用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法

摘要

本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开了用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法。本发明的用于分别或同时检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测的引物探针组合，含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑9所示。采用所述引物探针组合进行检测时，具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测简便快速，具有实际应用价值。

权利要求

1.用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针组合，其特征在于，含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑9所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；

所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。

4.用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的病毒基因组保守区靶标组合，其特征在于，含有三条靶标，其中，靶标的序列如SEQ ID NO.10‑12所示。

5.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合或权利要求4所述的病毒基因组保守区靶标组合在制备用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的试剂盒中的应用。

6.用于拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒单独或同时检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组合，和/或，权利要求4所述的病毒基因组保守区靶标组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行实时荧光定量RT‑PCR检测时的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s，运行

40个循环。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT‑PCR检测时，每25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，用无RNA水解酶的纯净水补足至25μL。

9.一种非疾病诊断目的利用实时荧光定量RT‑PCR分别检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的方法，其特征在于，以待测样品的RNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1‑6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7‑9所示的特异性探针进行实时荧光定量RT‑PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有相应病毒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT‑PCR的反应程序为：

50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s，运行40个循环；

所述实时荧光定量RT‑PCR的每25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，RNase Free Water补足至25μL。

说明书

用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、

靶标组合、试剂盒和方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒检测技术领域，具体地说，涉及一种用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法。

背景技术

[0002] 沙粒病毒由外膜和核衣壳组成，呈圆形，含有脂质(外)胞膜，直径约为50‑300nm(平均110‑130nm)。外膜表面覆盖有一种蛋白组成的、长度约10nm的纤突，内部可见不同数量的来自宿主细胞的核糖体，在电镜下形如沙粒样，沙粒病毒因此而得名。病毒基因组由双向分节段的单股负义链RNA组成，较大的为L片段，长度约7400个核苷酸，编码RNA依赖的RNA聚合酶L蛋白和具有转录复制调节功能的Z蛋白；较小的为S片段，长度约3400个核苷酸，编码核蛋白NP和糖蛋白GP。L和S片段在病毒粒子中并非等量，而是以2：1的摩尔比存在。每个片段上的基因分别被含有发卡结构非编码区隔开，5’端无帽状结构，3’端序列保守。由于S片段较L片段更为保守，因此常用S片段进行病毒进化研究和分类鉴定。

[0003] 根据ICTV(国际病毒学分类委员会)2018年最新颁布病毒分类(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)，沙粒病毒科分为4个属：Antennavirus、
Hartmanivirus、Mammarenavirus和Reptarenavirus，包含43个种。哺乳动物沙粒病毒属(Mammarenavirus)中35个种可分为旧世界沙粒病毒和新世界沙粒病毒，旧世界沙粒病毒中，代表病毒是淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒简称LCMV病毒。新世界沙粒病毒主要包括有4个clade，clade A有Pirital，Pichinde，Flexal，Parana和Alloahuayo virus五种病毒；clade B有Junin,Machupo,Guanarito,Amapari,Tacaribe,Sabia,Cupixi和Chapare viruses八种病毒；clade C有Oliveros和Latino两种病毒；clade A/Rec包括有Whitewater Arroyo,Tamiami和Bear Canyo三种病毒；系统进化树显示Lujo virus属于新世界沙粒病毒，但不在四个clade中。目前，已发现对人致病的沙粒病毒主要有拉沙病毒(Lassa virus)引起拉沙热，胡宁病毒(Junin virus)引起阿根廷出血热，马秋波病毒(Machupo virus)和查帕雷病毒(Chapare virus)引起玻利维亚出血热，卢约病毒(Lujo virus)引起卢约出血热，瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)引起委内瑞拉出血热，萨比亚病毒(Sabid virus)引起巴西出血热，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)引起淋巴细胞脉络丛脑膜炎。

[0004] 拉蒂诺病毒于1973年在玻利维亚胼胝暮鼠(Calomys callosus)中首次被发现，该病毒主要局限于玻利维亚的啮齿类动物中传播；莫巴拉病毒于1983年在中非共和国柔毛鼠(Arvicanthis sp)首次被发现，该病毒主要局限于中非的啮齿类动物中传播；莫佩亚病毒于1977年在坦桑尼亚莫洛戈罗地区的多乳鼠(Mastomys natalensis)首次被发现。目前，该病毒主要局限于津巴布韦、莫桑比克地区的啮齿类动物中传播。

[0005] 病毒病实验室检测主要依靠于病毒分离、血清学检测和病毒核酸检测。病毒核酸检测主要是基于PCR技术，实时荧光定量RT‑PCR有着快速、高灵敏度和特异度的优点，是目前运用较多的实验室检测方法。该方法基于荧光共振能量迁移的原理，通过对荧光强度变化监测产物量的变化，随着反应时间的进行，将监测到的荧光信号的变化绘制一条曲线。该方法全程闭管操作，降低了污染的风险；对PCR产物除了可以进行定性分析，也可通过绘制标准曲线进行定量分析。

[0006] 在人兽共患病发生率不断提高的形势下，有必要提供一种针对拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒等罕见沙粒病毒的检测方法。

发明内容

[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种特异性和灵敏性佳的，可同时或分别检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测引物、探针、靶标、试剂盒和方法。

[0008] 为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

[0009] 本发明提供一种用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的(实时荧光定量RT‑PCR)引物探针组合，其含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑9所示。

[0010] 上述特异性引物和特异性探针中，针对拉蒂诺病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.7所示；针对莫巴拉病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.3‑4所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.8所示；针对莫佩亚病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.5‑6所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.9所示。

[0011] 本发明结合相关啮齿类动物病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，建立以拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒为组合的检测方案。

[0012] 具体先在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等数据库中检索下载拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的基因组序列，选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列文件分别进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类。根据序列比对分析结果，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析，筛选确定在各病毒基因型中高度保守的靶序列，根据靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列分别如SEQ ID NO.1‑6、SEQ ID NO.7‑9所示的分别针对拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的三对特异性引物和三条特异性探针，获得检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒检测的实时荧光定量RT‑PCR的引物探针组合。

[0013] 作为优选，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；

[0014] 所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

[0015] 进一步优选地，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。

[0016] 本发明还提供用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的病毒基因组保守区靶标组合，含有三条靶标，其中，靶标的序列如SEQ ID NO.10‑12所示。

[0017] 上述病毒基因组保守区靶标组合中，针对拉蒂诺病毒的靶标序列如SEQ ID NO.10所示；针对莫巴拉病毒的靶标序列如SEQ ID NO.11所示；针对莫佩亚病毒的靶标序列如SEQ ID NO.12所示。

[0018] 本发明还提供上述引物探针组合或上述病毒基因组保守区靶标组合在制备用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的试剂盒中的应用。

[0019] 本发明另提供用于拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒单独或同时检测的试剂盒，其包含上述的引物探针组合，和/或，上述病毒基因组保守区靶标组合。

[0020] 作为优选，所述试剂盒还包含拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的阳性对照标准品。

[0021] 所述拉蒂诺病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或者拉蒂诺病毒RNA。所述莫巴拉病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者莫巴拉病毒RNA；所述莫佩亚病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或者莫佩亚病毒RNA。

[0022] 进一步优选地，所述试剂盒还包含其它为实现实时荧光定量RT‑PCR检测的试剂，包括但不限于反应缓冲液、酶和水等。

[0023] 本发明中，所述试剂盒进行实时荧光定量RT‑PCR检测时的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s，运行40个循环。

[0024] 采用上述反应程序，能够更好地保证拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的高效扩增检测。

[0025] 本发明中，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT‑PCR检测时，每25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，用无RNA水解酶的纯净水补足至25μL。

[0026] 本发明提供的引物探针组合可在不同的反应体系中分别进行拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的检测，也可在同一反应体系中同时进行上述三种病毒的检测。

[0027] 当在不同的反应体系中分别进行拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的检测时，以上所述的上游引物为SEQ ID NO.1、3或5所示引物中的任一条，下游引物为SEQ ID NO.2、4或6所示引物中的任一条，探针为SEQ ID NO.7、8或9所示的探针中的任一条。

[0028] 当在同一反应体系中同时进行拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的检测时(三重实时荧光定量RT‑PCR)，以上所述的25μL反应体系中，SEQ ID NO.1、3、5所示的上游引物各0.5μL，SEQ ID NO.2、4、6所示的下游引物各0.5μL，SEQ ID NO.7‑9所示的探针各0.25μL。

[0029] 本发明还提供一种非疾病诊断目的利用实时荧光定量RT‑PCR分别检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的方法，其以待测样品的RNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1‑6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7‑9所示的特异性探针进行实时荧光定量RT‑PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有相应病毒。

[0030] 上述提取病毒总RNA的方法可采用本领域常规方法，如离心柱提取法。

[0031] 作为优选，所述实时荧光定量RT‑PCR的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s，运行40个循环；

[0032] 所述实时荧光定量RT‑PCR的每25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，RNase Free Water补足至25μL。

[0033] 作为优选，上述根据扩增曲线判断待测样品中是否含有相应病毒(拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒)的方法如下：

[0034] 有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38；

[0035] 若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35

[0036] 无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。

[0037] 上述结果判定中，拉蒂诺病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或者拉蒂诺病毒RNA。所述莫巴拉病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者莫巴拉病毒RNA；所述莫佩亚病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或者莫佩亚病毒RNA。

[0038] 本发明所述的拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测反应体系适用于所有的实时荧光定量PCR仪。

[0039] 本发明的有益效果至少在于：

[0040] 本发明结合相关病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，形成以拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒为检测靶标的新的组合检测方案。

[0041] 本发明通过大量序列比对分析确定了拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒高度保守的靶序列，针对确定的靶序列通过大量筛选和优化，分别获得了适用于实时荧光定量RT‑PCR检测的特异性引物和探针，该引物和探针在拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的各个基因型中具有很好的普适性。

[0042] 本发明建立了检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的单独或同时实时荧光定量RT‑PCR检测方法。该方法在一个实时荧光定量RT‑PCR反应体系内，引入针对拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的三对特异性引物和不同标记的探针，通过实时荧光信号的动态变化，对未知样本进行定性分析；也可通过标准参考品的检测，绘制标准曲线，实现对未知模板的定量分析。与其它检测方法相比，本发明提供的检测方法具有高灵敏性和特异性、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染等优点，可直接对未知样本里提取的RNA进行检测，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。

[0043] 本发明检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的特异性引物、探针以及实时荧光定量RT‑PCR检测方法可用于疑似病例、宿主动物、媒介生物、商品货物筛查。在疾病的早发现、早诊断方面具有重要意义。

附图说明

[0044] 图1为本发明实施例4中实时荧光定量RT‑PCR检测不同浓度的拉蒂诺病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

[0045] 图2为本发明实施例4中实时荧光定量RT‑PCR检测不同浓度的莫巴拉病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

[0046] 图3本发明实施例4中实时荧光定量RT‑PCR检测不同浓度的莫佩亚病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

具体实施方式

[0047] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0049] 实施例1拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的特异性引物和探针的设计[0050] 1、引物和探针的设计和筛选

[0051] 在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等国际公开数据库中下载拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的基因组序列。选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列文件分别进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类，根据序列比对分析结果筛选确定在拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的各个基因型中高度保守的靶序列。

[0052] 针对上述靶序列设计特异性引物和探针，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析进行特异性引物和探针的设计和筛选。

[0053] 本发明经过大量设计、筛选和对比实验发现，并非单单满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现高效特异灵敏的实时荧光定量RT‑PCR检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒。还需针对引物、探针与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行大量人工优化设计和筛选，最终得到如下分别针对拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的特异性引物对和特异性探针：

[0054] 拉蒂诺病毒：

[0055] 特异性引物：

[0056] Latino‑F：5’‑TGGCTGCTTGAGACMATG‑3’(SEQ ID NO.1)

[0057] Latino‑R：5’‑ACACATGACAGGTGCGAT‑3’(SEQ ID NO.2)

[0058] 特异性探针：

[0059] Latino‑P：5’‑ACCTAAGCATCAGCAAGCCAGGAAARC‑3’(SEQ ID NO.7)；

[0060] 莫巴拉病毒：

[0061] 特异性引物：

[0062] Mobala‑F：5’‑ATGTCCTTCCTTCCTTGAGAG‑3’(SEQ ID NO.3)

[0063] Mobala‑R：5’‑CTTGACCAGTGCAGTGTT‑3’(SEQ ID NO.4)

[0064] 特异性探针：

[0065] Mobala‑P：

[0066] 5’‑TCCAGCAGCTTTCTGATATCTTCGACACCTTG‑3’(SEQ ID NO.8)；

[0067] 莫佩亚病毒：

[0068] 特异性引物：

[0069] Mopeia‑F：5’‑ACCCATTCCGACCATCTG‑3’(SEQ ID NO.5)

[0070] Mopeia‑R：5’‑CCTCTTGCTGCTGGAGTCTA‑3’(SEQ ID NO.6)

[0071] 特异性探针：

[0072] Mopeia‑P：5’‑TGTAACAAAACCCTCCTCTGTTCTAGCTGCTG‑3’(SEQ ID NO.9)。

[0073] 2、引物和探针的合成

[0074] 上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。其中，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。

[0075] 实施例2实时荧光定量RT‑PCR检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的检测方法的建立

[0076] 1、病毒核酸的提取：收集待测病毒的细胞培养上清，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒核酸。

[0077] 2、阳性标准品的制备

[0078] 对于三种病毒，通过合成三种病毒基因的保守区(如SEQ ID NO.10‑12所示)作为阳性标准品，将合成的目的基因克隆至pET‑28a(+)载体中(酶切位点：NdeⅠ和XhoⅠ)，基因合成与质粒克隆由北京天一辉远生物公司完成。用thermo公司2×PCR Mix试剂对克隆质粒中含有的目的基因进行普通PCR扩增，扩增引物用通用引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID NO.13)和T7t(ACATCCACTTTGCCTTTCTC，SEQ ID NO.14)。体外转录为RNA，纯化回收定量而获得。采用Qian公司Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化PCR产物，Nanodrop紫外可见分光光度计对回收的DNA模板定量。采用Promega公司Ribomaxtm large scale RNA production system‑sf6and T7试剂盒进行目的基因的RNA体外转录，Qian公司RNeasy mini kit对RNA体外转录产物回收。上述操作均按照试剂盒说明进行。

[0079] 3、实时荧光定量RT‑PCR检测

[0080] 采用AgPath‑ID One Step RT‑PCR Kit(Ambion)试剂盒进行实时荧光定量RT‑PCR反应，利用实施例1最终获得的特异性引物(序列如SEQ ID NO.1‑6所示)和探针(序列如SEQ ID NO.7‑9所示)进行实时荧光定量RT‑PCR检测。

[0081] 本发明通过优化实施例1获得的用于三种病毒检测的特异性引物和探针的反应条件，使其能够实现高效的组合检测，具体反应条件如下：

[0082] 25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL；

[0083] 反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s，运行40个循环。

[0084] 4、结果分析和判断

[0085] 检测结果需根据反应体系中所设置的阳性对照(或检测管内标)、用无RNA水解酶的去离子水作为阴性对照的扩增结果和扩增曲线进行判断。

[0086] 阳性对照：

[0087] 载体：PET‑28a(+)

[0088] 酶切位点：NdeⅠ和XhoⅠ

[0089] 目的基因拉蒂诺病毒：

[0090] ATTCATCACAATGTAACCAATTGCGTGCAGAACATTTCCGAACATGAGGGTGTGCTCAAATGGCTGCTTGAGACAATGCACCTAAGCATCAGCAAGCCAGGAAAACACATCGCACCTGTCATGTGTGAGAGACAAAAGGGGTTGCTCATCGAGTACAATCTCACTATGACCAAAGACCACCACCCAAATTATTGGAATCA(SEQ ID NO.10)；

[0091] 目的基因莫巴拉病毒：

[0092] GTTCAAATTTTCTTGCATCGGCCTTTTGCATTGAGACATCAATTAGTTTAATGTCCTTCCTTCCTTGAGAGTCCAGCAGCTTTCTGATATCTTCGACACCTTGGCAAGTCAGGACCATGTTCTTTGGAAGGTTCTCCAACACTGCACTGGTCAAGCCTGGCTGTGTTGTGAAAAGATCTTGAACATCAATACCATGTGAA(SEQ ID NO.11)；

[0093] 目的基因莫佩亚病毒：

[0094] GAACCCGCCACCCATTCCGACCATCTGTAACAAAACCCTCCTCTGTTCTAGCTGCTGAGCTGTTAGGTTGCCCATATAGACTCCAGCAGCAAGAGGCCTCTCACCTCTGATGACTTTTGCTTTGAGTCTGTCCAGGTCGGCAGCAAGGACGAGGAGGTCA(SEQ ID NO.12)。

[0095] 有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38。

[0096] 若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35

[0097] 无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。

[0098] 实施例3实时荧光定量RT‑PCR检测方法的特异性分析

[0099] 以拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒体外转录合成的RNA标准品作为阳性对照，将汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、登革病毒1～4型病毒，鸠宁病毒、Sabia病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒共8种沙粒病毒RNA，和100份健康人血清RNA提取物作为对照病毒，对实施例2提供的检测方法进行特异性分析。

[0100] 采用实施例2的检测方法进行实时荧光定量RT‑PCR检测，具体处理组设计如下：以8
拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒体外转录合成的RNA标准品(浓度为1×10copies/uL)为阳性对照；以汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTS病毒)、登革病毒1～4型病毒，鸠宁病毒、Sabia病毒(萨比亚病毒)、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV病毒)共8种沙粒病毒RNA，和100份健康人血清RNA提取物进行特异性验证。

[0101] 结果显示如下表1所示：

[0102] 表1三种沙粒病毒实时荧光定量RT‑PCR检测方法特异性分析

[0103]

[0104]

[0105] 实施例4实时荧光定量RT‑PCR检测方法的灵敏度(检测限)分析

[0106] 对实施例2制备的拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒体外转录的RNA(阳性标23
准品)进行定量，根据如下公式计算RNA拷贝数：Y(copies/μl)＝X(g/μl)×6.02×10 /核苷酸转录长度×340，其中Y为RNA拷贝数，X为RNA的浓度。对上述已知浓度的RNA进行10倍系列稀释，对体外转录的拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒标准品RNA稀释成1×
8 1
10copies/μL至1×10copies/μL共8个浓度梯度。

[0107] 以上述梯度稀释的不同浓度的RNA为模板，采用实施例2中的检测方法进行实时荧光定量RT‑PCR检测，确定实施例2的检测方法的检测限。

[0108] 各病毒各浓度的扩增曲线如图1、图2和图3所示，各图中，扩增曲线从左至右依次8 7 6 5
代表，病毒浓度为1×10copies/μL、1×10copies/μL、1×10copies/μL、1×10copies/μ
4 3 2 1
L、1×10copies/μL、1×10copies/μL、1×10copies/μL、1×10 copies/μL时的结果。以不同浓度样本的拷贝数为横坐标，循环阈值(CT)为纵坐标，制作标准曲线，通过所得标准曲线获得三种病毒实时荧光RT‑PCR的检出限(表2)，根据结果可知实施例2的检测方法具有良好的灵敏度。

[0109] 表2拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的实时荧光定量RT‑PCR结果[0110]

[0111] 实施例5实时荧光定量RT‑PCR检测方法的可重复性分析

[0112] 分别选取稀释度为1×106copies/μL、1×104copies/μL、1×102copies/μL的三个不同浓度梯度的拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒体外转录RNA标准品为模板，分别进行5次平行重复实验验证实施例2提供的检测方法的稳定重复性。

[0113] 循环阈值的平均值、变异系数(CV)和标准差(SD)的结果如表3所示，拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒各次检测实验的标准差均控制在0.5以内，变异系数2％以下(结果见表3)，说明实施例2的检测方法具有较好的稳定性和可重复性。

[0114] 表3拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒实时荧光定量RT‑PCR检测方法的稳定性评价

[0115]

[0116] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。