一种基因分型检测用的质控品及其制备方法

摘要

本发明提供了一种质控品及其制备方法，所述质控品为血液粗提物，包含白细胞和缓冲液，所述白细胞来自目标基因为杂合型的样本，同时荧光PCR测定获得的Ct值在预先设定的Ct值范围之内。本发明所述质控品及其制备方法能够用于血液直扩基因分型产品的有效质量控制，且质控品的精密度和稳定性均符合质控品的行业要求。

权利要求

1.一种适用于基因分型产品的质控品，包括白细胞，其特征在于，所述白细胞由目标基因为杂合子的样本中分离获得，还包括缓冲液A，所述缓冲液A的配方包括：5‑8mmol/L的Tris‑HCl，0.5‑1.5mmol/L的EDTA，0.5‑1％体积质量百分比的NP‑40和0.1‑0.5mg/ml的BSA。

2.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于，利用荧光PCR对质控品的Ct值进行测定，Ct值介于预先设定的质控品验证Ct值范围内。

3.根据权利要求2所述的质控品，其特征在于，所述设定的质控品验证Ct值范围方法包括：对临床血样样本进行测序筛选出目标基因检测位点为杂合子的样本；筛选出白细胞浓度介于指定范围的杂合子样本，对杂合子样本进行处理，获得白细胞溶液，利用荧光PCR对所述白细胞溶液Ct值进行评估，确定预设的质控品验证Ct值范围。

4.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于，所述白细胞按如下方法获得：(1)在全血中加入纯化水或TE溶液，涡旋；

(2)离心，使得白细胞沉降，移除上清，获得白细胞。

5.一种适用于血液直扩基因分型产品的质控品的制备方法，包括质控品筛选条件的确认和质控品的制备，其特征在于，所述质控品筛选条件的确认步骤包括：首先设计并合成针对目的检测位点的测序引物；然后对临床血样样本进行测序筛选出目的检测位点为杂合子的样本；最后，筛选出白细胞浓度介于指定范围的杂合子样本，对杂合子样本进行处理，获得白细胞溶液，利用荧光PCR对所述白细胞溶液Ct值进行评估，确定预设的质控品验证Ct值范围；

所述质控品制备：利用所述测序引物进行测序，筛选出白细胞浓度介于指定范围的杂合子样本，然后对所述杂合子样本进行处理，获得白细胞溶液，利用荧光PCR对所述白细胞溶液Ct值进行测定；如其Ct值介于所述预设的质控品验证Ct值范围，则作为所述白细胞溶液作为质控品进行后续应用；

所述杂合子样本处理方法包括：

(1)向全血样本中加入红细胞破裂试剂，使红细胞破裂，释放出血红素；

(2)离心步骤(1)中获得的处理液，使白细胞沉淀，移除上清；

(3)加入缓冲液A溶液重悬白细胞，所述缓冲液A的配方包括：5‑8mmol/L的Tris‑HCl Tris‑HCl，0.5‑1.5mmol/L的EDTA，0.5‑1％体积质量百分比的NP‑40和0.1‑0.5mg/ml的BSA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述指定范围是指血样样本中的白细胞浓

9 9

度范围为4×10‑10×10个/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用于荧光PCR的样本的处理方法包括：①在EDTA抗凝全血中加入5‑10倍体积纯化水，涡旋30s；②12000×g离心1min，使得白细胞沉降，移除上清；③加入全血等体积的缓冲液A溶液重悬，所述缓冲液A的配方包括：5‑8mmol/L的Tris‑HCl Tris‑HCl，0.5‑1.5mmol/L的EDTA，0.5‑1％体积质量百分比的NP‑40和0.1‑

0.5mg/ml的BSA。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，测序所用模板选自以基因组DNA为模板或以血液为模板。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，红细胞裂解试剂包括纯化水或TE溶液。

10.权利要求1至4之一所述的质控品在血液直扩基因分型产品质量控制上的应用。

说明书

一种基因分型检测用的质控品及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制品技术领域，具体为一种基因分型检测提供质控品的制备方法。

背景技术

[0002] 随着精准医疗的不断发展与推进，基因分型检测及其产品已经得到了临床诊断的认可，越来越多的基因分型产品陆续推出市面。随着该类产品的不断深化，其检测方法的控制显得尤为重要，因此，质控品的制备及应用逐渐受到关注与重视。目前对于基因分型检测产品，其检测目标主要有两种，一是基因组DNA，二是血液或血液的粗提物。本发明则主要针对以血液或血液粗提物为检测标的方法或产品。对于这类产品，以往采用的质控品主要是人为构建的质粒，但采用构建的质粒作为质控品主要存在的问题是，医学检验主要是以人的血液或者血液粗提物为检测目的，用质粒作为替代物存在不可比性，尤其是血液或血液粗提物中存在不可预知的干扰因素，这是质粒所不具备的。

[0003] 因此，针对这类以血液或血液粗提物为检测标的检测方法或产品，寻找一种具有更高可比拟性的质控品及其制备方法，显得尤为重要。为了将质控品的可比性提至最高，我们往往采用与检测标的一致的物质，在本领域中即血液或血液粗提物。由于血液在保存、使用等过程中存在不稳定性，因此，本发明将以血液粗提物作为质控品，并对该质控品的性能及其制备进行阐述。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能够适用于血液直扩基因分型产品的有效控制质量的质控品及其制备方法。

[0005] 所述一种适用于基因分型产品的质控品包括白细胞，所述白细胞由目标基因为杂合子的样本中分离获得。

[0006] 进一步的，利用荧光PCR对质控品的Ct值进行测定，Ct值介于预设的质控品验证Ct值范围内。

[0007] 进一步的，还包括缓冲液A，所述缓冲液A的配方包括：

[0008] Tris‑HCl:5‑8mmol/L

[0009] EDTA:0.5‑1.5mmol/L

[0010] NP‑40:0.5‑1％(体积质量百分比)

[0011] BSA：0.1‑0.5mg/ml。

[0012] 进一步的，所述设定的质控品验证Ct值范围方法包括：对临床血样样本进行测序筛选出目标基因检测位点为杂合子的样本；筛选出白细胞浓度介于指定范围的杂合子样本，对杂合子样本进行处理，获得白细胞溶液，利用荧光PCR对所述白细胞溶液Ct值进行评估，确定预设的质控品验证Ct值范围。

[0013] 更为具体的，所述预先设定的Ct值范围为22‑28。

[0014] 具体的，所述白细胞按如下方法获得：

[0015] (1)在全血中加入纯化水或TE溶液，涡旋；

[0016] (2)离心，使得白细胞沉降，移除上清，获得白细胞。

[0017] 本发明还提供了一种适用于血液直扩基因分型产品的质控品的制备方法，包括质控品筛选条件的确认和质控品的制备，所述质控品筛选条件的确认步骤包括：首先设计并合成针对目的检测位点的测序引物；然后对临床血样样本进行测序筛选出目的检测位点为杂合子的样本；最后，筛选出白细胞浓度介于指定范围的杂合子样本，对杂合子样本进行处理，获得白细胞溶液，利用荧光PCR对所述白细胞溶液Ct值进行评估，确定预设的质控品验证Ct值范围；

[0018] 所述质控品制备：利用所述测序引物进行测序，筛选出白细胞浓度介于指定范围的杂合子样本，然后对所述杂合子样本进行处理，获得白细胞溶液，利用荧光PCR对所述白细胞溶液Ct值进行测定；如其Ct值介于所述预设的质控品验证Ct值范围，则作为所述包细胞溶液作为质控品进行后续应用；

[0019] 所述杂合子样本处理方法包括：

[0020] (1)向全血样本中加入红细胞破裂试剂，使红细胞破裂，释放出血红素；

[0021] (2)离心步骤(1)中获得的处理液，使白细胞沉淀，移除上清；

[0022] (3)加入缓冲液A溶液重悬白细胞。

[0023] 进一步的，所述指定范围是指血样样本中的白细胞浓度范围为4×109‑10×109个/L。

[0024] 进一步的，用于荧光PCR的样本的处理方法包括：①在EDTA抗凝全血中加入5‑10倍体积纯化水，涡旋30s；②12000×g离心1min，使得白细胞沉降，移除上清；③加入全血等体积的缓冲液A溶液重悬。

[0025] 进一步的，缓冲液A的配方包括：5‑8mmol/L的Tris‑HCl，0.5‑1.5mmol/L 的EDTA，0.5‑1％的NP‑40，0.1‑0.5mg/ml的BSA。

[0026] 进一步的，测序所用模板选自以基因组DNA为模板或以血液为模板。

[0027] 本发明所述的血液直扩即为血液直接扩增的简称。

[0028] 本发明所述质控品及其制备方法能够用于血液直扩基因分型产品的有效质量控制，且质控品的精密度和稳定性均符合质控品的行业要求。

附图说明

[0029] 图1实施例3中37℃条件下的稳定性试验结果。

[0030] 图2实施例3中2‑8℃条件下的稳定性试验结果。

[0031] 图3实施例3中‑20℃条件下的稳定性试验结果。

具体实施方式

[0032] 以SLCO1B1(388A>G)位点突变的分型检测为例子对本发明做进一步详细描述。

[0033] 以缓冲液A作为质控品保存液，其中缓冲液A的配方包括：

[0034] Tris‑HCl:5‑8mmol/L

[0035] EDTA:0.5‑1.5mmol/L

[0036] NP‑40:0.5‑1％(体积质量百分比)

[0037] BSA：0.1‑0.5mg/ml

[0038] 实施例1质控品的制备方法

[0039] 以检测SLCO1B1(388A>G)位点突变的分型为目的，进行质控品制备，步骤如下：

[0040] (1)设计并合成针对SLCO1B1(388A>G)位点的测序引物，引物序列如下：

[0041] SLCO1B1(388A>G)上游测序引物：5’‑GTGTTGTTAATGGGCGAACTGT‑3’[0042] SLCO1B1(388A>G)下游测序引物：5’‑AATGGTGCAAATAAAGGGGAAT‑3’[0043] (2)利用上述测序引物进行血液直扩，获得扩增产物后送测序公司进行Sanger测序以筛选出杂合子。具体血液直扩体系和程序如下：

[0044] 扩增体系：

[0045] 组分 用量 终浓度2×Master Mix 10μl 1×
上游测序引物(10μM) 0.8μl 0.4μM
下游测序引物(10μM) 0.8μl 0.4μM
全血 2μl /
纯化水 Up to 20μl /

[0046] 扩增程序：

[0047]

[0048] (3)在上述筛选出的杂合子中，进一步筛选出白细胞浓度介于 4×109‑10×109个/9 9
L的样本，总计126例，临床上正常人的白细胞浓度为 4×10‑10×10个/L，也即选取白细胞在正常值范围内且其SLCO1B1(388A>G) 基因位点为杂合子的样本。对筛选出的符合要求的
126例样本进行样本处理，处理方法如下：

[0049] ①在100μl EDTA抗凝全血中加入1ml纯化水或TE溶液，涡旋30s。

[0050] ②12000×g离心1min，使得白细胞沉降，移除上清。

[0051] ③加入100μl的缓冲液A溶液重悬。

[0052] 其中缓冲液A的配方包括：

[0053] Tris‑HCl:6.5mmol/L

[0054] EDTA:1.1mmol/L

[0055] NP‑40:0.8％

[0056] BSA：0.3mg/ml

[0057] (4)荧光PCR扩增(SLCO1B1(388A>G)引物和探针序列如下所述)，获得每个样本对应的Ct值。荧光PCR扩增体系及程序如下：

[0058] 上游引物序列：5’‑TAAACAAGTGGATAAGGTCGATGTTG‑3’

[0059] 下游引物序列：5’‑AGATAATGGTGCAAATAAAGGGGAAT‑3’

[0060] 野生型探针序列：5’‑FAM‑TCCCCTATTCCACGAAGCA‑MGBNFQ‑3’[0061] 突变型探针序列：

[0062] 5’‑VIC‑AATGTTTAAAATGAAACACTCTCTTATC‑MGBNFQ‑3’

[0063] 扩增体系：

[0064]物料名称 加入量(μl) 终浓度
2×Premix缓冲液(dNTP free) 10 1×
dNTP Mix(10mM) 0.4 200μM
ROX参比染料(0.5μM) 0.8 0.02μM
甲酰胺DMF 0.15 /
上游引物(10μM) 0.8 0.4μM
下游引物(10μM) 1.6 0.8μM
野生型探针(10μM) 0.4 0.2μM
突变型探针(10μM) 0.9 0.45μM
Enzyme(6U/μl) 0.4 1×
模板 2 /
纯化水 Up to 20 /

[0065] 荧光PCR扩增程序：

[0066]

[0067] (5)利用SPSS软件对其Ct值进行分析，具体如表1所示。

[0068] 表1

[0069]  N 极小值 极大值 均值 标准差
白细胞浓度(×109个/L) 126 4.05 10.00 6.6997 1.65566
Ct(FAM) 126 22.62 27.53 25.1644 1.12487
Ct(VIC) 126 22.64 27.93 25.5420 1.19340
有效的N(列表状态) 126        

[0070] 据上表，得出Ct值范围确定为22‑28。

[0071] (6)筛选白细胞浓度介于4×109‑10×109个/L的杂合子样本，杂合子测序验证方法同步骤(1)和(2)。

[0072] (7)对步骤(6)筛选出的样本进行处理，处理方法如下：

[0073] ①在100μl EDTA抗凝全血中加入1ml纯化水，涡旋30s。

[0074] ②12000×g离心1min，使得白细胞沉降，移除上清。

[0075] ③加入100μl的缓冲液A溶液重悬。

[0076] 其中缓冲液A的配方包括：

[0077] Tris‑HCl:5mmol/L

[0078] EDTA:0.5mmol/L

[0079] NP‑40:0.5％

[0080] BSA：0.1mg/ml

[0081] (8)荧光PCR扩增，获得对应的Ct值，观察其Ct值范围是否介于22‑28，如果是，则将该管产物作为质控品，如果不是，则舍弃。

[0082] 以上步骤(1)至(5)可以认为是质控品筛选条件确认步骤。步骤(6)至 (8)可以认为是依据质控品筛选条件的质控品制备步骤。

[0083] 在质控品筛选条件确认步骤和质控品制备步骤中的样本测序方法，可以选择以基因组DNA为模板进行扩增后进行测序，也可选择以血液为模板进行扩增后进行测序。在本实施例中，以血液为模板进行扩增后的测序。

[0084] 实施例2质控品的精密度测试

[0085] 1.实验方法

[0086] 参照《核酸扩增检测用试剂(盒)》行业标准(YY/T 1182‑2010)的标准，对实施例1中制备获得的同一批号质控品，分别连续测定10次，计算测定结果的平均值 和标准差S1，按下列公式计算管内变异系数

[0087] 2.指标要求：CV≤5％

[0088] 3.实验结果：见下表2

[0089] 表2

[0090]

[0091] 4.结果描述

[0092] 质控品批内精密度≤5％。

[0093] 实施例3质控品的稳定性测试

[0094] 1.实验方法

[0095] 将实施例1制备的质控品分别置于37℃，2‑8℃以及‑20℃进行稳定性测试，其中37℃为热稳定性测试，2‑8℃为暂存稳定性测试(评估短期使用是否可以暂存于2‑8℃，从而避免反复冻融)，‑20℃为效期稳定性测试。

[0096] 将上述处理后的质控品进行荧光PCR扩增(SLCO1B1(388A>G)引物和探针序列如下)，分析其Ct值。具体扩增体系和程序如下：

[0097] 上游引物序列：5’‑TAAACAAGTGGATAAGGTCGATGTTG‑3’

[0098] 下游引物序列：5’‑AGATAATGGTGCAAATAAAGGGGAAT‑3’

[0099] 野生型探针序列：5’‑FAM‑TCCCCTATTCCACGAAGCA‑MGBNFQ‑3’[0100] 突变型探针序列：

[0101] 5’‑VIC‑AATGTTTAAAATGAAACACTCTCTTATC‑MGBNFQ‑3’

[0102] 扩增体系：

[0103]物料名称 加入量(μl) 终浓度
2×Premix缓冲液(dNTP free) 10 1×
dNTP Mix(10mM) 0.4 200μM
ROX参比染料(0.5μM) 0.8 0.02μM
甲酰胺DMF 0.15 /
上游引物(10μM) 0.8 0.4μM
下游引物(10μM) 1.6 0.8μM
野生型探针(10μM) 0.4 0.2μM
突变型探针(10μM) 0.9 0.45μM
Enzyme(6U/μl) 0.4 1×
模板 2 /
纯化水 Up to 20 /

[0104] 扩增程序：

[0105]

[0106] 2.实验结果

[0107] 将上述三个条件下的结果进行分析，其结果如附图1‑3所示。结果显示，实施例1制备的质控品，在37℃条件下，其15天的热稳定性较好；在2‑8℃条件下，其8周的暂存稳定性良好；在‑20℃条件下，其24个月的效期稳定性良好。

[0108]

[0109]