草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用

摘要

本发明公开了一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用。一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。草莓MYB转录因子FvMYB24基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明克隆出草莓MYB转录因子FvMYB24基因，并通过过表达转基因拟南芥抗逆试验发现，FvMYB24与植物抗盐相关，将该基因过量表达后，其表达量增高，AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3等SOS途径主要基因表达量明显增加。可见，该FvMYB24基因在植物抗盐中将具有广泛的应用。

权利要求

1.一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因在表达AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3基因中的应用，所述草莓MYB转录因子FvMYB24基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因在拟南芥抗盐中的应用，所述草莓MYB转录因子FvMYB24基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用花序浸染法侵染植物。

说明书

草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物分子基因工程技术，尤其涉及的是一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用。

背景技术

[0002] 草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是一种具有较高的经济价值且栽培范围广的多年生草本果树，果实中含有丰富的维生素C、钾、多酚、叶酸、纤维和抗氧化剂，是一种营养价
值很高的水果，并在各个国家小浆果类的生产当中，草莓的产量和栽培面积均居于首要地
位。

[0003] 盐渍化是指水溶性盐分在土壤中或土壤中的积聚，影响农业生产，环境健康和经济效益，全球100多个国家的土壤不同程度到受盐渍化影响。草莓被认为是对盐分最敏感的
作物之一，不同的栽培品种之间其耐受性差异较大。过量的盐分会导致草莓叶片边缘烧伤
和坏死，养分失衡，产生离子毒性，果实品质和产量严重，甚至在长期盐分胁迫条件下，引起
植物死亡。我国约有15亿亩各种盐渍化土壤，另外，近年来由于设施栽培迅速普及、种植种
类过于单一以及耕种措施的不合理等因素，土壤盐渍化面积和土壤中盐含量也在逐年增
加，盐胁迫己成为影响农业生产最重要的环境胁迫因子。

[0004] 拟南芥是一种不起眼的开花植物，被用作经典植物遗传学实验的模式植物已有45年之久，用来解决植物生理学、生物化学和发育方面的问题，被誉为“植物中的果蝇”。拟南
芥因其植株小、结实多、生命周期短、基因组简单、遗传操作简便，使它广泛地用于基因研
究，在粮食增产、农作物耐逆、环境保护等领域做出了重要贡献。

[0005] 如何提高在高盐环境中生长的植物的抗盐能力，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题在于：如何提高植物的抗盐性能，提供了一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用。

[0007] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明提供了一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因的表达载体。

[0010] 本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因的宿主菌。

[0011] 本发明还提供了草莓MYB转录因子FvMYB24基因在表达AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3基因中的应用。

[0012] 一种所述的草莓MYB转录因子FvMYB24基因在植物抗盐中的应用。

[0013] 一种草莓MYB转录因子FvMYB24基因在植物抗盐中的应用，采用花序浸染法侵染植物。

[0014] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明克隆出草莓MYB转录因子FvMYB24基因，并通过过表达转基因拟南芥抗逆试验发现，FvMYB24与植物抗盐相关，将该基因过量表
达后，其表达量增高，AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3等SOS途径主要基因表达量明显增加。可见，该
FvMYB24基因在植物抗盐中将具有广泛的应用。

附图说明

[0015] 图1是在‘Hawaii4’草莓果实中克隆得到FvMYB24；

[0016] 图2是不同盐浓度的1/2MS平板上生长七天的生长量结果图；

[0017] A：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在0mM NaCl的1/2MS平板上；

[0018] B：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在75mM NaCl的1/2MS平板上；

[0019] C：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在150mM NaCl的1/2MS平板上；

[0020] D：WT种子和FvMYB24过表达T3代种子生长在200mM NaCl的1/2MS平板上；

[0021] 图3是过表达转基因拟南芥株系SOS途径主要基因的表达结果图。

具体实施方式

[0022] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施
例。

[0023] 实施例1

[0024] 以NCBI中搜索到的草莓MYB24基因序列为模板，进一步设计引物；以“Hawaii4”草莓大绿期果实的cDNA为模版，以MYB24‑F为上游引物，以MYB24‑R为下游引物，进行PCR反应，
克隆得到FvMYB24基因，转化pMD19‑T载体，提取质粒备用。本实施例使用的“Hawaii4”草莓
为安徽农业大学种质资源圃采集。

[0025] 一、转化步骤如下：

[0026] (1)连接产物转化大肠杆菌感受态：重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42℃的热击处理90s，促进吸收DNA，然后在37℃非选择LB液体(未添加抗生素)培养基中震荡培养
45min，均匀地涂布在添加氨苄青霉素(Amp)抗生素的固体培养基中37℃过夜培养。

[0027] (2)挑取单克隆，重新进行活化，即在新的含Amp抗生素的固体培养基上重新划线，每个挑取12个单克隆进行重新划线活化，37℃过夜培养。

[0028] (3)挑取菌落，按照上述PCR反应体系进行菌落PCR反应检测。

[0029] (4)根据菌落PCR结果，挑取菌落，置于添加Amp的液体LB培养基中震荡培养12h，送去上海生工生物工程有限公司测序。

[0030] 选取测序正确的单菌落，放入(20mLLB+20uLAmp)的LB液体培养基，37℃摇床摇12～16h，提质粒。

[0031] 二、提质粒步骤如下：

[0032] (1)取1～4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃尽上清。

[0033] (2)加250μL Buffer S1悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块(确认Buffer S1中已加入RNaseA)。

[0034] (3)加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4‑6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。

[0035] (4)加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转4‑6次，12000×g离心10min。

[0036] 吸取步骤(4)中的离心上清并转移到制备管(试剂盒内提供)，12000×g离心1min，弃滤液。

[0037] 将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液。

[0038] 将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液，重复一次。

[0039] 将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min。

[0040] 将制备管移入新的1.5ml中，在制备管膜中央加50～80μL Eluent或去离子水，室温静置3～5min，12000×g离心1min。

[0041] MYB24‑F：ATGGCTGGTGTTGCAAACAGTG，

[0042] MYB24‑R：TCACATCCCCTGCATGTTCCATA。

[0043] PCR体系为如表1所示：

[0044] 表1 PCR反应体系

[0045]

[0046] PCR程序为：

[0047] PCR反应条件:

[0048]

[0049] 如图1所示，‘Hawaii4’草莓果实中克隆得到FvMYB24基因序列全长852bp，编码248个氨基酸。其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0050] 实施例2

[0051] 将实施例1得到的FvMYB24基因，转化pMD19‑T载体，提取质粒；以FvMYB24‑pCXSN‑F和FvMYB24‑pCXSN‑R为扩增引物，以pMD19‑T‑FvMYB24质粒为模板进行PCR反应，回收目的基
因产物。将目的基因与pCXSN‑FLAG载体进行连接。16℃连接12h后热激法转化大肠杆菌感受
态。提取验证正确的菌株质粒，冻融法转化农杆菌GV3101。菌落PCR鉴定。

[0052] 具体如下：

[0053] 采用pCXSN‑FLAG过量表达载体进行重组构建，在FvMYB24的5’端选取20bp左右的片段设计引物，并在特异引物前加入一个碱基A，作为目标片段的上游引物；在FvMYB24的3’
端选取20bp左右的片段设计引物，作为目标片段的下游引物。引物信息如下：以MYB24‑
pMD19‑T为模板扩增得到目标片段，PCR产物经回收后，经Soultion1连接至pCXSN‑FLAG载
体，构建成目的载体。选取菌落PCR反应后正确的单克隆菌株，提取质粒并以pCXSN‑FLAG载
体自身上游引物pCXSN‑FLAG‑F和MYB24下游引物FvMYB24‑pCXSN‑R进行PCR验证。

[0054] 引物如下：

[0055] FvMYB330‑pCXSN‑F：AATGGCTGGTGTTGCAAACAG，

[0056] FvMYB330‑pCXSN‑R：TCACATCCCCTGCATGTTCC,

[0057] pCXSN‑FLAG‑F：GATTACAAGGATGATGATGAT。

[0058] PCR体系如表2所示：

[0059] 表2 PCR反应体系

[0060]

[0061] PCR程序为：

[0062] PCR反应条件：

[0063]

[0064] 农杆菌转化步骤如下：

[0065] (1)从‑80℃取出保存的感受态农杆菌于冰上融化；

[0066] (2)每100μL感受态加1μg质粒DNA混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min；

[0067] (3)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；

[0068] (4)5000rpm离心三分钟收集菌，留取50μL左右的上清轻轻吸打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天

[0069] (5)挑单菌落培养并鉴定，鉴定正确的菌液每300μL加入50％甘油700μL置于‑80℃保存。

[0070] 实施例3

[0071] 如图3所示，挑选实施例2鉴定正确的单菌落采用花序浸染法侵染拟南芥，并将收1
取的种子种在含有25mg L‑的1/2MS培养基上筛选阳性植株，使用T3代纯合转基因植株进
行抗盐试验，具体方法如下：

[0072] (1)菌液活化：吸取100μl左右菌液加入到30ml液体LB(含Kan/Rif抗生素)中，28℃，250rpm，过夜培养；

[0073] (2)继代：活化好的的菌液按1:100的比例转移到100mL的LB中，28℃，250rpm，培养至菌液的OD600＝1.0左右；

[0074] (3)将(2)中培养好的菌液分装在50mL离心管中，5000rpm，离心5min，去除液体，加入5％的蔗糖缓冲溶液重悬菌体，使菌液浓度达到OD600＝0.6；

[0075] (4)在调好浓度的50mL离心管中，加入占总体浓度0.02％的SweetL‑77，混合均匀，准备进行拟南芥侵染；

[0076] (5)侵染拟南芥：将拟南芥的花序在侵染液中浸染10s，侵染完成后将植株黑暗培养1d；一周以后进行第二次侵染；

[0077] (6)阳性植株筛选：收取的种子播种到含25mg L‑1Hyg抗生素的1/2MS培养基中，并对生长正常的植株提取DNA进行阳性鉴定，并对再次收取的种子进行重复播种，直到种植在
‑1
1/2MS培养基中(含25mg L Hyg)存活率为100％时，确定为纯化株系，一般T3代开始纯合，备
用；

[0078] (7)表型鉴定：灭菌后的T3代种子和WT种子播种于不同盐浓度的1/2MS平板上，黑暗培养2d，进行正常培养；生长7d后对植株进行拍照，如图2所示；

[0079] (8)数据测定：将T3代纯合过表达植株与野生型提RNA做荧光定量QPCR，分析相关基因在拟南芥中的表达模式。

[0080] PCR程序如表3所示：

[0081] 表3 PCR反应体系

[0082]

[0083] PCR反应条件：95℃，2min；95℃，15sec；60℃，1min(50个循环)；溶解曲线。

[0084] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。