一种α-L-岩藻糖苷酶检测探针及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针，结构通式如下所示：式I中，R1为乙酰基保护的单糖基或单糖基；R2为吡喃腈基或苯并吡喃腈基。本发明制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针提升了检测灵敏度，能高选择性检测血清AFU，可以用于癌症细胞的定位与检测的试剂盒或药物。

权利要求

1.一种α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针，其特征在于，所述α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的结构如下所示：其中，R3为H。

2.一种制备如权利要求1所述的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的方法，包括以下步骤：将等摩尔比的化合物a、无水醋酸钠与过量的醋酸酐混合搅拌，在温度为80～100℃的条件下加热反应，薄层层析监测，得到化合物b；

将化合物b与过量的乙酸酐溶于二氯甲烷中，滴入过量的含30％HBr的醋酸溶液，薄层层析跟踪，待反应完全，得到化合物c；

将摩尔比为1:(1.1～2):(1.1～2)的对羟基苯甲醛、化合物c、无水碳酸钾溶于无水丙酮中，在温度为50～70℃的条件下加热反应，薄层色谱跟踪，反应得到化合物d；

将摩尔比为1:(1.1～2)的化合物d、吡喃腈溶于甲苯中，加入催化量的乙酸和哌啶，在氩气保护下搅拌回流，薄层色谱跟踪，反应完全获得化合物e；

将化合物e溶于甲醇中，加入过量的氨水，反应过夜，得到化合物f。

3.如权利要求1所述的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针在制备用于癌症细胞的定位与检测的试剂盒或药物中的应用；

其中，所述癌症指的是肝癌。

说明书

一种α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于有机探针检测技术领域，具体涉及一种α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 根据JAMA Oncology于2020年2月发布的全球癌症负担报告，截止2017年，肝癌的全球死亡率排名第四，而在中国，肝癌死亡率仅次于TBL癌和胃癌，位列第三。全世界每年超过80万人死于肝癌，其中有半数以上是中国人。原发性肝癌(primary haptic carcinoma,PHC)是成年人中最常见的肝癌，而85％～90％的成年原发性肝癌是肝细胞癌(hapatocellar carcinoma,HCC)。检测手段的局限性以及肝脏强大的代偿能力，往往使患者早期难以察觉，近80％的肝癌患者被确诊时已进入中晚期，错过了最佳治愈时间，即使近年来治疗手段的多样化使得患者寿命延长，但是五年生存率仍不足20％。因此，更提早、有效的发现、确诊肝细胞癌对于患者具有重要意义。

[0003] 目前，早期肝脏筛查常用的就是血清甲胎蛋白(alpha‑fetoprotein,AFP)测定和肝脏彩超。AFP是目前公认的HCC阳性血清标志物，但是有研究证实，仍有大约40％的早期肝癌患者呈现阴性，AFP诊断较弱的灵敏性和特异性无疑增加了误诊或漏诊的可能性。除此之外，孕妇、婴儿、部分急慢性肝炎患者、Ⅰ型遗传性酪氨酸血症患者等群体均表现为AFP超标，因此寻找一种相互补充的HCC标志物至关重要。α‑L‑岩藻糖苷酶(α‑L‑fucosidase,AFU)是一种广泛存在于哺乳动物各组织细胞和体液中的溶酶体酸性水解酶，主要用于水解岩藻糖类的复合物。临床研究表明，HCC患者体内AFU大量表达，可能是肝癌细胞中的糖蛋白唾液酸对循环AFU的分解速率下降所致。已有研究显示，AFU对于HCC的诊断敏感性为75％～87％，特异性为70％～90％。IshizukaH等和GiardinaMG等对肝硬化患者的跟踪调查证实，AFU可以作为特异性的肿瘤标志物较好地区分HCC与正常肝硬化。AFU的另一优势在于其血清含量与AFP含量和肿瘤大小无相关性，这更有利于AFP阴性和小肿瘤患者的早期诊断。

[0004] AFU目前的检测方法有荧光法、化学比色法、终点显色法、连续监测法等，其中最成熟的是连续监测法，最先进的是荧光法。荧光法利用AFU水解4‑甲基伞型酮α‑L‑岩藻吡喃糖苷，释放4‑甲基伞型酮，并使产物呈现荧光，用360nm或365nm激发波长和400nm或448nm发射波长检测荧光强度，对照不同浓度4‑甲基伞型酮制备的标准曲线求酶活性。此法敏感性高，最小检出限为0.06U/L。但是此法对于仪器设备的要求较高，不适用于自动化检测。化学比色法常用的底物是对硝基酚α‑L‑岩藻吡喃糖苷(PNP‑F)，由于必须设血清空白管来排除胆红素的化学干扰，难以实现自动化常规分析，比较适合人工检测。终点显色法即采用4‑硝基苯α‑L‑岩藻吡喃糖苷为底物经AFU水解释放呈显著黄色的4‑硝基苯酚(4‑NP)，在405nm波长下用纯4‑NP作标准品，利用标准曲线或4‑NP的摩尔吸光度计算出AFU活性。本法可行性强，不需要专门设备，但是操作繁琐，耗时长，干扰因素众多，无法实现自动化检测。连续监测法(速率法)是利用血清中AFU催化氯‑对硝基酚α‑L‑岩藻吡喃糖苷(CNP‑F)水解生成2‑氯‑对硝基酚(CNP)，在405nm或410nm波长监测CNP的生成速率，从而计算出AFU活性。本法操作简便，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都有所提高，适用于各种自动分析仪器，便于临床推广。本法因底物不同划分为PNP法、CPNP法、M‑G‑CPNP法。PNP法的底物为对硝基苯α‑L‑岩藻吡喃糖苷，敏感性和精密度不佳，对溶血、黄疸仍表现出一定的基质效应。CPNP法在上世纪90年代逐渐兴起，采用氯化对硝基苯α‑L‑岩藻吡喃糖苷作底物，虽很大程度上提高了对于待测物的敏感性和精密度，但仍未完全解决溶血、黄疸及脂血的基质效应。M‑G‑CPNP为新型底物，其灵敏度、精密度、抗干扰性及试剂的稳定性都很高，适合自动化检测，是当前较先进、应用较为广泛的检测方法。侯贤锋等研制了一种基于蒽甲酰亚胺单个荧光团的α‑L‑岩藻糖苷酶比率荧光探针，显著改变了探针分子的光物理性质，从而实现了内源性AFU的比例式检测，检测下限0.0033U/mL。程鑫等提出的新型荧光传感定量检测技术是基于聚合物点(PDs)与4‑硝基苯基‑α‑L‑岩藻糖苷在AFU催化下的水解产物对硝基苯酚之间的内过滤作用，对硝基苯酚的吸收与PDs的荧光激发光谱重叠，导致PDs的荧光猝灭或减弱，最低检出限0.001U/mL。以上两种方法虽然有很高的灵敏度和特异性，但是操作步骤多，所需试剂昂贵，理论性较强，在短时间内均难以大规模应用。

发明内容

[0005] 本发明的第一个目的是提供一种α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针，提升了检测灵敏度，能高选择性检测血清AFU。

[0006] 本发明的第二个目的是提供一种所述α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的制备方法。

[0007] 本发明的第三个目的是提供一种所述α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针在制备用于癌症细胞的定位与检测的试剂盒或药物中的应用。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0009] 本发明的第一方面提供了一种α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针，结构通式如下所示：

[0010]

[0011] 式I中，R1为乙酰基(简记为“Ac”)保护的单糖基或单糖基；

[0012] R2为吡喃腈基或苯并吡喃腈基。

[0013] 所述R1为葡萄糖基团(Gal‑)、半乳糖基团(Gal‑)、甘露糖基团(Man‑)、岩藻糖基团(Fuc‑)、乙酰基葡萄糖基团(GalAc‑)、乙酰基半乳糖基团(GalAc‑)、乙酰基甘露糖基团(ManAc‑)、乙酰基岩藻糖基团(FucAc‑)，优选岩藻糖基团、乙酰基岩藻糖基团。

[0014] 较优选的，所述α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的结构如下所示：

[0015]

[0016] 其中，R3为H、C1～C10烷基。

[0017] 最优选的，所述α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的结构为以下结构中的一种：

[0018]

[0019] 本发明的第二方面提供了一种所述α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的制备方法，包括以下步骤：

[0020]

[0021]

[0022] 将等摩尔比的化合物a、无水醋酸钠与过量的醋酸酐混合搅拌，在温度为80～100℃的条件下加热反应，薄层层析监测，得到化合物b；

[0023] 将化合物b与过量的乙酸酐溶于二氯甲烷中，滴入过量的含30％HBr的醋酸溶液，薄层层析跟踪，待反应完全，得到化合物c；

[0024] 将摩尔比为1:(1.1～2):(1.1～2)(优选为1:1.2:1.2)的对羟基苯甲醛、化合物c、无水碳酸钾溶于无水丙酮中，在温度为50～70℃的条件下加热反应，薄层色谱跟踪，反应得到化合物d；

[0025] 将摩尔比为1:(1.1～2)(优选为1:1.2)的化合物d、吡喃腈溶于甲苯中，加入催化量的乙酸和哌啶，在氩气保护下搅拌回流，薄层色谱跟踪，反应完全获得化合物e；

[0026] 将化合物e溶于甲醇中，加入过量的氨水，反应过夜，得到化合物f。

[0027] 本发明的第三方面提供了一种所述α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针在制备用于癌症细胞的定位与检测的试剂盒或药物中的应用。

[0028] 所述癌症指的是肝癌。

[0029] 由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

[0030] 当前，肝癌已经成为严重威胁人类健康的“癌中之王”，现有检测手段的局限性以及肝脏强大的代偿能力往往使患者在确诊时已经进入了中晚期，错过了最佳治疗时间。本发明制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针是将吡喃腈与苯乙烯偶联，形成D‑π‑A结构，经AFU水解掉岩藻糖之后，π‑π共轭效应增强而出现长波吸收，体系中荧光发生由无到有的现象，结果发现荧光强度与血清AFU浓度呈现良好的线性关系，从而实现AFU的定量检测，最低检出限为0.02322U/L，显示出灵敏度高、稳定性强的优点，对肝癌的提前检出具有重要意义。

[0031] 本发明制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针，提升了检测灵敏度，能高选择性检测血清AFU，可以用于癌症细胞的定位与检测的试剂盒或药物。检测原理是利用AFU对于受体分子苷键的水解作用暴露出荧光基团使其在570nm处呈现强的荧光信号。固定探针浓度为100μM，当血清取量在12μL以内时，其特异吸收峰的强度与血清AFU的浓度呈现出良好的线性关系，通过比对与探针作用后的AFU标准品的吸光度，实现对AFU的定量检测，最低检出限为0.02322U/L。另外，与现有技术相比，本发明制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针通过改变桥联方式和荧光基团，增强了特征吸收峰，降低了检出限，且具响应速度快(＜5min)、特异性强等特点，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0032] 图1是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的AFU标准品作用的荧光光谱图。

[0033] 图2是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的血清作用的荧光强度线性拟合曲线图。

[0034] 图3是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的血清作用的荧光光谱图。

[0035] 图4是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的血清作用的紫外可见光谱图。

具体实施方式

[0036] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

[0037] 术语解释：受体分子是基于分子识别原理与底物进行特异性反应的一类配体，这种特异性反应可以通过内在的化学信号响应进行输出。

[0038] 实施例1

[0039] 全乙酰基保护的岩藻糖的合成(化合物b的合成)：

[0040]

[0041] 在装有搅拌磁子、球形冷凝管的50mL单口烧瓶中，依次加入化合物a(5g，28mmol)、无水醋酸钠(2.3g，28mmol)、醋酸酐(25mL)，将混合液搅拌加热反应(90℃)，薄层层析跟踪，反应15min，待溶液澄清后，终止反应。倒入少量冰水混合物，玻璃棒搅拌，白色结晶析出，抽1
滤，滤饼用乙醇溶解，降温结晶，得白色针状晶体即化合物b(8.3g，25mmol)，产率为89％。H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.32(dd,J＝9.6,3.6Hz,1H),5.67(d,J＝8.3Hz,2H),5.28(s,1H),
4.32–4.17(m,1H),2.14(s,3H),2.02(d,J＝9.3Hz,9H),1.23(s,3H).

[0042] 1‑溴代全乙酰基保护的岩藻糖的合成(化合物c的合成)：

[0043]

[0044] 在装有搅拌磁子、球形冷凝管的150mL三口烧瓶中，依次加入化合物b(4.15g，12.25mmol)、二氯甲烷(50mL)、乙酸酐(4mL)，将含30％HBr的醋酸溶液1mL置于滴液漏斗中，缓慢滴加，薄层层析跟踪。待反应完全，真空除去溶剂，将二氯甲烷(100mL)和水(100mL)加入到体系中，萃取，分离水层，有机层使用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相，使用无水硫酸镁干燥后，过滤浓缩，利用硅胶柱层析分离提纯(石油醚/乙酸乙酯＝1:3，
1
Rf＝0.4，v/v)，得橙色产物化合物c(1.45g，4.12mmol)，产率为33％。H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.69(d,J＝3.9Hz,1H),5.40(dd,J＝10.6,3.3Hz,1H),5.35(d,J＝2.7Hz,1H),5.07–4.93(m,1H),4.40(q,J＝6.4Hz,1H),2.12(t,J＝15.1Hz,6H),2.00(d,J＝6.0Hz,3H),1.22(t,J＝6.1Hz,3H).

[0045] 中间体d的合成：

[0046]

[0047] 在装有搅拌磁子、球形冷凝管的250mL单口烧瓶中，依次加入化合物c(1.45g，4.12mmol)、对羟基苯甲醛(0.42g，3.43mmol)、无水碳酸钾(0.57g，4.12mmol)、100mL无水丙酮，反应液经搅拌油浴加热反应(60℃)，薄层色谱跟踪，反应6h。真空浓缩，旋除丙酮，二氯甲烷萃取，有机相依次用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，真空旋蒸除去二氯甲烷，柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1:3，Rf＝0.5，v/v)，得橙红色固体即化合物d
1
(0.431g，1.10mmol)，产率为32％。H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.92(s,1H),7.85(d,J＝8.6Hz,
2H),7.11(d,J＝8.6Hz,2H),5.50(dd,J＝10.4,7.9Hz,1H),5.33(d,J＝3.2Hz,1H),5.16–
5.14(m,1H),4.03(d,J＝6.3Hz,1H),2.21(s,3H),2.06(s,3H),2.02(s,3H),1.29(s,3H).[0048] 全乙酰基保护的受体分子即α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的合成(化合物e的合成)：

[0049]

[0050] 在装有搅拌磁子、球形冷凝管的100mL单口烧瓶中，依次加入吡喃腈(0.227g，1.32mmol)、化合物d(0.431g，1.10mmol)、甲苯(30mL)、乙酸(0.5mL)、哌啶(1mL)，在氩气保护下搅拌回流，薄层色谱跟踪，反应10h，真空浓缩，柱层析分离(二氯甲烷/甲醇＝15:1，Rf
1
＝0.5，v/v)，得深橙红色固体即化合物e(0.066g，0.12mmol)，产率为11％。H NMR(400MHz,MeOD)δ7.66(d,J＝8.7Hz,2H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),6.99(d,J＝16.0Hz,1H),6.81(d,J＝
1.9Hz,1H),6.65(d,J＝5.7Hz,1H),5.38(s,1H),5.37(s,1H),5.36(s,1H),5.34(d,J＝
3.0Hz,1H),5.27(dd,J＝6.9,3.6Hz,1H),4.24–4.19(m,1H),2.23(s,3H),2.08(s,3H),2.01+
(s,3H),1.70(d,J＝53.9Hz,3H),0.93(t,J＝6.7Hz,3H).HRMS(ESI,m/z):[M+Na]calcd +
for C29H29N2O9549.1873,found 549.1894.

[0051] 实施例2

[0052] 全乙酰基保护的受体分子即α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针的合成(化合物f的合成)：

[0053]

[0054] 在装有搅拌磁子的25mL单口烧瓶中，依次加入实施例1制备的化合物e(0.066g,0.12mmol)、甲醇10mL、氨水(0.5mL，2.11mmol)，反应过夜，得到粗产品，经柱层析分离(二氯
1
甲烷/甲醇＝15:1，Rf＝0.5，v/v)，得到化合物f(0.045g，0.11mmol)，产率为90％。H NMR(400MHz,MeOD)δ7.64(d,J＝8.8Hz,2H),7.30–7.21(m,2H),7.00(s,1H),6.96(s,1H),6.81(d,J＝2.0Hz,1H),6.64(s,1H),5.40–5.35(m,1H),3.91–3.87(m,1H),3.82(s,1H),3.80(s,
1H),3.78(s,1H),3.71(d,J＝3.2Hz,1H),3.63(d,J＝3.4Hz,1H),3.61(d,J＝3.4Hz,1H),‑ ‑
2.48(s,3H),0.92(d,J＝7.1Hz,3H).HRMS(ESI,m/z):[M‑H] calcd for C23H21N2O6
421.1400,found 421.1399.

[0055] 实施例3

[0056] 本发明制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针将其应用于血清AFU检测，虽然目前文献对于AFU探针的报道众多，但是本发明所涉及探针的灵敏度最高。作为一种广泛存在于哺乳动物细胞内和体液中的溶酶体酸性水解酶，AFU在临床中对HCC患者有着很重要的意义，如能和AFP联合检测，将很大程度上提高了HCC的检出率。本发明基于AFU对岩藻糖苷类化合物苷键快速专一的水解作用设计的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针。吡喃腈具有对电子干扰的高敏感度、长发射波长和高量子产率等优秀的光物理性质，通过与苯乙烯基相连，形成donor‑π‑acceptor(D‑π‑A)结构，岩藻糖被水解掉后，π‑π共轭效应增强导致红移，因此得到长波长区域的特征峰。通过探针与AFU反应前后体系“推‑拉电子”能力的变化，从而实现对AFU的定量检测。

[0057] 图1是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的AFU标准品作用的荧光光谱图。采用DMSO(二甲基亚砜)：PBS(0.01mol,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液作为溶剂。将该受体分子(实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针)溶解到400μL DMSO:PBS＝9:1(v:v)的溶剂中，在1cm×1cm的标准石英比色皿中制成浓度为100μmol/L的溶液。激发波长设置为470nm，取AFU标准品分梯度各结合100μM的探针绘制荧光发射谱标准品曲线。在该溶液中逐次加入20μL 120U/L含岩藻糖苷酶(AFU)的血清，测试荧光强度的变化。可以看出，570nm处出现特征峰，且荧光强度与标准品浓度有线性相关性，说明不同浓度的标准品与其荧光强度呈现很好的线性关系。

[0058] 图2是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的血清作用的荧光强度线性拟合曲线图，说明可以通过荧光强度很好的推算出血清中AFU的含量。

[0059] 图3是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的血清作用的荧光光谱图，采用DMSO(二甲基亚砜)：PBS(0.01mol,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液作为溶剂。将该受体分子(实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针)溶解到400μL DMSO:PBS＝9:1(v:v)的溶剂中，在1cm×1cm的标准石英比色皿中制成浓度为100μmol/L的溶液。激发波长设置为470nm。在该溶液中逐次加入2.5μL含岩藻糖苷酶(AFU)的血清，测试荧光强度的变化。说明血清中AFU含量越高，荧光响应越强。

[0060] 图4是实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针与不同浓度的血清作用的紫外可见光谱图。采用DMSO(二甲基亚砜)：PBS(0.01mol,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液作为溶剂。将该受体分子(实施例2制备的α‑L‑岩藻糖苷酶检测探针)溶解到400μL DMSO:PBS＝9:1(v:v)的溶剂中，在1cm×1cm的标准石英比色皿中制成浓度为100μmol/L的溶液。在该溶液中逐次加入2.5μL含岩藻糖苷酶(AFU)的血清，测试紫外吸收的变化。结果表明受体分子对含岩藻糖苷酶(AFU)血清的紫外检测在375nm处出现吸收下降，在275nm、470nm处出现吸收上升的现象。表明该受体分子对含岩藻糖苷酶(AFU)血清有紫外响应。后经测试分析，275nm处吸收变化是受血清中其他组分影响而出现的。该探针可灵敏检测血清中AFU的含量，AFU含量从0.0058～4.6U/mL均可被检出。本发明的试剂易得，操作简单，响应快，对设备要求不高，是一种新型的能真实反应血清AFU活性的检测试剂。

[0061] 对比例1

[0062]

[0063] 化合物g为4‑甲基伞型酮α‑L‑岩藻吡喃糖苷，是一种本发明所设计化合物的类似物。利用AFU水解4‑甲基伞型酮α‑L‑岩藻吡喃糖苷，释放4‑甲基伞型酮，并使产物呈现荧光，用360nm或365nm激发波长和400nm或448nm发射波长检测荧光强度，对照不同浓度4‑甲基伞型酮制备的标准曲线求酶活性，最小检出限为0.06U/L，此法是目前先进的荧光检测法之一，对于仪器设备的要求较高。与此法相比，本发明的最小检出限更低，操作更简单快捷，易于自动化检测。

[0064] 以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。