用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其应用

摘要

本发明提供一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其应用，所述探针长度为20‑40 nt，与靶RNA序列严格互补配对，且与其他非靶RNA不存在连续超过15 nt的互补配对，探针的Tm值不低于80℃，自身互补值小于5，探针的3’‑OH利用修饰的脱氧核糖核苷酸进行封闭。本发明利用逆转录阻碍探针法在一链cDNA合成时实现对靶RNA的逆转录进行高效率高特异性的抑制，从而阻碍靶RNA参与下游建库过程。本发明具有操作简单（一步操作）、耗时极短（2 min）、对非靶RNA保留完整、特异性强、效率高、成本低和基因检出数高等优点，非常适合用于工业自动化建库和疾病快速诊断领域。

权利要求

1.一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，其特征在于：所述靶RNA为

5.8S rRNA，探针为下表所示的NGS 5.8S rRNA probe的混合物：　序号 序列名称 5’‑3’

1 NGS 5.8S rRNA probe‑1 TCATCGACGCACGAGCCGAG 2 NGS 5.8S rRNA probe‑2 CGATGATCAATGTGTCCTGCAA 3 NGS 5.8S rRNA probe‑3 CAGGCGTAGCCCCGGGAGGAAC其中所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3’端‑NH2C6封闭。

2.一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，其特征在于：所述靶RNA为

18S rRNA，探针为下表所示的NGS 18S rRNA probe的混合物：　序号 序列名称 5’‑3’

1 NGS 18S rRNA probe‑1 TGCATGGCTTAATCTTTGAGACA

2 NGS 18S rRNA probe‑2 ATAACTGATTTAATGAGCCATT

3 NGS 18S rRNA probe‑3 AGCTCTAGAATTACCACAGTT

4 NGS 18S rRNA probe‑4 GATCTGATAAATGCACGCATC

5 NGS 18S rRNA probe‑5 CAAAGCCGCCGGCGCCCGCC

6 NGS 18S rRNA probe‑6 TCGAATGGGTCGTCGCCGCCA

7 NGS 18S rRNA probe‑7 GTCACCCGTGGTCACCATGGT 8 NGS 18S rRNA probe‑8 CCTTGGATGTGGTAGCCGTTT 9 NGS 18S rRNA probe‑9 TTATTTTTCGTCACTACCTCC 10 NGS 18S rRNA probe‑10 GTTAAAGGATTTAAAGTGGACTC 11 NGS 18S rRNA probe‑11 TTAATATACGCTATTGGAGC 12 NGS 18S rRNA probe‑12 GACCGCCCGCCCGCTCCCAA 13 NGS 18S rRNA probe‑13 CAGCTAAGAGCATCGAGGGG 14 NGS 18S rRNA probe‑14 TTGAACACTCTAATTTTTTCA 15 NGS 18S rRNA probe‑15 AAATAGAACCGCGGTCCTATT 16 NGS 18S rRNA probe‑16 GCGGCGCAATACGAATGCCCCC 17 NGS 18S rRNA probe‑17 GGCAAATGCTTTCGCTCTGGT 18 NGS 18S rRNA probe‑18 GAACTACGACGGTATCTGATC 19 NGS 18S rRNA probe‑19 GCCCGGCGGGTCATGGGAATA 20 NGS 18S rRNA probe‑20 TTTAAGTTTCAGCTTTGCAA 21 NGS 18S rRNA probe‑21 GTTGAGTCAAATTAAGCCGC 22 NGS 18S rRNA probe‑22 AGAAAGAGCTATCAATCTGTCA 23 NGS 18S rRNA probe‑23 CGGAATTAACCAGACAAATC 24 NGS 18S rRNA probe‑24 ACGCCGACCGCTCGGGGGTC 25 NGS 18S rRNA probe‑25 ACAGACCTGTTATTGCTCAAT 26 NGS 18S rRNA probe‑26 ACACGCTGAGCCAGTCAGTGT 27 NGS 18S rRNA probe‑27 TCCCCGATCCCCATCACGAA 28 NGS 18S rRNA probe‑28 CGCAAGCTTATGACCCGCACTTA 29 NGS 18S rRNA probe‑29 CATCCAATCGGTAGTAGCGACGGG 30 NGS 18S rRNA probe‑30 GTCTTCTCAGCGCTCCGCCAGG 31 NGS 18S rRNA probe‑31 CCTACGGAAACCTTGTTACGAC所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3’端‑NH2C6封闭。

3.一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，其特征在于：所述靶RNA为

28S rRNA，探针为下表所示的NGS 28S rRNA probe的混合物：　序号 序列名称 5’‑3’

 1 NGS 28S rRNA probe‑1 CCGTTACTGAGGGAATCCTGGTT 2 NGS 28S rRNA probe‑2 CATGTCCCGCGCCCCGCCGCGG 3 NGS 28S rRNA probe‑3 AGAAGGACTTGGGCCCCCCA 4 NGS 28S rRNA probe‑4 CGGGCCCGGCGCGCCGGGGGCC 5 NGS 28S rRNA probe‑5 GGAGTTTACCACCCGCTTTGG 6 NGS 28S rRNA probe‑6 TCTTTTCAACTTTCCCTTACGGT 7 NGS 28S rRNA probe‑7 ACCCCACCCGTTTACCTCTTAACG 8 NGS 28S rRNA probe‑8 GGGCCGCCGACACGGCCGGA 9 NGS 28S rRNA probe‑9 GGGGGAAGGGAGGGCGGGTG 10 NGS 28S rRNA probe‑10 GGCCCCGCCCGCCCACCCCCGCA 11 NGS 28S rRNA probe‑11 ATGCGCCCGGCGGCGGCCGGTC 12 NGS 28S rRNA probe‑12 GGCCTTCCCAGCCGTCCCGGAG 13 NGS 28S rRNA probe‑13 CCGAGGGAGGACGCGGGGCC 14 NGS 28S rRNA probe‑14 CCGCCGCCGCCGCCCCGACCCGC 15 NGS 28S rRNA probe‑15 GGGGGGCTGTAACACTCGGG 16 NGS 28S rRNA probe‑16 GGGGAGAGCGCGGCGACGGG 17 NGS 28S rRNA probe‑17 GGGGGAGACCCCCCTCGCGGG 18 NGS 28S rRNA probe‑18 CGCCGTGGGAGGGGTGGCCCGG 19 NGS 28S rRNA probe‑19 CCGACCCGCGCGCGGCACCC 20 NGS 28S rRNA probe‑20 CCCCGGGCCCGACGGCGCGAC 21 NGS 28S rRNA probe‑21 CGACCCCGTGCGCTCGCTCCGC 22 NGS 28S rRNA probe‑22 TGTTAGACTCCTTGGTCCGTG 23 NGS 28S rRNA probe‑23 GGCGAGCGCGCCGGCCTTCAC 24 NGS 28S rRNA probe‑24 GCCGGTGGTGCGCCCTCGGCG 25 NGS 28S rRNA probe‑25 TTCACCATCTTTCGGGTCCTAA 26 NGS 28S rRNA probe‑26 CCAGAGTTTCCTCTGGCTTCGC 27 NGS 28S rRNA probe‑27 GCCAGCTATCCTGAGGGAAA 28 NGS 28S rRNA probe‑28 TGAGATCGTTTCGGCCCCAAG 29 NGS 28S rRNA probe‑29 AAGTGGCCCACTAGGCACTCGC 30 NGS 28S rRNA probe‑30 TCAACCAACACCTTTTCTGGGG 31 NGS 28S rRNA probe‑31 AGGGCTAGTTGATTCGGCAGGT 32 NGS 28S rRNA probe‑32 CCACACGCGCGCGCGCGCGCGC 33 NGS 28S rRNA probe‑33 GCGGGAGGAGGGGAGGAGGCGT 34 NGS 28S rRNA probe‑34 GCGCCCTAGGCTTCAAGGCTC 35 NGS 28S rRNA probe‑35 CTTCGGCCTTCAAAGTTCTCGTT 36 NGS 28S rRNA probe‑36 GGGCAACGGAGGCCATCGCCC 37 NGS 28S rRNA probe‑37 ACCGCACTGGACGCCTCGCGG 38 NGS 28S rRNA probe‑38 CTCTCTCGGGGCGAACCCATTCC 39 NGS 28S rRNA probe‑39 CTCTCCCCCGGATTTTCAAGGGCC 40 NGS 28S rRNA probe‑40 CTTGCCGACTTCCCTTACCTACATT 41 NGS 28S rRNA probe‑41 CGCCCAGCCCCGCTTCGCGCC 42 NGS 28S rRNA probe‑42 GGGAGGGAGCGAGCGGCGCGC 43 NGS 28S rRNA probe‑43 CCGCCCCCACGCGGCGCTCC 44 NGS 28S rRNA probe‑44 CGGGTGCCCGGGCCCCCCTC 45 NGS 28S rRNA probe‑45 CGGCCGCGACGCCCGCCGCAGC 46 NGS 28S rRNA probe‑46 GCCGCCCGACCGCTCCCCGCC 47 NGS 28S rRNA probe‑47 AACGGGGGGCGGACGGGGCC 48 NGS 28S rRNA probe‑48 CGCGGAACCGCGGCCCCGGG 49 NGS 28S rRNA probe‑49 TTAATTAAACAGTCGGATTCC 50 NGS 28S rRNA probe‑50 CGTTTACCCGCGCTTCATTGA 51 NGS 28S rRNA probe‑51 CGTTCATCCATTCATGCGCGT 52 NGS 28S rRNA probe‑52 ACTAGAGTCAAGCTCAACAGGGT 53 NGS 28S rRNA probe‑53 CCCCTCGCGGGGACACCGGG 54 NGS 28S rRNA probe‑54 GCGAGAGCCCCTCGGGGCTCGC 55 NGS 28S rRNA probe‑55 AACTCCCCACCTGGCACTGTC 56 NGS 28S rRNA probe‑56 AAGCGAGCTTTTGCCCTTCT 57 NGS 28S rRNA probe‑57 CCTCCTGCTTAAAACCCAAAA 58 NGS 28S rRNA probe‑58 CAATGATAGGAAGAGCCGACA 59 NGS 28S rRNA probe‑59 CCTGTCTCACGACGGTCTAA 60 NGS 28S rRNA probe‑60 CCTCAGCCAAGCACATACACCA 61 NGS 28S rRNA probe‑61 TGCCGTATCGTTCCGCCTGGGC 62 NGS 28S rRNA probe‑62 TCCCGCGCGCGCGGGGCGCGT 62 NGS 28S rRNA probe‑63 GCCGCGCCCCGTTTCCCAGGA 63 NGS 28S rRNA probe‑64 ACGTACGAAACCCCGACCCAG所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3’端‑NH2C6封闭。

4.一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，其特征在于：所述探针包括权利要求1所述的NGS 5.8S rRNA probe的混合物，以及权利要求2所述的NGS 18S rRNA probe的混合物，以及权利要求3所述的NGS 28S rRNA probe的混合物。

5.权利要求1‑4所述的逆转录阻碍探针在RNA建库中快速去除靶RNA的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其步骤包括：

（1）提取样本中的总RNA，在总RNA中加入逆转录阻碍探针和buffer，进行梯度退火反应；

（2）在反应产物中加入链特异性合成buffer和一链cDNA合成酶混合物，进行逆转录反应合成cDNA；

（3）二链cDNA合成及末端修复、接头连接、文库扩增及测序。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤（1）中梯度退火条件为：95℃ 5 min，

75℃ 1 min，55℃ 1 min，4 ℃ 保存。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤（2）中合成反应条件为：25℃ 10 min， 

42℃ 15 min，70℃ 15 min，4℃ 保存。

说明书

用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其应用

技术领域

[0001] 本发明专利涉及用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 近年来，随着二代测序技术的快速发展，各类RNA建库技术和测序技术层出不穷并且迭代升级，大大地降低了RNA建库和测序的难度和成本，这也使得RNA二代测序技术成为
生命进展和疾病诊断等领域的重要研究手段。但是，不同来源的样本中的RNA种类占比具有
极大的不均一性，如正常细胞中核糖体rRNA约占总RNA的90%‑95%，血液中球蛋白的mRNA约
占总mRNA的76%以上，这些RNA的存在占据了大部分的测序数据，严重影响到低丰度RNA的检
测，提高了测序的成本。

[0003] 现在主要有两类策略来去除这些在RNA建库过程中不需要的高丰度RNA。第一类策略为磁珠捕获法。比如polyA富集法，利用oligo(dT)磁珠来捕获富集含有polyA的mRNA，这
种方法只适用于完整性较好的RNA，能够捕获的RNA种类有限，大大降低了测序的多样性，而
且这种方法对polyA长度越长的RNA存在捕获效率越高，会造成RNA建库的偏好性；或者靶
RNA捕获去除法，利用带有biotin修饰的反义DNA探针与靶RNA杂交后，用链亲和霉素磁珠对
靶RNA进行去除。另一类种策略为核酸酶降解法。比如RNase H切割去除法，利用RNase H特
异性识别并降解DNA:RNA杂交链中RNA的活性对靶RNA进行降解；或者CRISPR/Cas9切割法，
利用sgRNA‑Cas9系统对构建好的双链DNA文库中靶RNA来源的双链DNA进行切割。这些方法
存在成本高、操作复杂（约20‑40步）、耗时长（约2h）、对样本来源和RNA丰度要求高、试剂难
以储存等缺陷，严重阻碍了RNA二代测序建库技术的工业自动化发展和其在疾病快速诊断
领域的应用。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，可以快速去除RNA建库中的rRNA。

[0005] 本发明采用的技术方案为：

[0006] 一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针，所述探针长度为20‑30 nt，与靶RNA序列严格互补配对，且与其他非靶RNA不存在连续超过15 nt 的互补配对，探针
的Tm值不低于80℃，自身互补（Self complementarity）值小于5，探针的3’‑OH利用修饰的
脱氧核糖核苷酸进行封闭；所述探针有多个，探针覆盖靶RNA区域不低于全长RNA的1/6，探
针在靶RNA上分布均匀，探针之间的距离不超过100 nt。

[0007] 优选的，所述探针的脱氧核糖核苷酸包括一种或多种修饰，每种修饰的数量为1个或多个，修饰种类包括但不限于肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、脱氧尿嘧啶核苷酸（dU）、MGB
（核酸小沟嵌合物）、2‑O‑甲基核糖、5‑羟基丁酸酰基‑脱氧尿苷、2‑氨基脱氧腺苷和5‑甲基
脱氧胞苷修饰，使得探针的Tm值在80℃‑95 ℃之间。

[0008] 优选的，所述修饰的位置靠近 探针的5’端，至少50%所述修饰的位置应处在探针5’端的前三分之一区域。

[0009] 优选的，探针长度为20‑30 nt，且与其他非靶RNA不存在连续超过10 nt的互补配对，自身互补值小于3。

[0010] 优选的，探针覆盖靶RNA区域不低于全长RNA的1/3，探针之间的距离不超过30 nt。

[0011] 所述靶RNA为5.8S rRNA，探针为表1所示的5.8S rRNA probe的混合物。

[0012] 所述靶RNA为18S rRNA，探针为表1所示的18S rRNA probe的混合物。

[0013] 所述靶RNA为28S rRNA，探针为表1所示的28S rRNA probe的混合物。

[0014] 本发明还公开了上述的逆转录阻碍探针在RNA建库中快速去除靶RNA的应用。

[0015] 优选的，其步骤包括：

[0016] （1）提取样本中的总RNA，在总RNA中加入逆转录阻碍探针和buffer，进行梯度退火反应；

[0017] （2）在反应产物中加入链特异性合成buffer和一链cDNA合成酶混合物，进行逆转录反应合成cDNA；

[0018] （3）二链cDNA合成及末端修复、接头连接、文库扩增及测序。

[0019] 优选的，所述步骤（1）中梯度退火条件为：95℃ 5 min，75℃ 1 min， 55℃ 1 min， 4 ℃ 保存。

[0020] 优选的，所述步骤（2）中合成反应条件为：25℃ 10 min， 42℃ 15 min，70℃ 15 min，4℃ 保存。

[0021] 本发明利用逆转录阻碍探针法在一链cDNA合成时实现对靶RNA的逆转录进行高效率高特异性的抑制，从而阻碍靶RNA参与下游建库过程。本发明具有操作简单（一步操作）、
耗时极短（2 min）、对非靶RNA保留完整、特异性强、效率高、成本低和基因检出数高等优点，
非常适合用于工业自动化建库和疾病快速诊断领域。

附图说明

[0022] 图1为逆转录阻碍探针法示意图。

[0023] 图2为逆转录阻碍探针对5.8S rRNA逆转录合成的抑制示意图。

[0024] 图3为qPCR法鉴定不同修饰种类探针对逆转录的抑制作用。

[0025] 图4为qPCR法鉴定探针中LNA的分布位置对靶RNA逆转录的抑制效果。

[0026] 图5为qPCR法鉴定不同长度LNA修饰探针对靶RNA逆转录的抑制效果。

[0027] 图6为qPCR法鉴定不同浓度LNA修饰探针对靶RNA逆转录的抑制效果。

[0028] 图7为梯度退火下全覆盖逆转录阻碍探针竞争结合靶RNA作用原理示意图。

[0029] 图8为全覆盖NGS 5.8S rRNA probe mix 作用位点示意图（阴影代表探针靶位置，斜体加粗代表LNA修饰碱基对于的靶位点）。

[0030] 图9为qPCR法鉴定全覆盖逆转录阻碍探针对5.8S rRNA逆转录合成的抑制作用。

[0031] 图10为qPCR法鉴定全覆盖逆转录阻碍探针对18S rRNA逆转录合成的抑制作用。

[0032] 图11为 qPCR法鉴定全覆盖逆转录阻碍探针对28S rRNA逆转录合成的抑制作用。

[0033] 图12为 逆转录阻碍探针法在NGS建库过程中快速去除靶RNA原理示意图（仅需2min）。

[0034] 图13为NGS RNA建库过程中三种去除rRNA方法的示意图。

[0035] 图14为qPCR验证三种去除rRNA方法的效果。

[0036] 图15为RNA‑seq比较三种去除rRNA方法的效果。

[0037] 图16为四种建库方法测序相关性。

[0038] 图17为同等测序深度下四种建库方法基因检出数。

具体实施方式

[0039] 下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。

[0040] 实施例1

[0041] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。本实施例所使
用的探针和引物序列及修饰如表1所示，N为随机碱基，即A、T、C、G中任意一种碱基，Random 
Hexamers为用于逆转录的通用引物。

[0042] 图1和图2展示了本发明的反应机理：利用强结合能力的碱基修饰逆转录阻碍探针（如LNA，PNA等，并且探针的3’端被NH2C6封闭），使得逆转录阻碍探针能够优先锁定靶RNA，
阻止逆转录酶通过逆转录阻碍探针锁定的靶RNA位点，从而达到在逆转录过程中去除靶RNA
的目的。

[0043] 表1 探针及引物序列

[0044]

[0045]

[0046]

[0047]

[0048] 其中序列117‑126为RT‑qPCR的定量引物。序号为1‑112的探针是根据人/小鼠/大鼠的rRNA设计的，可适用于人、小鼠或大鼠的RNA建库。

[0049] 实施例1：不同修饰种类探针对靶RNA逆转录的抑制作用

[0050] 参照图2，本实施例设计带有不同修饰的5.8S特异性探针（表1序号1‑5），实现对5.8S rRNA逆转录过程的抑制。实施例中采用的Total RNA系按常规方法从培养的Human 
293FT cell（GM‑070006H，购自吉满生物科技(上海)有限公司）细胞提取，以下同。具体实施
方式如下：

[0051] 表2

[0052] 组分 用量Total RNA 1 μg
1 μM 5.8S修饰探针（表1序号1‑5中任一个） 1 μL
1 μM 5.8S rRNA RT primer 1 μL
10 mM dNTPs mix 1 μL
补DEPC H2O至 13 μL

[0053] 混匀后瞬离。85 °C 5 min，立即置于冰上5 min。

[0054] 表3

[0055] 组分 用量5X Reverse transcriptase buffer 4 μL
Murine RNase Inhibitor (40 U/µL, Yeasen, 10603ES05) 2 μL
Hifair® V Reverse Transcriptase (200 U/μL, Yeasen, 11300ES92) 1 μL
总体积 20 μL

[0056] 混匀后瞬离。25 °C 10 min， 42 °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C hold；

[0057] 稀释1000倍后，用Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (11200ES03) 对5.8S cDNA进行定量，定量引物见表1。定量结果见图3。

[0058] 从定量结果可以看出，肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、脱氧尿嘧啶（dU）、DNA小沟结合物（MGB）和2‑氧甲基（2’‑O‑Me）修饰探针都能够有效抑制靶RNA的逆转录，其中LNA探针抑制
逆转录的效果最好（见表4）。

[0059] 表4：不同5.8s rRNA探针投入量对靶RNA逆转录的抑制效率

[0060] 探针修饰种类 PNA LNA dU MGB 2’‑O‑Me逆转录抑制效率（%） 94.793 96.651 80.655 78.085 65.532

[0061] 实施例2： 探针中LNA的分布位置对靶RNA逆转录的抑制效果

[0062] 本实施例设计不同LNA修饰位置的5.8S特异性探针（表1序号6‑8），实现对5.8S rRNA 逆转录过程的抑制。具体实施方式参照例1，定量结果见图4。

[0063] 从定量结果可以看出，当探针中LNA的位置靠近探针的左端（即5’端），对靶RNA逆转录的阻碍效果要高于探针中LNA的位置靠近探针的右端（即3’端）。

[0064] 表5：探针中LNA分布位置对靶RNA逆转录的抑制效率

[0065]探针中LNA修饰位置分布 Left Middle Right
逆转录抑制效率（%） 98.416 97.610 96.904

[0066] 实施例3： 不同长度LNA修饰探针对靶RNA逆转录的抑制效果

[0067] 本实施例设计不同长度的带有LNA修饰的5.8S特异性探针（表1序号9‑14），实现对5.8S rRNA 逆转录过程的抑制。具体实施方式参照例1，定量结果见图5。

[0068] 从定量结果可以看出，当LNA探针长度在20‑25 nt时，对靶RNA逆转录过程的抑制效果最好。

[0069] 表6：不同长度LNA修饰探针对靶RNA逆转录的抑制效率

[0070] 不同长度LNA探针 15 nt 20 nt 25 nt 30 nt 35 nt 40 nt逆转录抑制效率（%）96.541 97.554 97.637 97.235 96.861 95.672

[0071] 实施例4：不同浓度LNA探针对靶RNA逆转录的抑制效果

[0072] 参照图2，本实施例利用不同浓度的带有LNA修饰的5.8S特异性探针（表1序号16），实现对5.8S rRNA 逆转录过程的抑制。具体实施方式参照例1，定量结果见图6。

[0073] 从定量结果可以看出，本方法使用的锁核酸修饰探针能够有效抑制靶RNA的逆转录，当探针投入量达到4 μM时，5.8S rRNA的逆转录抑制效率能达到99.81%（见表4）。

[0074] 表7：不同浓度LNA探针对靶RNA逆转录的抑制效率

[0075]探针浓度 1 μM 2 μM 4 μM 8 μM 16 μM
逆转录抑制效率（%） 96.572 99.251 99.819 99.947 99.976

[0076] 实施例5：5.8S全覆盖逆转录阻碍探针对随机引物结合的竞争作用和一链cDNA合成的抑制作用

[0077] 参照图7和图8，本实施例利用5.8S特异性LNA修饰探针（表1序号15‑17混合物）高Tm值高结合能力的特点，通过梯度退火的方式保证探针比随机引物优先结合到靶RNA上，实
现对5.8S rRNA逆转录高效特异性的抑制。具体实施方式如下：

[0078] 表8

[0079] 组分 用量Total RNA 1 μg
NGS 5.8S rRNA probe mix 1 μL
50 μM Random Hexamers 1 μL
10 mM dNTPs mix 1 μL
补DEPC H2O至 13 μL

[0080] 混匀后瞬离。85 °C 5 min，75  °C 2 min，70  °C 2 min，65 °C 2 min，60  °C 2 min，55 °C 2 min，37 °C 2 min，25 °C 5 min，4 °C hold；

[0081] 表9

[0082] 组分 用量5X Reverse transcriptase buffer 4 μL
Murine RNase Inhibitor (40 U/µL, Yeasen, 10603ES05) 2 μL
Hifair® V Reverse Transcriptase (200 U/μL, Yeasen, 11300ES92) 1 μL
总体积 20 μL

[0083] 混匀后瞬离。25 °C 10 min， 42 °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C hold；

[0084] 稀释1000倍后，用Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (11200) 对5.8S、18S、28S、Actin和Gapdh cDNA进行定量，定量引物见表1，定量结果见图9。

[0085] 从定量结果可以看出，本方法中的梯度退火能够有效保证高Tm值的逆转录阻碍探针优先于随机引物结合到靶RNA上，进而抑制靶RNA的逆转录，且对其他非靶RNA的逆转录影
响很小。当探针投入量达到4 μM时，5.8S rRNA的逆转录抑制效率能达到99.75%（见表10）。

[0086] 表10：不同投入量5.8S逆转录阻碍探针竞争结合靶RNA和抑制逆转录的效率

[0087] 5.8S 逆转录阻碍探针投入量 1 μM 2 μM 4 μM 8 μM 16 μM5.8S rRNA逆转录抑制效率（%）92.982 98.791 99.757 99.936 99.976
18S rRNA逆转录抑制效率（%） ‑1.182 3.673 ‑2.831 4.657 ‑4.439
28S rRNA逆转录抑制效率（%） 0.207 6.234 9.243 11.228 5.909
Actb RNA逆转录抑制效率（%） ‑9.445 ‑8.56 ‑29.672 ‑32.300 ‑40.789
Gapdh RNA逆转录抑制效率（%）0.296 2.337 17.242 3.489 0.224

[0088] 实施例6：18S和28S全覆盖逆转录阻碍探针对随机引物结合的竞争作用和一链cDNA合成的抑制作用

[0089] 按照实施例5的方法，本实施例利用18S（表1序号序列18‑48混合物）或28S（表1序号序列49‑112混合物）特异性修饰探针高Tm值高结合能力的特点，通过梯度退火的方式保
证探针比随机引物优先结合到靶RNA上，实现对18S 或28S rRNA逆转录高效特异性的抑制。
探针序列和引物见表1，定量结果见图10和图11。

[0090] 从定量结果可以看出，本方法中设计的逆转录阻碍探针能够高效地阻碍18S和28S rRNA的逆转录。当探针混合物（Probe Mix）投入量达到4 μM时，18S rRNA的逆转录抑制效率
能达到99.99%，28S rRNA的逆转录抑制效率能达到99.97%。由于18S rRNA和28S rRNA在总
RNA占比太大，抑制其逆转录后，其他RNA的逆转录效率有轻微升高（见表11和表12）。

[0091] 表11：不同投入量18S逆转录阻碍探针竞争结合靶RNA和抑制逆转录的效率

[0092] 18S 逆转录阻碍探针投入量 1 μM 2 μM 4 μM 8 μM 16 μM5.8S rRNA逆转录抑制效率（%）4.667 ‑12.831 ‑11.269 8.086 ‑4.470
18S rRNA逆转录抑制效率（%） 97.794 99.875 99.998 99.999 100.000
28S rRNA逆转录抑制效率（%） 14.561 23.794 20.617 14.862 17.740
Actb RNA逆转录抑制效率（%） ‑44.758 ‑44.233 ‑49.645 ‑56.978 ‑65.675
Gapdh RNA逆转录抑制效率（%）‑59.252 ‑40.370 ‑58.555 ‑70.790 ‑64.341

[0093] 表12：不同投入量28S逆转录阻碍探针竞争结合靶RNA和抑制逆转录的效率

[0094] 28S 逆转录阻碍探针投入量 1 μM 2 μM 4 μM 8 μM 16 μM5.8S rRNA逆转录抑制效率（%）5.960 11.095 14.430 11.095 6.952
18S rRNA逆转录抑制效率（%） 2.376 11.182 14.349 11.182 16.748
28S rRNA逆转录抑制效率（%） 96.578 99.763 99.974 99.763 99.998
Actb RNA逆转录抑制效率（%） ‑137.377 ‑153.060 ‑176.446 ‑153.060 ‑183.556
Gapdh RNA逆转录抑制效率（%）‑205.176 ‑211.855 ‑234.900 ‑211.855 ‑216.766

[0095] 实施例7：三种rRNA探针混合物不同退火条件对随机引物结合的竞争作用和一链cDNA合成的抑制作用

[0096] 本实施例验证了不同退火条件下探针对靶RNA的一链cDNA合成的抑制效果，具体实施方式如下：

[0097] 表13

[0098]组分 用量
Total RNA 1 μg
4 μM NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix 1 μL
50 μM Random Hexamers 1 μL
10 mM dNTPs mix 1 μL
补DEPC H2O至 13 μL

[0099] 吹打混匀后瞬离。

[0100] 条件1：85 °C 5 min，75 °C 2 min，70  °C 2 min，65  °C 2 min，60 °C 2 min，55 °C 2 min，37 °C 2 min，25 °C 5 min，4 °C hold。

[0101] 条件2：85  °C 5 min，75 °C 2 min，65 °C 2 min， 55  °C 2 min，37 °C 2 min，25 °C 5 min，4 °C hold。

[0102] 条件3： 75 °C 2 min，55 °C 2 min，25 °C 5 min，4 °C hold。

[0103] 条件4： 75 °C 2 min，55 °C 2 min，4 °C hold。

[0104] 条件5： 75 °C 1 min，55 °C 1 min，4 °C hold。

[0105] 条件6： 75 °C 1 min，4 °C hold。

[0106] 表14

[0107] 组分 用量5X Reverse transcriptase buffer 4 μL
Murine RNase Inhibitor (40 U/µL, Yeasen, 10603ES05) 2 μL
Hifair® V Reverse Transcriptase (200 U/μL, Yeasen, 11300ES92) 1 μL
总体积 20 μL

[0108] 混匀后瞬离。25 °C 10 min， 42 °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C hold；

[0109] 稀释1000倍后，用Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (11200) 对5.8S、18S、28S、Actin和Gapdh cDNA进行定量，定量引物见表1，RNA的抑制效率见表15。

[0110] 表15：不同退火条件下逆转录阻碍探针竞争结合靶RNA和抑制逆转录的效率

[0111] 不同退火条件 条件1 条件2 条件3 条件4 条件55.8S rRNA逆转录抑制效率（%）99.895 99.813 99.828 99.884 97.135
18S rRNA逆转录抑制效率（%） 99.712 99.804 99.683 99.843 95.241
28S rRNA逆转录抑制效率（%） 99.943 99.887 99.902 99.917 96.103
Actb RNA逆转录抑制效率（%） ‑189.717 ‑178.332 ‑195.067 ‑178.143 ‑143.205
Gapdh RNA逆转录抑制效率（%）‑212.615 ‑257.106 ‑229.108 ‑245.429 ‑188.01

[0112] 由表15的定量结果可以看出，在1uL 4 μM NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix使用量下不同退火条件都能够有效抑制靶RNA的逆转录，其中条件5（75 °C 1 min，55  °C 1 
min，4 °C hold）操作简单，并不降低抑制效率，三条靶RNA的抑制效率都能达到99.8%以上，
是最合适的处理条件（如图12）。

[0113] 实施例8：逆转录阻碍探针法与传统法在一链合成时的去除效果对比

[0114] 参照图13，本实施例系统性比较polyA RNA富集法、RNase H切割去除法和逆转录阻碍探针法对靶RNA的去除效果。具体实施方式如下：

[0115] 1）polyA富集法。使用Hieff NGS® MaxUp II Dual‑mode mRNA Library Prep Kit for Illumina (Yeasen, 12300)对mRNA进行富集。

[0116] 取1 μg总RNA，用Nuclease free水将体积补至50 μL。吸取50 μL mRNA Capture Beads加入至50 μL总RNA样品中，吹打混匀。65 °C 5 min；室温孵育5 min。将样品置于磁力
架中，室温静置5 min，小心移除上清。将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash 
Buffer重悬磁珠，反复吹打混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。重
复洗涤磁珠一次。加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，吹打混匀。80 °C 2 min；25 °C hold。
将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，反复吹打混匀。室温放置5 
min。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。用200 μL Beads Wash Buffer
重悬磁珠，吹打混匀，将样品重新放回至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。将样品
从磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠，吹打混匀。将样品置于PCR仪
中, 94  °C 5 min，立即放在磁力架上。吸取17 μL 片段化mRNA，加入6 μL Strand 
Specificity Reagent和2 μL 1st Strand Enzyme Mix混匀后瞬离。25 °C 10 min， 42 °C 
15 min，70 °C 15 min，4 °C hold。取0.5 μL产物稀释100倍后，用Hieff UNICON® qPCR 
SYBR Green Master Mix (11200) 对5.8S、18S、28S和Actin cDNA进行定量。

[0117] 2）RNase H切割去除法。使用Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen, 12253)对rRNA进行去除。

[0118] 表16

[0119]组分 用量
Total RNA 1 μg
Hybridization Buffer 3 μL
Probe Mix(H/M/R) 1 μL
补DEPC H2O至 15 μL

[0120] 吹打混匀后瞬离。95 °C 2 min，95 °C‑22 °C ‑0.1  °C/s，22  °C 5 min，4 °C hold。

[0121] 表17

[0122] 组分 用量上述反应体系 15 μL
RNase H buffer 3 μL
RNase H 2 μL
总体积 20 μL

[0123] 吹打混匀后瞬离，37 °C 30 min，4 °C hold。

[0124] 表18

[0125]组分 用量
上述反应体系 20 μL
DNase I Buffer 27.5 μL
DNase I 2.5 μL
总体积 50 μL

[0126] 吹打混匀后瞬离，37  °C 30 min，4  °C hold。加入110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen, 12602)，充分吹打混匀，室温孵育5 min。将PCR管置于磁力架中分离磁
珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中，加入 
200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除
上清。重复漂洗一次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。保持 PCR 管始终置于磁力架中，室
温下开盖干燥磁珠（5 10 min）。用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠，吹打混匀，室温
~
静置5 min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），吸取17 μL 
mRNA于新PCR管中。将样品置于PCR仪中, 94 °C 5 min，立即冰浴5 min。

[0127] 表19

[0128]组分 用量
Frag/Prime buffer和RNA 17 μL
Strand Specificity Reagent 6 μL
1st Strand Enzyme Mix 2 μL
总体积 25 μL

[0129] 混匀后瞬离。25  °C 10 min， 42  °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C hold。取0.5 μL产物稀释100倍后，用Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (11200) 对5.8S、
18S、28S和Actin cDNA进行定量。

[0130] 3）逆转录阻碍探针法。

[0131] 表20

[0132]组分 用量
Total RNA 1 μg
4 μM NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix 1 μL
补Frag/Prime buffer至 17 μL

[0133] 吹打混匀后瞬离。95 °C 5 min，75 °C 1 min，55 °C 1 min，4 °C hold。

[0134] 表21

[0135]组分 用量
上述反应体系 17 μL
Strand Specificity Reagent 6 μL
1st Strand Enzyme Mix 2 μL
总体积 25 μL

[0136] 加入6 μL Strand Specificity Reagent和2 μL 1st Strand Enzyme Mix混匀后瞬离。25  °C 10 min， 42  °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C hold。取0.5 μL产物稀释100倍
后，用Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (11200) 对5.8S、18S、28S和Actin 
cDNA进行定量。

[0137] 三种方法的定量结果见图14。从定量结果可以看出，逆转录阻碍探针达到0.16 μM终浓度时，在NGS RNA建库过程中，rRNA的一链合成效率抑制率达到99.96%以上，已经显著
超过RNase H切割去除法的去除效率，与polyA富集法的去除效率相当（99.94%），且对其他
非靶RNA的一链合成效率有更大的促进作用（见表22）。

[0138] 表22：三种不同靶RNA去除方法在NGS RNA建库中靶RNA一链合成抑制效率的比较

[0139]

[0140] 实施例9：逆转录阻碍探针法与传统法在RNA NGS建库中的性能对比

[0141] 参照图13，本实施例利用基于illumina的二代测序平台，系统性比较polyA RNA富集法、RNase H切割去除法和逆转录阻碍探针法在RNA建库过程中对靶RNA的去除效果。实施
例3中剩下的1st strand cDNA 产物，通过Hieff NGS® MaxUp II Dual‑mode mRNA 
Library Prep Kit for Illumina (Yeasen, 12300)进行建库，流程包括：

[0142] 1）二链合成

[0143] 表23

[0144] 组分 用量1st strand cDNA 24 μL
DEPC H2O 1 μL
2nd Strand Buffer 30 μL
2nd Strand Enzyme Master Mix 5 μL
总体积 60 μL

[0145] 吹打混匀后瞬离。16 °C 30 min，72 °C 15 min，4 °C hold。

[0146] 2）接头连接

[0147] 表24

[0148] 组分 用量dA‑tailed DNA 60 μL
Ligation Enhancer 30 μL
Quick T4 DNA Ligase 5 μL
DNA Adapter 5 μL
总体积 100 μL

[0149] 吹打混匀后瞬离。20 °C 15 min， 4 °C hold。

[0150] 3）两轮磁珠回收

[0151] 加入60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen, 12601)，充分吹打混匀，室温孵育5 min。将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心
移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%
乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。重复漂洗一次。用 10 μL移液器吸干
净残留液体。保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5 min）。加入53 μL 
ddH2O，吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄
清后（约5 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中。

[0152] 加入80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen, 12601)，重复上述回收操作。加入22 μL ddH2O，吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力
架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中。

[0153] 3）文库扩增、回收、定量及测序

[0154] 表25

[0155] 组分 用量2×Super Canace® II High‑Fidelity Mix 25 μL
i5 Primer 2.5 μL
i7 Primer 2.5 μL
Adapter Ligated DNA 20 μL
总体积 50 μL

[0156] 吹打混匀后瞬离。按照以下反应程序进行文库扩增。

[0157] 表26

[0158]

[0159] 加入45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen, 12601)，重复上述回收操作。加入22 μL ddH2O，吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力
架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中。用dsDNA HS Assay 
Kit for Qubit (Yeasen, 12640)对文库进行定量，并利用Illumina的NovaSeq 6000平台
进行文库测序。rRNA去除效果见图15。

[0160] 表27 四种建库方式文库产量

[0161]

[0162] 表28： 四种建库方式rRNA残留率测序数据中rRNA残留率

[0163]

[0164] 由表27、表28和图15可知，逆转录阻碍探针法能够显著提高RNA建库的产量，且文库测序中核糖体RNA的残留显著低于polyA富集法和RNase H切割去除法，这说明逆转录阻
碍探针法能够高效的去除建库过程中的靶RNA。此外，相关性分析（见图16）结果显示逆转录
阻碍探针法与RNA直接建库具有更好的相关性，这说明逆转录阻碍探针法具有更小的建库
偏好性，更能反映原始RNA的真实信息。同时，在同等测序深度下，逆转录探针法的基因检出
数显著高于其他三种建库方式（见图17），这表明结合逆转录探针法的RNA测序技术获得的
信息更加完整、全面。

[0165] 实施例10：不同探针投入比例在RNA NGS建库过程中的去除靶RNA的效果

[0166] 由于总RNA中三条rRNA的含量并不相同（约为1：6：10），所以本实施例验证了三条探针不同比例在RNA NGS建库过程中对rRNA的去除效果。具体实施方式如下：

[0167] 表29

[0168] 组分 用量Total RNA 1 μg
不同比例 NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix 1 μL
补Frag/Prime buffer至 17 μL

[0169] 吹打混匀后瞬离。95 °C 5 min，75 °C 1 min，55 °C 1 min，4 °C hold。

[0170] 表30

[0171] NGS rRNA probe mix中每条探针的浓度 5.8S NGS rRNA probe mix 18S NGS rRNA probe mix 28S NGS rRNA probe mix条件1 8 μM 8 μM 8 μM
条件2 4 μM 4 μM 4 μM
条件3 1 μM 2 μM 4 μM
条件4 0.5 μM 1 μM 2 μM
条件5 0.2 μM 1 μM 2 μM
条件6 0.2 μM 1 μM 1 μM
条件7 0.1 μM 0.5 μM 1 μM
条件8 0.05 μM 0.5 μM 1 μM
条件9 0.05 μM 0.25 μM 0.5 μM

[0172] 表31

[0173]组分 用量
上述反应体系 17 μL
Strand Specificity Reagent 6 μL
1st Strand Enzyme Mix 2 μL
总体积 25 μL

[0174] 加入6 μL Strand Specificity Reagent和2 μL 1st Strand Enzyme Mix混匀后瞬离。25  °C 10 min， 42  °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C hold。后续RNA NGS建库参照实
施例9进行。

[0175] 表32 不同探针投入比例文库产量

[0176] 探针投入比例条件 1 2 3 4 5 6 7 8 9文库产量（μg） 1.51 2.03 2.11 2.15 2.36 4.35 4.39 4.24 7.98

[0177] 表33： 四种建库方式rRNA残留率测序数据中rRNA残留率

[0178] 探针投入比例条件 1 2 3 4 5 6 7 8 95.8S reads残留率（%）0.001 0.002 0.005 0.008 0.134 0.129 0.312 1.081 1.247
18S reads残留率（%） 0.079 0.189 0.173 0.211 0.209 0.223 1.148 1.329 5.89
28S reads残留率（%） 0.057 0.312 0.331 0.403 0.384 1.412 1.826 1.899 9.23

[0179] 由表32、表33可知，探针投入量越少，建库产量越高。当使用1 ug总RNA进行RNA建库时，1 uLNGS rRNA逆转录阻碍探针混合物中每条5.8S NGS rRNA探针掺入浓度应为0.1‑8 
uM，每条18S NGS rRNA探针掺入浓度应为1‑8 uM，每条28S NGS rRNA探针掺入浓度应为2‑8 
uM，在这个探针投入浓度范围可以使得RNA NGS测序数据中每条rRNA的残留测序数据均不
超过总数据的1%，符合常规RNA测序中对rRNA的去除效率要求。出于节省的原则，我们下游
实施例中使用的NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix每条5.8S NGS rRNA探针掺入浓度为
0.1 uM，每条18S NGS rRNA探针掺入浓度为1 uM，每条28S NGS rRNA探针掺入浓度为2 uM。

[0180] 实施例11：逆转录阻碍探针对不同RNA投入量样本中靶RNA的去除效果

[0181] 本实施例验证了逆转录阻碍探针对不同RNA投入量样本NGS建库过程中对rRNA的去除效果。具体实施方式如下：

[0182] 表34

[0183] 组分 用量Total RNA 见表35
NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix 见表35
补Frag/Prime buffer至 17 μL

[0184] 吹打混匀后瞬离。95 °C 5 min，75 °C 1 min，55 °C 1 min，4 °C hold。

[0185] 表35

[0186] 条件 RNA投入量（ng） NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix使用量(μL) 文库扩增时PCR循环数1 1000 1 10
2 1000 0.1 10
3 100 0.2 13
4 100 0.1 13
5 100 0.01 13
6 10 0.1 16
7 10 0.01 16
8 1 0.01 20
9 0.1 0.01 24
10 0.01 0.01 28

[0187] 表36

[0188]组分 用量
上述反应体系 17 μL
Strand Specificity Reagent 6 μL
1st Strand Enzyme Mix 2 μL
总体积 25 μL

[0189] 加入6 μL Strand Specificity Reagent和2 μL 1st Strand Enzyme Mix混匀后瞬离。25  °C 10 min， 42  °C 15 min，70 °C 15 min，4 °C hold。后续RNA NGS建库参照实
施例9进行，PCR扩增循环数见表35。

[0190] 表37 不同RNA投入量文库产量

[0191] 条件 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10文库产量（ng）415 1167 286 354 892 117 144 83.2 98.7 62.5

[0192] 表38： 四种建库方式rRNA残留率测序数据中rRNA残留率

[0193] 条件 1 2 3 4 5 6 7 8 9 105.8S reads残留率（%） 0.002 0.381 0.001 0.004 1.125 0.001 0.014 0.015 0.053 0.192
18S reads残留率（%） 0.135 3.269 0.109 0.163 11.837 0.083 0.259 0.201 0.327 1.636
28S reads残留率（%） 0.241 8.893 0.114 0.419 8.569 0.102 0.726 0.540 0.861 2.457
基因检出数 31647 27895 24867 25309 21095 18921 18714 14193 11087 6265

[0194] 由表37、表38可知，逆转录阻碍探针法可以有效去除不同RNA投入量的NGS建库过程中的靶RNA。当RNA投入量为100‑1000 ng时，NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix的最佳
使用量为1 μl；当RNA投入量为10‑100 ng时，NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe mix的的最佳
使用量为0.1 μl；当RNA投入量为10 pg(单细胞)‑10 ng时，NGS 5.8S/18S/28S rRNA probe 
mix的的最佳使用量为0.01 μl。总rRNA的残留率低于1%。从基因检出数上看，逆转录阻碍探
针法比其他传统的rRNA去除法具有更大的优势。

[0195] 综上，我们发明了一种用于RNA建库中快速去除靶RNA的逆转录阻碍探针及其方法流程。本发明具有操作简单（一步操作）、耗时极短（2 min）、对非靶RNA保留完整、特异性强、
效率高、成本低和基因检出数高等优点，非常适合用于工业自动化建库和疾病快速诊断领
域。任何在逆转录过程中利用逆转录阻碍探针混合物去除靶RNA的方法都应属于本专利的
保护范围。