CDK7靶向抑制剂在制备治疗细胞因子释放综合征药物中的应用

摘要

本发明请求保护了一种CDK7靶向抑制剂在制备治疗细胞因子释放综合征药物中的应用，本发明通过生化以及动物模型实验验证：(1)在合适的浓度下，CDK7靶向抑制剂通过抑制stat1、IL‑1、IL‑6等炎性因子相关的超级增强子、转录因子的表达，能特异性地调控巨噬细胞、T细胞、内皮细胞等免疫细胞的炎症信号通路；(2)能显著降低细菌或病毒感染引起的急性炎症风暴导致的小鼠死亡，降低相关脏器的炎症引起的功能衰竭，期间并未发现明显毒副作用。在细菌、病毒或免疫治疗引起细胞因子释放综合征的治疗上具有重大意义。

权利要求

1.一种CDK7的靶向抑制剂THZ1在制备治疗细胞因子释放综合征药物中的用途，所述细胞因子释放综合征是由细菌或病毒感染引 起的，其特征在于，所述THZ1如式（I）所示：

（I）。

说明书

CDK7靶向抑制剂在制备治疗细胞因子释放综合征药物中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及CDK7靶向抑制剂在制备治疗细胞因子释放综合征药物中的应用。

背景技术

[0002] 细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)，也称“细胞因子风暴”是指机体免疫系统受到某种强烈刺激(如病毒、细菌、免疫干预治疗等因素)后，体内迅速产生大量细胞因子的现象，是一种严重的炎症反应综合征。新型冠状病毒(COVID‑19)、SARS、流感病毒、细菌等感染疾病以及CAR‑T 等免疫治疗，都会伴随着一定比率的病人出现细胞因子释放综合征，尤其是危重病人。当上述病原体初始攻击机体时，巨噬、中性粒等免疫细胞会释放细胞因子，以募集相免疫细胞(巨噬细胞、粒细胞、DC细胞，T细胞、B细胞)前往感染部位，同时，细胞因子还会进一步激活这些细胞，刺激它们产生更多的细胞因子。通常，这一正反馈回路是机体自身可以控制的。然而，在细胞因子风暴中，大量的免疫细胞被激活并分泌更多的细胞因子，而更多的细胞因子又招募到了更大量的免疫细胞，形成了一种无法控制的级联放大效应。故CRS是一种免疫系统的过度激活，使多种细胞因子在组织、器官中过度表达，最终导致单器官或多器官损伤、功能衰竭而死亡的疾病。参见附图图1A显示了炎症风暴的形成模式图，CRS可以引起多种疾病(包括感染、急性呼吸窘迫综合征 ARDS、败血症、急性胰腺炎、风湿性疾病等)。严重的CRS，会引起宿主全身炎症反应，可造成多种组织器官损伤，使机体发生多器官衰竭甚至死亡。

[0003] 对新型冠状病毒COVID‑19病人研究发现，重症监护(ICU)患者血浆中存在更高水平炎性细胞因子，如IL‑2、IL‑7、IL‑10、IL‑6、G‑SCF以及TNF‑α。《柳叶刀》杂志在线发表一项研究发现，金银潭医院收治99例新冠肺炎确诊病例中，当接受了抗病毒、抗生素和吸氧治疗后，大多数患者预后良好；但17名重症患者出现了细胞因子风暴引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其中11人死于多器官功能衰竭。事实上，早在2020年1月24号，新冠病毒感染病例首批临床数据报告中(《柳叶刀》)就提到了“细胞因子风暴(cytokine storm)”这一名词。在上述细胞因子中，IL‑6、IL‑1和TNF‑α对引起炎症风暴的作用最大。

[0004] 在细胞因子风暴形成过程中，巨噬细胞起到关键作用，是细胞因子风暴的发动机，也是细胞因子风暴的放大器，如图1B所示。2020年3月王朝夫教授研究团队《nature》发文，报道严重新冠肺炎的病理解剖研究成果。患者病理改变最大的受累脏器是肺，为弥漫性肺损伤，广泛的渗出及出血，肺泡上皮的破坏和反应性增生，以巨噬细胞为主的炎症反应及纤维化。在新冠肺炎患者中，这些活化的巨噬细胞可能在一系列严重的“炎症因子风暴中”中扮演了重要的角色。中科大研究团队对33例COVID‑19患者进行了分析，COVID‑19患者外周血中的炎性单核/巨噬细胞(CD14+CD16+)的比例和数目明显升高。这些巨噬细胞能够分泌更多的促炎因子IL‑6和GM‑CSF。

[0005] 目前，治疗CRS手段主要有以下几个方面：(1)IL‑6受体拮抗剂：IL‑6 主要由巨噬细胞分泌，具有多效活性的细胞因子，已成为判断细胞因子风暴严重程度和预后指标的生物标志物，因此，阻断IL‑6发挥功能，成为抑制CRS的一种关键策略。临床采用“托珠单抗”作为抑制剂，阻断新冠病毒感染诱发炎症风暴的关键细胞因子，有效地降低了炎症反应对病人肺组织和多器官的损伤。需要注意的，IL‑6只是细胞因子风暴中的众多炎性细胞因子中的一种，有些种类的细胞因子风暴中，IL‑1、趋化因子反而表达更高一些。因此，该方法具有一定的局限性；(2)糖皮质激素：临床上对于细胞因子风暴多采用给予抗感染药物、糖皮质激素、营养支持等非特异性联合治疗措施。其中，糖皮质激素因具有强大的抗炎作用而常用于临床，但糖皮质激素副作用较大。上述临床CRS治疗方法，存在不同的局限性或副作用。因此深入研究相关分子作用机制，开发安全高效的靶向药物，更有效治疗CRS的同时能降低副作用，是亟需解决的关键问题。

发明内容

[0006] 为克服现有技术中的缺陷，本发明通过如下技术方案实现：

[0007] 本发明的提供了一种CDK7的靶向抑制剂在制备治疗细胞因子释放综合征药物(即CRS)中的用途；

[0008] 进一步的，所述CDK7的靶向抑制剂为THZ1、BS‑181或SY‑1365；进一步优选的，所述CDK7的靶向抑制剂为THZ1；

[0009] 进一步的，所述细胞因子释放综合征是由细菌感染或病毒感染引起的。

附图说明

[0010] 图1左图为细胞因子风暴的形成模式图；右图为细胞因子风暴中巨噬细胞发挥关键作用模式图

[0011] 图2为CDK7调控模式示意图；其中，A表示CDK7调控DNA转录成mRNA 和CDK7调控细胞周期进程模式图；B表示式I化合物THZ1的结构式；C表示 THZ1不可逆地与CDK7蛋白激酶结构域外半胱氨酸残基(Cys312)共价结合的示意图

[0012] 图3为THZ1、SY‑1365、BS‑181的在炎症模型中，对相关靶分子的抑制比较实验结果[0013] 图4为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体调控mRNA转录示意图及分子信号通路western图

[0014] 图5为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体的细菌感染模型的 qRT‑PCR实验结果

[0015] 图6为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体H1N1‑流感病毒菌感染模型的qRT‑PCR实验结果

[0016] 图7为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体抑制细胞因子风暴中相关细胞因子释放的ELISA实验结果

[0017] 图8为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体在炎症模型中的全基因组表达谱分析图

[0018] 图9为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体全基因组CHIP‑Seq(RNA Poly II，H3K27AC)的分析结果

[0019] 图10为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体的动物水平实验

[0020] 图11为小鼠生存实验结果

[0021] 有益效果

[0022] 本发明通过实验证明：

[0023] CDK7的靶向抑制剂能特异性地抑制细菌、病毒感染等过程中引起的急性炎症反应，尤其是THZ1效果最佳；通过生化以及动物模型实验验证：(1)在合适的浓度下，CDK7靶向抑制剂THZ1能特异性地调控巨噬细胞、单核细胞内皮细胞、成纤维细胞等免疫相关细胞的炎症信号通路，通过抑制IL‑1、IL‑6、stat1、等炎性因子及相关的超级增强子、转录因子的表达；(2)THZ1能显著降低细菌或病毒感染引起的急性炎症风暴导致的小鼠死亡，降低相关脏器的炎症引起的功能衰竭，期间并未发现明显毒副作用。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0025] 本发明所述CDK7的靶向抑制剂THZ1，是由Syros研发的靶向CDK7的共价抑制剂，THZ1能通过靶向共价修饰CDK7激酶结构域外的Cys312残基(参见图1)，从而阻止其对RNA聚合酶II第2，5，7丝氨酸残基的磷酸化，抑制 RNA聚合酶II的活性，进而抑制mRNA的转录进行。

[0026] THZ1的CASNo.为1604810‑83‑4，化学名称为： (E)‑N‑(3‑((5‑chloro‑4‑(1H‑indol‑3‑yl)pyrimidin‑2‑yl)amino)phenyl)‑4‑(4‑(dimethyla mino)but‑2‑enamido)benzamide，分子式为C31H28ClN7O2，结构式如式I所示：

[0027]

[0028] BS‑181(CASNo.:1397219‑81‑6)是一种高度选择性CDK7抑制剂，IC50为 21nmol/L，相比于CDK1，2，4，6和9的选择性高40倍以上。人类胃癌细胞 BGC‑823中，BS‑181显著降低CDK7的活性，同时下调抗凋亡蛋白(cyclinD1、 XIAP和、Bcl‑2)的水平，进一步抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁徙。

[0029] SY‑1365(CASNo.:1816989‑16‑8)是一种高度选择性CDK7抑制剂，在体外抑制了许多不同癌症类型的细胞生长。SY‑1365治疗降低MCL1蛋白水平， BCL2L1(BCL‑XL)低表达的癌细胞对SY‑1365更敏感，SY‑1365作为单一药物在多种AML异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤作用；SY‑1365诱导的生长抑制与BCL2抑制剂venetoclax联合使用增强。在卵巢癌异种移植模型中也观察到抗肿瘤活性，这表明SY‑1365在血液学和实体瘤的临床研究中具有潜在的应用前景。我们的研究结果支持将CDK7作为治疗转录依赖性癌症的新方法。

[0030] 实施例1：THZ1、SY‑1365、BS‑181的CDK‑7靶向小分子药物在炎症模型中，对相关靶分子的抑制比较实验

[0031] 处于指数生长期的单核细胞(THP‑1，人单核细胞系)，用100ng/ml PMA 处理24小时，形成巨噬细胞(mTHP‑1，人单核细胞诱导巨噬细胞)，然后分别用30nM THZ1、30nM SY‑1365、10μM BS‑181处理500ng/ml LPS诱导的炎症模型，收集细胞，并进行相关蛋白的western检测，结果如图3所示，THZ1、 SY‑1365、BS‑181均具有抑制LPS诱导的炎症作用(见图3A)，THZ1‑CDK7、 SY‑1365‑CDK7、BS‑181‑CDK7复合体均对RNA Poly II2,7位点丝氨磷酸化具有一定的抑制作用(见图3B)；综上，其中THZ1的抗炎效果最佳。

[0032] 实施例2：THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体调控基因转录和 western实验

[0033] 处于指数生长期的单核细胞，用100ng/ml PMA处理24小时，形成巨噬细胞，然后用不同浓度THZ1(0，20，40，100，200nM)处理30分钟，而后于不同时间点收样(8，24小时)，收集细胞，并进行相关蛋白的western检测。图4为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体调控基因转录示意图。其中， A表示THZ1靶向调控CDK7的mRNA转录复合体RNA Poly的示意图；B表示western实验中，在THZ1不同浓度、不同作用时间下，THZ1‑CDK7复合体对RNA Poly II2,7位点丝氨磷酸化的抑制情况：随着时间的推移，抑制效果减弱；抑制作用随着浓度提高而增强。

[0034] 实施例3：THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体的细菌感染模型

[0035] 图5为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体的细菌感染模型的 qRT‑PCR实验结果，其中，A表明THZ1在mTHP‑1‑PMA中，能显著抑制白小细胞介素IL1B、白小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA以及趋化因子CXCL10等相关炎性基因的表达；B表明THZ1在THP‑1中，能显著抑制白小细胞介素IL1B、白小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA以及趋化因子CXCL10等相关炎性基因的表达；C表明THZ1在HFF‑1 (皮肤成纤维细胞)中，能显著抑制白小细胞介素IL1B、白小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA以及趋化因子CXCL10等相关炎性基因的表达；D表明THZ1在HUVEC(内皮细胞)中，能显著抑制白小细胞介素IL1B，白小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA、趋化因子CXCL10 等相关炎性基因的表达。

[0036] 实施例4：HZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体H1N1‑流感病毒菌感染模型[0037] 图6为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体H1N1‑流感病毒菌感染模型的qRT‑PCR实验结果，其中，A表明THZ1在mTHP‑1‑PMA中，能显著抑制白小细胞介素IL1B、小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA 以及趋化因子CXCL10等相关炎性基因的表达；B表明THZ1在THP‑1‑PMA中，能显著抑制白小细胞介素IL1B、小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA以及趋化因子CXCL10等相关炎性基因的表达；C表明THZ1在 HFF‑1中，能显著抑制白小细胞介素IL1B、小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA以及趋化因子CXCL10等相关炎性基因的表达；D表明 THZ1在HUVEC中，能显著抑制白小细胞介素IL1B、小细胞介素IL6、白小细胞介素IL8、肿瘤坏死因子TNFA以及趋化因子CXCL10等相关炎性基因的表达。

[0038] 实施例5：THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体抑制细胞因子风暴中相关细胞因子释放的ELISA实验

[0039] 图7为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体抑制LPS引起的细胞因子风暴中相关细胞因子释放的ELISA实验结果，其中，A表明THZ1能显著抑制巨噬细胞中细胞因子IL‑1β的释放；B表明THZ1能显著抑制巨噬细胞中细胞因子IL‑6的释放；C表明THZ1能显著抑制巨噬细胞中细胞因子IL‑8的释放； D表明THZ1能显著抑制巨噬细胞中肿瘤细胞坏死因子TNF‑α的释放。

[0040] 实施例6：THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体在炎症模型中的全基因组表达谱分析

[0041] 健康志愿者外周血通过Ficoll方法分离、并梯度时间贴壁法，分离培养单核细胞，然后用100ng/ml  PMA处理24小时，形成巨噬细胞(primary  monocyte‑derived macrophages，MDMs)，然后用30nM的THZ1处理30分钟，而后用500ng/ml 的LPS处理共处理8小时，收样，提取RNA，并进行RNA转录组测序。图8 为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体的全基因组表达谱分析结果，A： mRNA测序分析结果表明，巨噬细胞不同处理组的转录组测序分析的基因表达差异(在炎症模型中，相关炎性因子的基因表达是上调的，而THZ1加入组，相关炎性因子的基因表达是被抑制的)，结果显示，LPS显著激活相关基因表达(如图8A不同组的炎性基因的表达在LPS/Control中的表达(图的上半部分)，但加入THZ1后，表达上调的基因被显著抑制，THZ1/LPS组(图的下半部分)，都要比对应组的表达降低)；B：通过GO富集分析表明，差异表达的基因，主要富集在RNAPoly II信号通路和炎性应激调控信号通路；C：通过全基因组差异表达分析比对，发现THZ1抑制急性炎症反应主要通过调控趋化因子 (CCL8,15,5,2,7,4,1，CXCL9,10,11,23,8)、细胞因子(IL12B，27,7,23A,1B, 1A,6,TNF,CD70等)以及受体(CCL15,2等)等的激活，从而实现细胞因子风暴的抑制。

[0042] 实施例7：THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体全基因组CHIP‑Seq 分析[0043] 单核细胞用100ng/ml PMA处理24小时，形成巨噬细胞，然后用0或30nM 的THZ1处理30分钟，而后用0或500ng/ml的LPS共处理8小时，用1％的甲醛室温交联10分钟，用0.125M甘氨酸终止交联5分钟，然后刮铲收集细胞。收集的样按试剂盒(SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit,CST)进行要求进行 DNA破碎和相关抗体结合DNA片段的富集.而后按试剂盒(ChIP‑seq libraries were constructed using NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina，NEB) 进行建库，最后做测序及其分析。图9为THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II 复合体全基因组CHIP‑Seq(RNA Poly II，H3K27AC)的分析结果，图9A1表明THZ1靶向抑制CDK7和RNA poly II结合，整体描述了富集出的DNA片段丰度比较，通过比较发现，LPS处理组和RNA poly II抗体结合的DNA丰度增加，说明更多的基因正在被转录；而THZ1处理后，富集到的DNA丰度变少，说明正在被转录的基因变少；图9A2表明DNA总体上处于转录起始以及转录延申的统计情况；图9B1表明，THZ1抑制RNA Poly II与炎性转录调控因子STAT1、 IRF1的结合，抑制相关基因的表达；图9B2通过对超级增强子的标记分子 H3K27ac的CHIP‑Seq数据分析发现，THZ1具有显著抑制转录调节因子STAT1、 IRF1上游的超级增强子的活性，图9B2通过对超级增强子的标记分子H3K27ac 的CHIP‑Seq数据分析发现，THZ1具有显著抑制炎性因子IL‑α，IL‑1β上游的超级增强子的活性，这提示我们，THZ1靶向CDK7‑RNA Poly II复合体，抑制了炎性相关基因、炎性相关转录因子基因上游超级增强子的结合能力，以及直接抑制RNA PolyII与炎性相关因子基因，转录因子基因的结合，抑制基因的表达，上述复合作用，进而改变转录调节因子的表达，最终影响炎性细胞因子的表达，从而特异性调节细胞因子的生产，抑制炎症风暴的发生。

[0044] 实施例8：THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体的动物水平实验

[0045] 如图10所示，实验结果表明：THZ1靶向CDK7‑RNA Polymerase II复合体，特异性抑制细胞因子释放，降低脏器的损伤，显著提高因细胞因子风暴致死的小鼠的存活率(LPS细菌炎症风暴模型)。图10A：小鼠LPS急性炎症风暴模型示意图及THZ1给药示意图，实验流程为：给予小鼠腹腔注射THZ1 10mg/kg， 0.5h后给予注射LPS40mg/kg，然后20小时处死小鼠，进行以下分析：(1)取其血清进行细胞因子分析，(2)腹腔灌洗：细胞分析，(3)器官毒性评估；图10B：多因子流式定量检测实验表明，LPS处理小鼠，能显著激活小鼠的免疫应激，发生细胞因子风暴，MCP‑1、IL‑1β、IL‑6、相关细胞因子高表达，THZ1 处理后，相关细胞因子的表达显著降低；图10C：外周血流式细胞亚型分析表明， LPS处理小鼠，能显著激活小鼠的免疫应激，诱发巨噬细胞数量的升高，THZ1 的处理，能显著降低巨噬细胞的比率，另外，小鼠血样的qRT‑PCR实验也同样表明，LPS处理小鼠，能显著激活小鼠的免疫应激，发生细胞因子风暴，相关细胞因子(IL‑1B、TNFA)高表达，这些因子的高表达，是通过STAT1转录因子调控实现的，THZ1的处理，能显著抑制STAT1的表达，进而抑制上述相关因子的表达；图10D：组织解剖HE染色表明，LPS处理小鼠，能显著引起相关脏器(肺、肝、肾、脾)的炎症反应(组织充血)；而THZ1处理，能显著降低上述组织充血，降低急性炎症反应。

[0046] 实施例9：小鼠生存实验

[0047] 如图11所示，小鼠生存实验表明(LPS细菌炎症风暴模型)，THZ1靶向 CDK7‑RNA Polymerase II复合体，能显著提高因细胞因子风暴致死小鼠的存活率。生存曲线表明，同对照组比较，LPS炎症组，72小时内，因LPS诱发的炎症风暴，导致所有小鼠死亡，存活率为0％；而通过THZ1给药，能显著降低急性炎症风暴导致的小鼠死亡，存活率为68.75％。

[0048] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。