蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用

摘要

本发明公开了蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA以及含蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA的双子叶植物表达载体pEARLEYGATE100在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用。本发明还公开了所述蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在培育耐盐紫花苜蓿中的应用。实验证实本发明所述的基因MtREVOLUTA是一个应答非生物胁迫调控基因，其能够在其近缘物种豆科饲用牧草紫花苜蓿中大量表达且转基因紫花苜蓿的耐盐能力明显增强。该转基因植株在高盐处理后存活率高于野生型紫花苜蓿SY4D。预示本发明所述蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用具有重要意义和经济价值。

权利要求

1.蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高紫花苜蓿SY4D耐受1.5％的NaCl处理存活率中的应

用，其中所述蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

说明书

蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐

性中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA的应用，尤其涉及一种蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 豆科属于双子叶植物，约650个属，18000个种，分布范围及其广泛。紫花苜蓿属于豆科植物，是世界上一种重要的多年生优质牧草，其蛋白含量高、适口性好，无论是作为牧
草、青贮还是干草，都是最为经济的饲料来源，因此，紫花苜蓿被称为“牧草之王”。

[0003] 对紫花苜蓿的耐盐机制进行研究，可为苜蓿优质新品系的遗传改良和育种提供理论基础和技术支撑。但是紫花苜蓿属于异花授粉植物，是高度杂合的同源四倍体(2n＝4x＝
32)，这使得对其开展耐盐机制研究十分困难。近期有研究报道：不同浓度的盐处理条件下，
紫花苜蓿可以适应中低浓度的盐胁迫，其中有些品种的耐盐性较强，具有在盐地推广的潜
力。尽管苜蓿对盐胁迫具有一定的耐受性，但是土地盐化日益加剧，严重影响了紫花苜蓿的
产量和品质。

[0004] 经过多国科学家十几年的研究，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)已成为豆科植物生物学和基因组学研究的模式植物。蒺藜苜蓿为二倍体(2n＝16)植物，自花授粉、基因组
小、生活周期短、遗传转化效率高，便于进行研究。因此，通过研究蒺藜苜蓿有助于揭示紫花
苜蓿的耐盐机理，加快苜蓿耐受盐胁迫调控机制的研究进程。

[0005] 植物通常含有许多miRNA，其中miR166来源于具有独立基因loci的多基因家族。miR166高度保守地靶向HD‑ZipⅢ家族基因，这些HD‑ZipⅢ家族基因中包括基因REVOLUTA
(REV)。申请人前期研究已证实：蒺藜苜蓿HD‑ZIP III基因家族成员MtREVOLUTA基因参与了
调控豆科植物的小叶片数目和叶茎比。敲除该基因，可以得到小叶片数目和叶茎比高于野
生型植株的转基因豆科植物，实验显示敲除突变体株系植株的小叶片数目由三个变为四个
或五个的比例显著提高，达到81.5％，同时叶茎比提高了约11％。并且以此成果申报了专利
“REVOLUTA基因在调控豆科植物小叶片数目和叶茎比中的应用(专利号
CN201710672282.3)”。申请人研究还证实：在过量表达MtREVOLUTA的转基因蒺藜苜蓿植株
中，MtREVOLUTA的表达水平并无显著的变化，只能通过构建突变了MtmiR166靶向位点的
MtREVOLUTA的转基因蒺藜苜蓿植株，来得到表达量显著提高的mMtREVOLUTA的转基因蒺藜
苜蓿植株，该植株虽然单个复叶的叶片增多，但整株弱小。因此，在蒺藜苜蓿中转基因表达
MtREVOLUTA的表达量会受到MtmiR166的严格调控，无法通过常规的转基因过表达改变没有
突变的MtREVOLUTA的表达量。经检索，不同于以往发现的MtREVOLUTA只负责调控叶的发育
而证实MtREVOLUTA是一个蒺藜苜蓿应答盐胁迫调控基因，且蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA能够
在其近缘物种豆科饲用牧草紫花苜蓿中呈现不同的表达水平而大量表达的文献或专利还
未见报道。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用。

[0007] 本发明所述蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用。

[0008] 其中：所述蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA是一个蒺藜苜蓿应答盐胁迫调控基因，且所述蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在其近缘物种豆科饲用牧草紫花苜蓿中大量表达能够提高紫
花苜蓿的耐盐性。

[0009] 其中：所述紫花苜蓿是中苜1号、中苜3号、公农、农菁或紫花苜蓿SY4D，进一步优选是紫花苜蓿SY4D。

[0010] 申请人将蒺藜苜蓿进行盐的非生物胁迫处理，证实基因MtREVOLUTA随着处理时间的增加，与对照相比表达量显著提高，显示基因MtREVOLUTA参与植物的盐胁迫应答，见图1
所示。

[0011] 本发明还提供了一种含蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA的双子叶植物表达载体pEARLEYGATE100在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用。

[0012] 本发明所述蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在培育耐盐紫花苜蓿中的应用，其特征在于：培育耐盐紫花苜蓿的方法是利用蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA构建双子叶植物表达载体
pEARLEYGATE100/MtREVOLUTA并转化紫花苜蓿，获得含有蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA的转基
因紫花苜蓿。

[0013] 通过将蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在紫花苜蓿中表达的实验证实，利用蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA构建双子叶植物表达载体pEARLEYGATE100/MtREVOLUTA并转化紫花苜蓿，发
现MtREVOLUTA在紫花苜蓿中表达发生显著的变化，可以大量表达，见图2所示。

[0014] 将鉴定得到的含有蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA的转基因紫花苜蓿与野生型对照紫花苜蓿SY4D，在高盐的条件下胁迫处理5周，鉴定基因MtREVOLUTA在紫花苜蓿抗逆中的作
用，发现野生型紫花苜蓿随着处理时间的延长叶片枯黄萎蔫直至死亡，而转基因紫花苜蓿
依然存活，见图3所示。

[0015] 将处理后的MtREVOLUTA转基因紫花苜蓿和野生型对照紫花苜蓿SY4D的存活率进行统计，发现MtREVOLUTA转基因紫花苜蓿相比野生型对照紫花苜蓿SY4D显著提高，见图4所
示。

[0016] 本发明中，申请人首次公开并证实蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA是一个蒺藜苜蓿应答盐胁迫调控基因，不同于以往发现的MtREVOLUTA只负责调控叶的发育，并且也确认通过蒺
藜苜蓿基因MtREVOLUTA的转基因紫花苜蓿能够改变MtREVOLUTA基因的表达水平进而提高
豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性，具备了突出的实质性特点和显著进步。进一步的，本发明公
开的蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA可广泛用于培育抗逆豆科近缘农作物新品种，并可为深入阐
明植物抗逆机制提供理论依据。

[0017] 本发明公开的蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用及提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性的方法所体现出的有益效果是：利用现有的植
物基因工程技术，本发明首次将盐胁迫应答基因蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在紫花苜蓿中转
基因表达，经过比较分析证明，蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA能够在其近缘物种豆科饲用牧草
紫花苜蓿中大量表达且MtREVOLUTA的转基因紫花苜蓿的耐盐能力明显增强。生物学重复统
计分析表明，转基因植株在高盐处理后存活率高于野生型紫花苜蓿SY4D。预示本发明所述
蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA在提高豆科近缘饲草紫花苜蓿耐盐性中的应用具有重要意义和
经济价值。

附图说明

[0018] 图1：qRT‑PCR检测MtREVOLUTA在蒺藜苜蓿转基因中对盐胁迫的应答表达量上调。

[0019] 图中0h的柱状图表示的是100mMNaCl处理前的一个月大小的野生型蒺藜苜蓿R108的叶片中MtREVOLUTA的表达量。图中12h的柱状图表示的是100mMNaCl处理后12h的一个月
大小的野生型蒺藜苜蓿R108的叶片中MtREVOLUTA的表达量。图中24h的柱状图表示的是
100mMNaCl处理后24h的一个月大小的野生型蒺藜苜蓿R108的叶片中MtREVOLUTA的表达量。
三个生物学重复；*表示P<0.05，每批植物各25棵苗。

[0020] 图2：RT‑PCR检测不同株系的35S:MtREV紫花苜蓿转基因植株叶片中的MtREVOLUTA表达量具有明显的差异，表达量高的命名为35S:MtREV#1，表达量低的命名为35S:MtREV#2。

[0021] 其中上排胶图指示的是野生型紫花苜蓿SY4D和不同株系的35S:MtREV紫花苜蓿转基因植株叶片中的MtREVOLUTA的表达量。下排胶图指示的是野生型紫花苜蓿SY4D和不同株
系的35S:MtREV紫花苜蓿转基因植株叶片中的看家基因MsActin的表达量。

[0022] 图3：盐处理一个月大小35S:MtREV#1紫花转基因扦插植株相比对照野生型紫花苜蓿SY4D扦插植株耐盐性提高。

[0023] 图中所示A、B、C、D、I、J、K、L、Q、R、S、T显示的分别是不加盐水的对照组的野生型紫花苜蓿SY4D和35S:MtREV#1紫花苜蓿转基因植株在处理前和处理开始后的1、2、3、4、5周的
生长情况。图中所示E、F、G、H、M、N、O、P、U、V、W、X显示的分别是施加1.5％NaCl盐水的处理组
的野生型紫花苜蓿SY4D和35S:MtREV#1紫花苜蓿转基因植株在处理前和处理开始后的1、2、
3、4、5周的生长情况。

[0024] 图4：t‑test统计分析显示35S:MtREV紫花苜蓿转基因植株35S:MtREV#1相对野生型SY4D盐处理后存活率显著提高。

[0025] 三个生物学重复；*表示P<0.05，每批植物各25棵苗。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作
任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变
化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

[0027] 下述实施例中，涉及的蒺藜苜蓿R108购自Noble Research Institute Mutant collections；紫花苜蓿SY4D购自Noble Research Institute Mutant collections。大肠
杆菌DH5α，农杆菌EHA105购自Shanghai Weidi Biotechnology；载体pENTR‑TOPO，表达载体
pEARLYGATE100购自Invitrogen。蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA的核苷酸序列已在专利
CN201710672282.3中公开，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0028] 其它所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从公开商业途径得到。

[0029] 实施例1：MtREVOLUTA的表达分析

[0030] (1)材料的培养

[0031] 用砂纸适度打磨蒺藜苜蓿R108种子的坚硬外皮，打破种子的休眠，在湿润的滤纸上于4℃培养一周左右，随后将萌发的种子移至育苗盘，放于培养箱里生长。培养箱环境条
‑2 ‑1
件为：长日照(16h/8h)，温度23℃，65％湿度，光照强度150mmol m s 。在育苗盘中生长两
周左右(长出第一片复叶展开叶)，移入大盆，放于温室生长。温室正常生长条件为：长日照
‑2 ‑1
(16h/8h)，温度22℃～25℃，60％‑70％湿度，光照强度150mmol m s 。培养至一个月大小
时开始进行100mM NaCl的盐处理。处理不同时间后，Trizol法提取幼苗叶RNA。

[0032] (2)RNA的提取

[0033] 准备工作：无RNase枪尖，无RNase EP管(2.0mL，加钢珠；1.5mL)，液氮，75％乙醇；桌面及离心机等需用到的仪器用70％酒精消毒；

[0034] DEPC水配制：配1000mL的DEPC处理水，加1mL DEPC，用超纯水定容到1000mL，磁力搅拌器搅拌过夜。然后高压蒸汽灭菌123℃，40min(DEPC有毒，但灭菌后分解成二氧化碳和
酒精)，尽量避免污染，4℃冷藏或室温备用。

[0035] 通过TrizoLRT提取叶片总RNA，主要步骤如下：

[0036] 1)取样品(≤100mg)放入2mL加钢珠的EP管，立即放入液氮，用研磨仪打碎，研磨仪参数：25‑30HZ 60秒；

[0037] 2)加1mL TrizoLRT，恒温混匀仪涡旋震荡，2000rpm，3min；

[0038] 3)加400μL DEPC水，恒温混匀仪涡旋震荡，2000rpm，3min；静置5min，室温12000rpm离心，15min；

[0039] 4)取上清移入1.5mL EP管(一式两份，600uL/管)，加等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min，室温12000rpm离心10min，弃上清；

[0040] 5)加800μL 75％乙醇洗涤沉淀，将沉淀轻轻弹起，4000rpm 3min室温离心；再次用75％乙醇重复洗涤沉淀，倒掉上清，瞬时离心，酒精尽量用枪尖吸尽，然后放超净工作台1～
2min，直至边缘半透明取出。

[0041] 6)加入50μL DEPC水，轻弹，60℃金属浴10min；

[0042] 7)室温放置2min，放冰上测浓度。

[0043] (3)逆转录获得cDNA

[0044] 反转录试剂盒：5×All‑In‑One RT MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)

[0045] 1)将提取好的RNA和反转录试剂盒中的冷冻试剂放在冰上，待溶解后瞬时离心，将样品收集于管底，以下所有步骤均在冰上操作；

[0046] 2)将无RNase的200μLPCR小管放在96孔冰板上，一般做三个生物学重复，一个反应总体积20μL；

[0047] 3)先将管子中加入反应体系1：

[0048]

[0049] 4)将上述反应体系1放入PCR仪中，42℃孵育2min，待反应结束后将管子置于冰上冷却；

[0050] 5)再将管子中加入反应体系2：

[0051]

[0052] 使模板与引物混合物变性，停止反应；

[0053] 6)最后将管子中加入反应体系3：

[0054]

[0055] 7)将上述总体系小心混匀，瞬时离心于管底，放入PCR仪中，反应程序如下所示：

[0056]

[0057] 反应结束后将产物放在‑20℃冰箱保存。

[0058] (4)实时荧光定量PCR

[0059] BIO‑RAD实时荧光定量PCR仪；SYBR green Mix；

[0060] 引物序列如下：

[0061] MtREV‑qF:GGAAAATGAGAGGCTGCAGAAG；MtREV‑qR:TGCTGGCGCATAAATCCAT；MtUBQ‑qF:CTGACAGCCCACTGAATTGTGA；MtUBQ‑qR:TTTTGGCATTGCTGCAAGC。

[0062] cDNA稀释到15ng/μL，作为模板；正向引物与反向引物提前混合，2.5μM

[0063] ReaL‑time PCR体系(10μL)：

[0064] SYBR               5μL

[0065] primers            2μL

[0066] cDNA模板           3μL

[0067] Real‑time PCR程序：

[0068]

[0069] 相对表达量的计算按照2‑△△CT方法进行。使用t‑test统计分析；三个生物学重复；*表示P<0.05，结果见图1。

[0070] 图1显示：qRT‑PCR检测MtREVOLUTA在蒺藜苜蓿转基因中对盐胁迫的应答表达量上调。图中0h的柱状图表示的是100mMNaCl处理前的一个月大小的野生型蒺藜苜蓿R108的叶
片中MtREVOLUTA的表达量。图中12h的柱状图表示的是100mMNaCl处理后12h的一个月大小
的野生型蒺藜苜蓿R108的叶片中MtREVOLUTA的表达量。图中24h的柱状图表示的是
100mMNaCl处理后24h的一个月大小的野生型蒺藜苜蓿R108的叶片中MtREVOLUTA的表达量。
三个生物学重复；*表示P<0.05，每批植物各25棵苗。

[0071] 实施例2：双子叶植物表达载体的构建

[0072] 扩增MtREVOLUTA特异引物序列如下：

[0073] MtREV‑F:CACCATGGCTATGGCTGTTGCAC；

[0074] MtREV‑qR:GGGGGTTTAAATCCAGCAATAGGTC。

[0075] 1)PCR体系：

[0076]

[0077]

[0078] 2)PCR程序：

[0079] 95℃5min；25～30cycles 95℃30s,60℃30s,72℃30s；72℃5min。

[0080] 3)回收连接转化

[0081] PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切割目的片段大小位置处的胶块至1.5mL EP管内。参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，DP209)说明操作进行PCR产物回收。

[0082] 将回收产物连接到pEntry‑T载体上(Thermo Fisher  Scientific，货号12536017)，通过转化的方法该质粒在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆。进行LR反应把基因
MtREVOLUTA连接到表达载体pEARLYGATE100中后提取质粒，将质粒转入农杆菌菌株EHA105
中。

[0083] 实施例3：紫花苜蓿转化及转基因植株筛选

[0084] 按以下配方配制紫花苜蓿遗传转化所需培养基。

[0085]

[0086] 1)提前配培养基灭菌，二级水、培养皿、滤纸、三角瓶、50mL离心管灭菌。

[0087] 2)农杆菌制备。遗传转化实验前两天，挑取实施例2所述转化成功的农杆菌单克隆或农杆菌stock，用2mL LB液体培养基加载体对应的抗生素，置于摇床200rpm 28℃过夜。

[0088] 3)将100μL摇起的农杆菌液进行扩繁，将其置于30‑50mL液体培养基(含相应的抗生素)，200rpm28℃过夜培养，农杆菌菌液OD600nm约0.8‑1.0。

[0089] 4)紫花苜蓿SY4D叶片表面灭菌。选择年轻且完全展开的健康叶片用于遗传转化实验。取下的叶片置于冰上带回实验室。若用超声波法，取一个完整复叶；如果要切叶盘，则取
单个叶片。

[0090] 5)消毒。将取回的叶片放置在50mL带盖离心管(叶片不要太多，过多会导致灭菌不完全)。加入30％次氯酸钠溶液与1‰Tween‑20，上下颠倒离心管数次，保证每片叶被浸润
后，置水平摇床低速水平震荡15min(7分钟时换一次新的次氯酸钠溶液)。倒掉次氯酸钠溶
液，换清水洗3‑4遍。清洗后将叶片放置于灭菌后的滤纸上吸掉多余的水分。

[0091] 6)外植体接种菌液与共培养。将菌液在4000rpm离心10min，倒掉上清，用SM4液体培养基轻柔重悬并稀释菌液至OD600nm 0.2。

[0092] 7)切叶盘：将无菌叶片置于灭菌的培养皿，用锋利的无菌刀片将叶缘切掉，切成四方形叶盘。切的过程中，要注意防止叶片过分干燥。

[0093] 8)农杆菌侵染：将切下的叶盘放入农杆菌SM4液体培养基中。轻柔震荡让叶盘彼此不会叠在一起。

[0094] 9)抽真空：将放入叶盘的农杆菌SM4溶液0.5Mbar抽真空10min。为避免对细胞的损伤，真空的开关应缓慢进行。再慢摇5‑10min。

[0095] 10)在超净工作台中，将菌液吸掉，将侵染后的叶片转移到灭过菌的滤纸上吸掉叶片周围多余的菌液，但注意避免工作台中的风把叶片吹得过于干燥。将上述步骤的叶片转
移至SM4固体培养基(含1mLcefo)。尽量让叶盘的下表面接触培养基。

[0096] 11)5‑7天后，将叶盘转移至含有载体相应抗性抗生素的SM4固体培养基(加cefo 500mg/L，同时加筛选抗生素如Kan 50mg/L,PPT 3mg/L,hyg 10mg/L)，在植物培养箱中24℃
暗培养4‑6周。

[0097] 12)当愈伤组织足够大(一般SM4筛选培养基放4‑5周)，转到再生培养基MSBK上，培养2周。

[0098] 13)转到伸长培养基MSS直到植株长大，一般6‑8周。

[0099] 14)将植株转到培养瓶中，培养基为MSR。待幼苗生根后，将健壮的植株移到土里。

[0100] 15)蒺藜苜蓿DNA提取。提前配制2×CTAB(pH8.0)提取液(1L)：

[0101]

[0102] 注意：首先定容至1L，再加CTAB粉末，搅拌溶解后可置于65℃烘箱加速溶解，室温保存。

[0103] 16)对提取紫花苜蓿的基因组DNA，使用载体引物GCACAATCCCACTATCCTTC和基因反向引物进行PCR扩增检测。提取上述阳性的转基因植株和野生植株的RNA反转cDNA进行使用
基因正向引物TACACTGCTGAACAGATTGAAG和基因反向引物ACCAGGCTTCATCCCAGGCATC进行RT‑
PCR检测，结果见图2。

[0104] 内参使用MsACTIN‑F：TTTGAGACTTTCAATGTGCCCGCC和MsACTIN‑R：TAGCATGTGGGAGTGCATAACCCT。

[0105] 结果见图2。

[0106] 图2显示：RT‑PCR检测不同株系的35S:MtREV紫花苜蓿转基因植株叶片中的MtREVOLUTA表达量具有明显的差异，表达量高的命名为35S:MtREV#1，表达量低的命名为
35S:MtREV#2。其中上排胶图指示的是野生型紫花苜蓿SY4D和不同株系的35S:MtREV紫花苜
蓿转基因植株叶片中的MtREVOLUTA的表达量。下排胶图指示的是野生型紫花苜蓿SY4D和不
同株系的35S:MtREV紫花苜蓿转基因植株叶片中的看家基因MsActin的表达量。

[0107] 实施例4：35S:MtREV紫花转基因扦插幼苗耐盐性分析

[0108] 将野生植株和转基因植株35S:MtREV紫花扦插，挑选扦插存活状态一致的小苗各25棵，培养一个月，将小盆的幼苗使用高盐1.5％NaCl处理5周，生物重复三次，统计存活率。

[0109] 结果见图3和图4。

[0110] 图3显示：盐处理一个月大小35S:MtREV#1紫花转基因扦插植株相比对照野生型紫花苜蓿SY4D扦插植株耐盐性提高。图中所示A、B、C、D、I、J、K、L、Q、R、S、T显示的分别是不加
盐水的对照组的野生型紫花苜蓿SY4D和35S:MtREV#1紫花苜蓿转基因植株在处理前和处理
开始后的1、2、3、4、5周的生长情况。图中所示E、F、G、H、M、N、O、P、U、V、W、X显示的分别是施加
1.5％NaCl盐水的处理组的野生型紫花苜蓿SY4D和35S:MtREV#1紫花苜蓿转基因植株在处
理前和处理开始后的1、2、3、4、5周的生长情况。

[0111] 图4显示：t‑test统计分析显示35S:MtREV紫花苜蓿转基因植株35S:MtREV#1相对野生型SY4D盐处理后存活率显著提高。三个生物学重复；*表示P<0.05，每批植物各25棵苗。