能力，同时实现自由基响应释放抑制肿瘤线粒体呼吸的药物，联合这两种方法调控肿瘤氧化应激，产生增强自由基和氧气两种生理信号来实现增强乏氧肿瘤光动力治疗效果。

[0024] 2.本发明构建了两种功能性两亲性聚合物ROS敏感材料和光敏材料，通过自组装方法包封可抑制细胞线粒体呼吸的药物。该制剂在肿瘤组织和细胞内具有良好的稳定性，当受到外部光刺激时，又能迅速响应刺激释放药物。本发明提供的增强乏氧肿瘤光动力治疗的材料和制剂制备过程简易、成本低廉、生物相容性好，有效实现肿瘤光敏制剂高效低毒，改善肿瘤乏氧，增强光动力治疗。

附图说明

[0025] 图1为本发明中ROS敏感材料糊精‑苯硼酸（Dex‑PBA）的合成路线（a）、本发明实施例2中光敏材料糊精‑二氢卟吩e6（Dex‑Ce6）的合成路线（b）。

[0026] 图2为本发明中ROS敏感材料糊精‑苯硼酸（Dex‑PBA）的核磁共振氢谱图[0027] 图3本发明中光敏材料糊精‑二氢卟吩e6（Dex‑Ce6）的核磁共振氢谱图。

[0028] 图4为本发明中所制备的纳米粒（DPCe6@ATO）示意图。

[0029] 图5为本发明中所制备的纳米粒（DPCe6@ATO）粒径分布图和透射电镜图（比例尺=500 nm）。

[0030] 图6为本发明中所制备的纳米粒的紫外吸收表征图谱。

[0031] 图7为本发明中所制备的纳米粒在1 mM H2O2溶液中孵育24 h后的粒径分布图和透射电镜图（比例尺=500 nm）。

[0032] 图8为本发明中所制备的纳米粒的过氧化氢响应释放图。

[0033] 图9为本发明中所制备的纳米粒的单线态氧产生量。

[0034] 图10为本发明中纳米粒对A549细胞在常氧（21% O2）和模拟肿瘤乏氧（1% O2）条件下暗毒性和光毒性实验结果图。

[0035] 图11为本发明中纳米粒模拟肿瘤乏氧（1%O2）条件下抑制A549细胞耗氧率的时间跟踪效果图。

[0036] 图12为本发明中所制备的纳米粒消耗A549细胞内谷胱甘肽水平的效果图。

[0037] 图13为本发明中未实施光照不同分组的小鼠肿瘤体积生长曲线图（a）和施加光照不同分组的小鼠肿瘤体积生长曲线图（b）。

具体实施方式

[0038] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

[0039] 实施例1

[0040] 1、ROS敏感材料糊精修饰苯基硼酸酯（Dex‑PBA）的合成方法

[0041] 步骤1，咪唑氨基甲酸酯（CDI‑PBA）的合成：将3.51g 4‑（羟甲基）苯硼酸频哪醇酯（PBA）溶解在22mL无水二氯甲烷中，然后加入4.86g N,N‑羰基二咪唑（CDI），在25℃搅拌30分钟后，通过减压蒸馏除去溶剂得到粗产品。然后将产物溶解在100mL的乙酸乙酯中，用水洗涤三次，每次7.5mL。经过无水硫酸镁干燥和过滤后，得到最终产物。

[0042] PBA与CDI的投料摩尔比为1：1‑3，优选1：2。

[0043] 步骤2，糊精修饰苯基硼酸酯（Dex‑PBA）的合成：先后将197.02mg糊精、298.6 mg 4‑二甲基氨基吡啶（DMAP）和729.2 mg步骤1所得 CDI‑PBA溶解在3.5mL无水二甲基亚砜中。
混合物在室温搅拌反应过夜后，在透析袋（MWCO：8000‑14000Da）中用蒸馏水透析48小时，冻干后得到Dex‑PBA，将所得产物保存在4℃条件下。

[0044] 糊精、DMAP与CDI‑PBA的投料摩尔比优选1：2：2。

[0045] 2、光敏材料糊精修饰二氢卟吩e6（Dex‑Ce6）的合成

[0046] 步骤1，糊精修饰乙二胺（Dex‑eda）的合成：为了活化糊精的羟基，将648.00 mg糊精溶解在5mL二甲基甲酰胺和二甲基亚砜的混合溶剂中（体积比为1:1）中，然后加入486.48 mg N,N‑羰基二咪唑（CDI），在37℃下搅拌反应一小时。然后，将2.67 mL(60 mmoL)乙二胺滴加入混合物中，然后在37℃下继续搅拌24h。将反应混合物在透析膜(MWCO：8000‑14000Da)中用蒸馏水透析48小时，冻干后得聚合物Dex‑eda，将产物置于4℃的条件下保存。

[0047] 糊精、CDI与乙二胺的投料摩尔比为1：1：15 – 2：1：100，优选4：3：60。

[0048] 步骤2，糊精修饰二氢卟吩e6（Dex‑Ce6）的合成：通过酰胺反应将乙二胺枝接糊精中乙二胺的氨基与二氢卟吩e6(Ce6)的羧基连接起来，合成该聚合物。为了激活二氢卟吩e6的羧基，将12.00 mg(0.020 mmol)二氢卟吩e6、3.83 mg(0.020 mmoL)二氯乙烷（EDC）和2.300 mg(0.020 mmoL) N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解在1mL二甲基亚砜中，在惰性气体保护下室温搅拌反应0.5小时。活化完成后，将步骤1所得50.18 mg (0.255 mmoL)乙二胺修饰的糊精（Dex‑eda）溶解在二甲基亚砜中，将所形成的溶液缓慢滴加到活化的二氢卟吩e6溶液中，然后在惰性气体保护下室温搅拌反应24小时。反应混合物在透析袋(MWCO：8000‑
14000Da)中用蒸馏水透析48小时，冻干后得到最终产物，将最终产物保存在4℃条件下。

[0049] Dex‑eda、EDC、NHS与Ce6投料摩尔比为15‑10：1：1：1，优选12.75：1：1：1。

[0050] 图1为本实施例中ROS敏感材料糊精‑苯硼酸（Dex‑PBA）的合成路线（a）、光敏材料糊精‑二氢卟吩e6（Dex‑Ce6）的合成路线（b）。

[0051] 图2为本实施例中ROS敏感材料糊精‑苯硼酸（Dex‑PBA）的核磁共振氢谱图。

[0052] 图3为本实施例中光敏材料糊精‑二氢卟吩e6（Dex‑Ce6）的核磁共振氢谱图。

[0053] 3、增强乏氧肿瘤光动力治疗的制剂（DPCe6@ATO）制备

[0054] 采用透析法制备纳米颗粒。将3.6mg阿托伐醌（ATO）、10mgDex‑Ce6和6.89mgDex‑PBA溶解在2mL二甲基亚砜和二甲基甲酰胺（体积比为10:1）的混合溶剂中。将该混合溶液装入透析袋(MWCO：8000‑14000Da)中在蒸馏水中透析自组装48小时，冻干得到最终产物，然后在4℃条件下保存。

[0055] 在处方中不加阿托伐醌，制备方法与DPCe6@ATO相同，制得DPCe6。

[0056] 在处方中不加阿托伐醌与Dex‑PBA，制备方法与DPCe6@ATO相同，制得DCe6。

[0057] 图4为本实施例中所制备的纳米粒（DPCe6@ATO）示意图。

[0058] 图5为本实施例中所制备的纳米粒DPCe6@ATO的粒径分布图和透射电镜图（比例尺=500 nm）。通过动态光散射(DLS)测得DPCe6@ATO的平均粒径为130 nm，通过透射电镜对DPCe6@ATO进行观察显示为规则球体。

[0059] 图6为本实施例中纳米粒的紫外吸收表征图谱。DPCe6@ATO 280nm处的特征峰，表明ATO被成功地包封。此外，与DPCe6的紫外光谱相比，DPCe6@ATO的紫外光谱在645nm至680nm之间出现了宽吸收，表明DPCe6@ATO的成功制备和其具有通过近红外光诱导产生ROS的能力。

[0060] 图7为本实施例中纳米粒在1 mM H2O2溶液中孵育24 h后的粒径分布图和透射电镜图(scale bar=500 nm)。为了验证DPCe6@ATO的分解，将DPCe6@ATO与1mmol/L的过氧化氢溶液共孵育24小时，然后测定粒径分布和透射电镜图像（比例尺=500nm）。DPCe6@ATO的平均直径增加到319nm，DLS表现出宽尺寸分布(PDI=0.235)，透射电镜显示其形态特性变得不规则。

[0061] 图8为本实施例中纳米粒的过氧化氢响应释放图。由图中可看出，DPCe6@ATO在氧化还原环境中可快速响应释放药物，可作为高效的生物响应性递药系统，用于增强乏氧肿瘤的光动力治疗效果。

[0062] 实施例2

[0063] 不同制剂组纳米粒的溶液中单线态氧产生情况

[0064] 使用DPBF作为单线态氧检测探针，将含DPBF(12μL，5 mM)的乙醇溶液分别加入PBS、DCe6、DPCe6和DPCe6@ATO(6mL，5μM Ce6浓度)的水溶液中。然后在60s内每隔5s照射一‑2次650 nm激光(15 mW cm )，用紫外‑可见分光光度计每隔5s检测一次水溶液在407nm处的吸收光谱。

[0065] 图9为不同纳米粒溶液中单线态氧产生情况图。从中可以看出，光照下制剂组DPCe6和DPCe6@ATO溶液中DPBF的407nm吸收明显降低，说明产生了大量的单线态氧。

[0066] 实施例3

[0067] DPCe6@ATO的体外细胞毒性检测

[0068] 步骤1，将人非小细胞肺癌细胞A549细胞接种于96孔板中，细胞密度为2500个/孔，利用含10%胎牛血清和1％青霉素/链霉素的1640培养基在常氧条件（21% O2）下培养。12h后，将细胞分成两组，一半在缺氧条件下（1% O2）培养，其余细胞在常氧条件下（21% O2）培养。待细胞密度增长至60%‑70%时，将含不同浓度Ce6和ATO的三种纳米颗粒的PBS溶液与细胞在黑暗中共孵育4小时。

[0069] 步骤2，用新鲜培养液代替废培养基，设置光照组和黑暗组，光照组用650 nm激光以6.75 mW/cm2的功率密度照射细胞5min。4h后重复同样的操作。

[0070] 步骤3，继续培养24h后，加入20μl四甲基偶氮唑蓝（MTT，5mg/mL），孵育4小时，弃去孔内溶液，加入200 μl DMSO，振摇，使结晶充分溶解，利用酶标仪在570 nm波长下测定各孔吸光度。计算细胞存活率，存活率＝(给药组OD值‑空白组OD值)/(阴性对照OD值‑空白OD值)*100％。

[0071] 图10是DPCe6@ATO及相应对照组处理后在黑暗、光照、常氧、乏氧不同条件下的细胞毒性，黑暗条件下的数据可看出所制备的纳米药物毒性较低，说明DPCe6@ATO具有较好的安全性。对比施加光照的条件下，不论是常氧还是模拟肿瘤乏氧条件下，可看出DPCe6@ATO纳米粒都具有较好的肿瘤细胞杀伤作用。

[0072] 实施例4

[0073] DPCe6@ATO处理后细胞内的%OCR检测

[0074] 步骤1，将A549细胞接种于96孔板中，在常氧(21%氧浓度)下培养12h，然后移入氧浓度为1%或21%的培养箱中过夜。细胞与不同样品DCe6、DPCe6和DPCe6@ATO(10µM ATO浓度)共同孵育4h后，取出所有旧培养液，换上150µl的新鲜培养液。

[0075] 步骤2，用650 nm激光以2.5 mW/cm2的功率密度照射细胞10min，再培养1h，照射后每孔加入10µl 磷氧探针，然后加入2滴(或100µl)预热的HS矿物油密封，使用酶标仪读取该板，在延迟时间为30μs和70μs获得两个读数后，可以计算耗氧率(%OCR)。本实验以PBS光照组产生的%OCR为对照组，所有组均经背景校正。

[0076] 图11是缺氧（1% O2）条件下DPCe6@ATO处理后A549细胞耗氧率水平(%OCR)，从中可看出，DPCe6@ATO能显著降低肿瘤细胞的耗氧率，从而提高肿瘤细胞的相对氧浓度。

[0077] 图12为不同纳米粒处理后细胞内GSH水平的示意图，从中可以看出，细胞摄取DPCe6@ATO后，光照组的GSH水平低于黑暗组。说明DPCe6@ATO在光照下可以显著降低GSH水平。

[0078] 实施例5

[0079] DPCe6@ATO的药效学评价

[0080] 取对数期生长活跃的人非小细胞肺癌A549细胞株，调整细胞浓度为1×107/mL，每只健康雄性BALB/c裸鼠(6‑8周龄，18‑22g)于皮下接种，正常饲养 7‑10 天。选取肿瘤体积3
达到200±20mm 左右的荷瘤小鼠 60只，按体重大小随机分为10组：5组光照处理，5组黑暗‑1
处理，均包括PBS组、DCe6组、游离ATO组、DPCe6组、DPCe6@ATO(Ce6，5 mg·kg )组，每组6只。
2
静脉注射后的8h和12h，用功率密度为100 mW/cm的650 nm激光照射肿瘤部位。所有治疗均隔日进行，共12天。测定治疗后小鼠的相对体质量和肿瘤体积的变化，以评价其抗肿瘤作用。第21天处死小鼠，手术取出实体瘤块，称重并固定于4%多聚甲醛中。

[0081] 图13是按如上步骤给药后所得的小鼠肿瘤体积增长情况，从中可看出，光照下DPCe6@ATO纳米粒体现出良好的抗肿瘤效果，且与对照组相比肿瘤体积明显减小，从而证明了DPCe6@ATO具有很强的抗肿瘤功能。