一种耐热植酸酶突变体及其应用转让专利
申请号 : CN202011519196.7
文献号 : CN112626048B
文献日 : 2022-02-01
发明人 : 吴丹 , 郑璞 , 陈鹏程 , 陈中伟
申请人 : 江南大学
摘要 :
本发明公开了一种耐热植酸酶突变体及其应用，属于酶工程领域。通过随机突变的方法对来源于大肠杆菌Escherichia coli植酸酶基因appA进行改造，多轮筛选得到一种突变体蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明筛选得到的植酸酶突变体appA‑M最适pH为4.5，最适温度为65℃，在90℃处理10min后保留30％的酶活。与野生酶相比，植酸酶突变体appA‑M的热稳定性得到显著提高。所述植酸酶突变体可以广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过程中酶活力的损失，降低饲料成本，同时还能降低磷排放对环境的污染。
权利要求 :
1.一种植酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的植酸酶突变体，其特征在于，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶的第120位氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺，第137位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸，第219位氨基酸由谷氨酸变为苏氨酸。
3.编码权利要求1所述的植酸酶突变体的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:
4。
4.一种载体，其特征在于，表达权利要1所述的植酸酶突变体或含有权利要求3所述的基因。
5.一种基因工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的植酸酶突变体或权利要求4的载体。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，是以质粒pET22b(+)为重组载体。
8.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，是以E.coli BL21(DE3)为宿主。
9.权利要求1或2所述的植酸酶突变体或权利要求5～8任一所述基因工程菌在制备猪禽饲料中的应用。
说明书 :
一种耐热植酸酶突变体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种耐热植酸酶突变体及其应用，属于酶工程领域。
背景技术
[0002] 植酸又称肌醇六磷酸，广泛存在于农作物的种子中，是谷物中磷的主要储存形式，约占60％‑80％。在单胃动物中，植酸和植酸盐不能被直接吸收利用，只能随着动物的粪便
排出，然而过量磷排放则会导致水体富营养化，对环境影响十分严重。并且由于动物对磷的
需求无法得到满足，必须额外添加无机磷，这样无形之中造成磷资源的极度浪费。另外植酸
具有强鳌合能力，可以与铁、镁、锌、钙等金属离子以及胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶结合，在
植物性饲料中成为一种抗营养因子，影响单胃动物对矿物质的利用。
排出，然而过量磷排放则会导致水体富营养化，对环境影响十分严重。并且由于动物对磷的
需求无法得到满足，必须额外添加无机磷，这样无形之中造成磷资源的极度浪费。另外植酸
具有强鳌合能力，可以与铁、镁、锌、钙等金属离子以及胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶结合，在
植物性饲料中成为一种抗营养因子，影响单胃动物对矿物质的利用。
[0003] 植酸酶又称肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸或植酸盐水解成肌醇和磷酸或磷酸盐的一类酶的总称，属于正磷酸单酯水解酶家族，广泛存在于植物、动物和微生物中。大量研
究表明，在猪、禽类饲料中添加适量的植酸酶可使磷利用率提高60％左右，动物粪便的磷排
放减少30—50％。这不仅降低了饲料的生产成本，而且还减少了环境污染。
究表明，在猪、禽类饲料中添加适量的植酸酶可使磷利用率提高60％左右，动物粪便的磷排
放减少30—50％。这不仅降低了饲料的生产成本，而且还减少了环境污染。
[0004] 然而，植酸酶在饲料生产过程的短暂高温处理中需要足够的耐热性。大肠杆菌来源的植酸酶活性良好，发酵活力较高，适用于高水平表达系统。但其耐热性较低，相比黑曲
霉来源的植酸酶相差较大。因此，进一步提高大肠杆菌来源的植酸酶的耐热性，成为饲用植
酸酶的研究热点之一。
霉来源的植酸酶相差较大。因此，进一步提高大肠杆菌来源的植酸酶的耐热性，成为饲用植
酸酶的研究热点之一。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的问题是提供一种耐热植酸酶突变体及其应用。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种植酸酶突变体，所述突变体含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述植酸酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶的第120位氨基酸由丝氨酸(Ser)变为天冬酰胺(Asn)，第137位氨基酸由天冬酰胺
(Asn)变为天冬氨酸(Asp)，第219位氨基酸由谷氨酸(Glu)变为苏氨酸(Thr)。
(Asn)变为天冬氨酸(Asp)，第219位氨基酸由谷氨酸(Glu)变为苏氨酸(Thr)。
[0008] 本发明的第二个目的是提供编码上述植酸酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
[0009] 本发明的第三个目的是提供含有核苷酸序列为SEQ ID NO:4的重组载体。
[0010] 本发明的第四个目的是提供表达上述植酸酶突变体的基因工程菌，以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主。
[0011] 在本发明的一个实施方式中，所述质粒是pET22b(+)。
[0012] 在本发明的一个实施方式中，所述宿主大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。
[0013] 本发明的第五个目的是提供含有上述植酸酶突变体或表达植酸酶突变体的基因工程菌在猪禽饲料中的应用。
[0014] 有益效果：
[0015] 本发明获得的植酸酶突变体appA‑M最适pH为4.5，在pH3.0‑6.0有50％以上活性，最适温度为65℃，比野生酶提高5℃，在90℃处理10min后保留30.3％的酶活，热稳定性较野
生酶提高27.7％。所述耐热植酸酶突变体可广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料
制粒过程中酶活力的损失，降低饲料成本，同时还能降低磷排放对环境的污染。
生酶提高27.7％。所述耐热植酸酶突变体可广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料
制粒过程中酶活力的损失，降低饲料成本，同时还能降低磷排放对环境的污染。
附图说明
[0016] 图1为易错PCR随机突变PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0017] 图2为pET22b(+)载体片段琼脂糖凝胶电泳图。
[0018] 图3为植酸酶野生型appA和突变体appA‑M的最适pH曲线。
[0019] 图4为植酸酶野生型appA和突变体appA‑M的pH稳定性曲线。
[0020] 图5为植酸酶野生型appA和突变体appA‑M的最适温度曲线。
[0021] 图6为植酸酶野生型appA和突变体appA‑M的热稳定性曲线。
具体实施方式
[0022] LB培养基成分：1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，固体培养基加2％琼脂粉。
[0023] 高保真酶PCR反应体系：高保真混合酶(2×)25μL，上、下游引物各2μL，DNA模板100ng，灭菌蒸馏水不足50μL。反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火5s，72
℃延伸1min，30个循环；72℃充分延伸10min；4℃保温。
℃延伸1min，30个循环；72℃充分延伸10min；4℃保温。
[0024] 植酸酶的酶活检测(钼蓝法)：
[0025] 乙酸缓冲液B(0.25mol/L)：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温‑20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
[0026] 植酸钠溶液(6.25mmol/L)：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配(实际反应液中的最终
浓度为5.0mmol/L)。
浓度为5.0mmol/L)。
[0027] 终止液：5％三氯乙酸(5％TCA)。
[0028] 1.5％钼酸铵(试剂A)：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。
[0029] 2.7％硫酸亚铁(试剂B)：冰箱储存，有效期1个月。
[0030] 显色剂：移取4份试剂A(2.5)，1份试剂B(2.6)混合后使用，现用现配。
[0031] 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液(2.2)配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液(2.2)，冰箱储存。
[0032] 将4.0mmol/L磷酸二氢钾标准溶液用乙酸缓冲液(2.2)稀释成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，按表1的操作步骤一起反应。以无机磷含量为纵坐标(0.2ml以上稀
释液无机磷含量分别为：0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μmol)，以吸光值为横坐标，绘制
标准曲线，列出直线回归方程。
释液无机磷含量分别为：0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μmol)，以吸光值为横坐标，绘制
标准曲线，列出直线回归方程。
[0033] 表1钼蓝法检测酶活操作步骤
[0034]反应顺序 样品，标准 样品空白 标准空白
样品稀释液(ml) 0.2 0.2 ‑
乙酸缓冲液(2.2)(ml) ‑ ‑ 0.2
37℃预热5min √ √ √
依次加入底物(2.3)(ml) 0.8 0.8(第二步) 0.8(第二步)
混合 √ √ √
37℃保温30min √ ‑ ‑
依次加入终止液(2.4)(ml) 1.0 1.0(第一步) 1.0(第一步)
依次加入显色剂(2.7)(ml) 1.0 1.0 1.0
混合 √ √ √
总体积(ml) 3.0 3.0 3.0
样品稀释液(ml) 0.2 0.2 ‑
乙酸缓冲液(2.2)(ml) ‑ ‑ 0.2
37℃预热5min √ √ √
依次加入底物(2.3)(ml) 0.8 0.8(第二步) 0.8(第二步)
混合 √ √ √
37℃保温30min √ ‑ ‑
依次加入终止液(2.4)(ml) 1.0 1.0(第一步) 1.0(第一步)
依次加入显色剂(2.7)(ml) 1.0 1.0 1.0
混合 √ √ √
总体积(ml) 3.0 3.0 3.0
[0035] 反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计700nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液
(A)的吸光值，A‑A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品的无机磷含量，并求出植酸酶
活性。
(A)的吸光值，A‑A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品的无机磷含量，并求出植酸酶
活性。
[0036] 酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷所需的酶含量为1U。
[0037] 实施例1：易错PCR随机突变植酸酶基因
[0038] 使用上海生工公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取大肠杆菌BL21的基因组，根据公共基因数据库NCBI(GenBank:AMH85921.1)得到大肠杆菌来源植酸酶基因序列
(序列为SEQ ID NO:2)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，合成以下引物：
(序列为SEQ ID NO:2)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，合成以下引物：
[0039] 引物F1：ttcggatccgaattcATGAAAGCGATCTTAATCCCAT；
[0040] 引物R1：ttgtcgacggagctcTTACAAACTGCACGCCG；
[0041] 以大肠杆菌基因组为模板，使用北京天恩泽公司的可调式易错PCR试剂盒进行随机突变。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循
环；4℃保温。
环；4℃保温。
[0042] 以大肠杆菌基因组为模板，使用高保真PCR酶扩增野生型植酸酶基因。
[0043] 琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，PCR产物大小为1200bp左右，条带大小正确，使用上海捷瑞公司的胶回收试剂盒进行回收。
[0044] 实施例2：植酸酶突变体文库的构建
[0045] 使用高保真PCR酶，使用引物F2和R2扩增pET22b(+)载体片段。
[0046] 引物F2：gagctccgtcgacaagc；
[0047] 引物R2：gaattcggatccgaattaattccg；
[0048] 琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，PCR产物大小为5500bp左右，条带大小正确，使用胶回收试剂盒进行回收。
[0049] 使用商品化一步克隆试剂盒连接pET22b(+)载体片段和实施例1中获得的植酸酶突变基因或野生型植酸酶基因，16℃反应30min。将连接产物转化至E.coli BL21(DE3)感受
态细胞，涂布含50mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃倒置过夜培养，LB平板上获得单菌落约
1500个。用牙签从LB平板挑选单菌落接种于30mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37℃、
220r/min振荡培养12h，使用商品化的质粒抽提试剂盒获得野生型表达质粒。
态细胞，涂布含50mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃倒置过夜培养，LB平板上获得单菌落约
1500个。用牙签从LB平板挑选单菌落接种于30mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37℃、
220r/min振荡培养12h，使用商品化的质粒抽提试剂盒获得野生型表达质粒。
[0050] 实施例3：耐热植酸酶突变体的筛选
[0051] 步骤1：用牙签从LB平板挑选单菌落接种于96孔板，每个孔中加入150μL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基。37℃、220r/min振荡培养4h后加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱
导，12h后70℃高温处理5min，5000r/min离心5min吸取上清采用钼蓝法测定酶活。
导，12h后70℃高温处理5min，5000r/min离心5min吸取上清采用钼蓝法测定酶活。
[0052] 筛选得到酶活相对较高的8株突变体菌株，最高残留酶活为4.257U/mL，野生型对照菌株的残留酶活为1.734U/mL。将8个突变体扩增培养后提质粒测序。测序结果显示，突变
位点为：D31P、S120N、N137D、P173W、K180N、E219T、A138S/S189D、D185E/K363T。结果如下表
所示：
位点为：D31P、S120N、N137D、P173W、K180N、E219T、A138S/S189D、D185E/K363T。结果如下表
所示：
[0053] 表2.植酸酶热处理后残留酶活
[0054]
[0055]
[0056] 步骤2：根据步骤1中的突变位点以及测序结果，使用定点突变的方法构建包含两个或两个以上随机组合突变位点的突变体。以实施例2中野生型表达质粒为模板，使用高保
真PCR酶进行全质粒扩增，各个突变位点对应的引物如下：
真PCR酶进行全质粒扩增，各个突变位点对应的引物如下：
[0057] 表3.定点突变引物
[0058] 突变位点 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’)P31 caactgatgcagccggtcaccccagacgcatg catgcgtctggggtgaccggctgcatcagttg
N120 ggcagatacgtccaaccccgatccgttattta taaataacggatcggggttggacgtatctgcc
D137 tttgccaactggatgatgcgaacgtgactgacgc gcgtcagtcacgttcgcatcatccagttggcaaa
S138 ccaactggataacagcaacgtgactgacgcgatc gatcgcgtcagtcacgttgctgttatccagttgg
W173 gggtgcttaatttttggcaatcaaacttgtgcctt aaggcacaagtttgattgccaaaaattaagcaccc
N180 aaacttgtgccttaatcgtgagaaacaggacga tcgtcctgtttctcacgattaaggcacaagttt
E185 acgtgagaaacaggaagaaagctgttcattaacgc gcgttaatgaacagctttcttcctgtttctcacgt
D189 aggacgaaagctgtgatttaacgcaggcattacca tggtaatgcctgcgttaaatcacagctttcgtcct
T219 atcaatgctgacgaccatatttctcctgcaacaa ttgttgcaggagaaatatggtcgtcagcattgat
T363 cagatgcgtgataccacgccgctgtcattaaa tttaatgacagcggcgtggtatcacgcatctg
N120 ggcagatacgtccaaccccgatccgttattta taaataacggatcggggttggacgtatctgcc
D137 tttgccaactggatgatgcgaacgtgactgacgc gcgtcagtcacgttcgcatcatccagttggcaaa
S138 ccaactggataacagcaacgtgactgacgcgatc gatcgcgtcagtcacgttgctgttatccagttgg
W173 gggtgcttaatttttggcaatcaaacttgtgcctt aaggcacaagtttgattgccaaaaattaagcaccc
N180 aaacttgtgccttaatcgtgagaaacaggacga tcgtcctgtttctcacgattaaggcacaagttt
E185 acgtgagaaacaggaagaaagctgttcattaacgc gcgttaatgaacagctttcttcctgtttctcacgt
D189 aggacgaaagctgtgatttaacgcaggcattacca tggtaatgcctgcgttaaatcacagctttcgtcct
T219 atcaatgctgacgaccatatttctcctgcaacaa ttgttgcaggagaaatatggtcgtcagcattgat
T363 cagatgcgtgataccacgccgctgtcattaaa tttaatgacagcggcgtggtatcacgcatctg
[0059] 当邻近突变位点组合时，需重新设计引物合成。
[0060] 表4.定点突变引物
[0061] 突变位点 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’)D137+S138 tttgccaactggatgatagcaacgtgactgacgc gcgtcagtcacgttgctatcatccagttggcaaa
N180+E185 gtgccttaatcgtgagaaacaggaagaaagctg gctttcttcctgtttctcacgattaaggcacaagttt
E185+D189 aggaagaaagctgtgatttaacgcaggcattacca tggtaatgcctgcgttaaatcacagctttcttcct
N180+E185 gtgccttaatcgtgagaaacaggaagaaagctg gctttcttcctgtttctcacgattaaggcacaagttt
E185+D189 aggaagaaagctgtgatttaacgcaggcattacca tggtaatgcctgcgttaaatcacagctttcttcct
[0062] 实施例4：组合突变体的筛选
[0063] 将实施例3中构建好的重组质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含50mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃倒置过夜培养，用牙签从LB平板挑选单菌落接种
于30mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37℃、220r/min振荡培养12h，使用商品化的质粒
抽提试剂盒获得质粒，并测序验证，获得构建成功的突变体，与40％甘油1:1混合保存于‑80
℃。
于30mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37℃、220r/min振荡培养12h，使用商品化的质粒
抽提试剂盒获得质粒，并测序验证，获得构建成功的突变体，与40％甘油1:1混合保存于‑80
℃。
[0064] 将甘油菌划线于50mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置过夜培养，用牙签从LB平板挑选单菌落接种于含50mg/L氨苄青霉素的30mL LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养4h
后加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导12h，将发酵液5000r/min离心5min获得粗酶液。
后加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导12h，将发酵液5000r/min离心5min获得粗酶液。
[0065] 80℃高温处理上述粗酶液5min后测定酶活，以未处理粗酶液酶活为100％计算酶活残留，筛选出酶活残留最高的突变体。本实施例中野生酶经热处理后酶活为1.652U/mL，
酶活残留为32.5％，而突变位点组合为S120N/N137D/E219T的植酸酶经热处理后酶活为
3.895U/mL酶活残留为67.9％，较野生酶提高了52％。将突变位点组合为S120N/N137D/
E219T的植酸酶命名为appA‑M，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
酶活残留为32.5％，而突变位点组合为S120N/N137D/E219T的植酸酶经热处理后酶活为
3.895U/mL酶活残留为67.9％，较野生酶提高了52％。将突变位点组合为S120N/N137D/
E219T的植酸酶命名为appA‑M，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
[0066] 实施例5：植酸酶的纯化
[0067] 将appA‑M粗酶液使用20mM的乙酸钠‑乙酸缓冲液(pH 6.0)4℃透析24h，每隔4h更换新鲜缓冲液。使用阴离子交换层析柱(Hi Trap Q HP，1mL)进一步纯化，用含1M NaCl的
20mM乙酸钠‑乙酸缓冲液(pH 6.0)洗脱目的蛋白，纯化后的产物用于植酸酶性质研究。
20mM乙酸钠‑乙酸缓冲液(pH 6.0)洗脱目的蛋白，纯化后的产物用于植酸酶性质研究。
[0068] (1)最适pH：在温度37℃，将野生酶appA与突变体appA‑M分别在pH 1.0～3.5的0.25mol/L Glycine‑HCl缓冲液、pH 4.0～6.0的0.25mol/L NaAc‑Hac缓冲液、pH 6.5～7.0
的0.25mol/LTris‑HCl缓冲液中测定酶活，以本实施过程中检测到的最高酶活力为100％，
确定酶的最适pH。由图3可知，野生酶appA与突变体appA‑M的最适pH均为4.5，无明显差异。
且本申请提供的植酸酶突变体在pH3.0‑6.0均有50％以上酶活，具有广泛的pH适应范围。
的0.25mol/LTris‑HCl缓冲液中测定酶活，以本实施过程中检测到的最高酶活力为100％，
确定酶的最适pH。由图3可知，野生酶appA与突变体appA‑M的最适pH均为4.5，无明显差异。
且本申请提供的植酸酶突变体在pH3.0‑6.0均有50％以上酶活，具有广泛的pH适应范围。
[0069] (2)pH稳定性：将野生酶appA与突变体appA‑M分别置于不同pH(1.0～7.0)缓冲液(与(1)相同的缓冲液)中，37℃保温1h后，5000r/min离心5min吸取上清测定酶活，以未经处
理的酶活为100％，测试酶的pH稳定性。结果如图4所示。植酸酶突变体appA‑M，在pH4.0处理
1h后残余酶活为80.8％，较野生酶提高17.7％。
理的酶活为100％，测试酶的pH稳定性。结果如图4所示。植酸酶突变体appA‑M，在pH4.0处理
1h后残余酶活为80.8％，较野生酶提高17.7％。
[0070] (3)最适温度：在pH值5.0，将野生酶appA与突变体appA‑M分别在30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80℃测定酶活，以本实施过程中检测到的最高酶活力为100％，确定酶的
最适温度。结果如图5所示，突变体appA‑M的最适温度为65℃，相比于野生酶appA提升了5
℃。
最适温度。结果如图5所示，突变体appA‑M的最适温度为65℃，相比于野生酶appA提升了5
℃。
[0071] (4)热稳定性：将野生酶appA与突变体appA‑M分别置于不同温度(50～90℃)处理10min，冰浴20min后测定残余酶活，以未经处理的酶活力为100％，测试酶的热稳定性。由图
6可知，突变体appA‑M在90℃处理10min后仍能保持30.3％的酶活，较野生酶appA提高
27.7％，热稳定性得到很大提升。
6可知，突变体appA‑M在90℃处理10min后仍能保持30.3％的酶活，较野生酶appA提高
27.7％，热稳定性得到很大提升。
[0072] 实施例6植酸酶突变体appa‑M在制备饲料中的应用
[0073] 将appa‑M制成1万酶活酶粉，按照100g/t添加到猪禽饲料中，通过制粒机加工生产成颗粒饲料，加工条件是制粒温度85℃、湿度16～18％、蒸汽压力0.28MPa、调质时间30秒、
环膜压缩比7:1。
环膜压缩比7:1。
[0074] 综上，与野生型植酸酶appA相比，本发明筛选得到的植酸酶突变体appA‑M的耐热性得到显著提高，在90℃处理10min后仍能保持30.3％的酶活，较野生酶appA提高27.7％。
pH适应范围较野生酶更为广泛，在pH3.0‑6.0均有50％以上酶活。所述植酸酶突变体可广泛
应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过程中酶活力的损失，降低饲料成本，同时还
能降低磷排放对环境的污染。
pH适应范围较野生酶更为广泛，在pH3.0‑6.0均有50％以上酶活。所述植酸酶突变体可广泛
应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过程中酶活力的损失，降低饲料成本，同时还
能降低磷排放对环境的污染。
[0075] 对比例：
[0076] 取实施例4中构建成功的其他突变体与最终筛选得到的appA‑M(S120N/N137D/E219T)进行比较，实施方式与实施例4一致。
[0077] 如下表所示appA‑M未处理的初始酶活为5.736U/mL，明显高于S120N/N137D、S120N/E219T；80℃处理5min后，植酸酶酶活都相应降低，其中appA‑M热处理后酶活为
3.895U/mL、酶活残留为67.9％，比S120N/N137D、S120N/E219T和N137D/E219T热处理后酶活
高了45％、42％和25％，酶活残留高了32％、27％和22％。appA‑M具有初始酶活最高，热处理
后酶活最高，酶活残留最高等优势，可广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过
程中酶活力的损失。
3.895U/mL、酶活残留为67.9％，比S120N/N137D、S120N/E219T和N137D/E219T热处理后酶活
高了45％、42％和25％，酶活残留高了32％、27％和22％。appA‑M具有初始酶活最高，热处理
后酶活最高，酶活残留最高等优势，可广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过
程中酶活力的损失。
[0078] 表5.突变体植酸酶酶活及酶活残留
[0079] ‑1 ‑1突变体 未处理酶活/U·mL 热处理酶活/U·mL 酶活残留/％
S120N/N137D 4.659 2.157 46.3
S120N/E219T 4.577 2.261 49.4
N137D/E219T 5.532 2.926 52.9
appA‑M 5.736 3.895 67.9
S120N/N137D 4.659 2.157 46.3
S120N/E219T 4.577 2.261 49.4
N137D/E219T 5.532 2.926 52.9
appA‑M 5.736 3.895 67.9
[0080] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。
围应该以权利要求书所界定的为准。