一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用

摘要

本发明属于大肠杆菌噬菌体技术领域，尤其涉及一株能裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体分离物及其在杀菌和防菌中的应用。本发明主要公开了一株大肠杆菌噬菌体EC35P1（Escherichia coli phage EC35P1），保藏编号为CCTCC M 2020438。本发明的噬菌体是从自然界中分离获得的烈性噬菌体，经试验证明其对正常微生物菌群无毒害作用，且其DNA无法编码毒力基因，稳定性高；本发明的噬菌体宿主范围较广，除可裂解大肠杆菌外，还可裂解志贺氏菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌，且可实现大规模工业生产。该噬菌体为开发新型抗菌制剂提供了优良菌种资源，具有良好的应用开发前景。

权利要求

1.一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，将大肠杆菌噬菌体EC35P1用于制备抑制或杀灭阴沟肠杆菌或志贺氏菌的制剂或组合物。

2.根据权利要求1所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，所述制剂或组合物还包括化学性消毒剂。

3.根据权利要求2所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，所述化学性消毒剂为双癸基二甲基氯化铵或新洁尔灭中的一种。

4.根据权利要求3所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，所述双癸基二甲基氯化铵的终浓度为0.05％或新洁尔灭的终浓度为

0.01％。

5.根据权利要求1所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，所述制剂或组合物还包括保藏编号为CCTCC M 2016285的金黄色葡萄球菌噬菌体JIP2。

6.根据权利要求5所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，所述制剂或组合物由大肠杆菌噬菌体EC35P1和金黄色葡萄球菌噬菌体JIP2等数量比组成。

7.根据权利要求2‑6任意一项所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，所述制剂或组合物中大肠杆菌噬菌体EC35P1效价为9

5x10PFU/mL。

8.根据权利要求5或6任意一项所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬9

菌体EC35P1的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌噬菌体JIP2的效价为5x10PFU/mL。

9.一种权利要求1所述的一种保藏编号为CCTCC M 2020438的大肠杆菌噬菌体EC35P1的应用，其特征在于，将所述制剂或组合物用于制备预防或治疗由阴沟肠杆菌或志贺氏菌导致的疾病的药物。

说明书

一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体及其组合

物、试剂盒和应用

技术领域

[0001] 本发明属于大肠杆菌噬菌体的研发技术领域，尤其涉及一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体、组合物及其应用。

背景技术

[0002] 埃希氏大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，是人和动物肠道中的常居菌，可分为致病性和非致病性两大类。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为二百多个型，其中一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物具有致病性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症。大肠杆菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经 60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。大肠杆菌在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中则存活更久。

[0003] 禽大肠杆菌病是一种条件性疾病，在卫生条件差、饲养管理不良的情况下，很容易造成此病的发生。禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌引起的多种病的总称，包括大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、心包炎、肝周炎、卵黄性腹膜炎等疾病，对禽类养殖业危害严重。

[0004] 沙门氏菌属肠杆菌科，为革兰氏染色阴性杆菌，绝大多数有鞭毛并能运动。按照考夫曼―怀特的分类，已确认的沙门氏菌属有2000多个血清型，根据沙门氏菌抗原结构的不同，可将其分为A、B、C、D、E……等34个组。引起人类疾病的沙门氏菌绝大多数属于A～E组，其中主要有猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠类沙门氏菌、鸡沙门氏菌、鸭沙门氏菌等10多个血清型。在自然界中，沙门氏菌有广泛的动物寄主：鸡、鸭、鹅等家禽和猪、牛、羊、马等家畜，以及各种兽类、鱼类、鼠类均可带菌，甚至从蝉及某些昆虫中也可分离出沙门氏菌。
由于沙门氏菌存在于这些动物寄主的肠腔内，因此在家禽家畜屠宰、加工过程中其肉均可感染沙门氏菌；患病动物屠宰后直接出售更易传播沙门氏菌，蛋类或蛋制品同样可遭沙门氏菌污染。

[0005] 禽沙门氏菌病是由沙门氏菌属种的一种沙门氏菌所引起的禽类的急性或慢性疾病的总称。由鸡白痢沙门氏菌所引起疾病的称为鸡白痢；由鸡伤寒沙门氏菌引起的疾病称为禽伤寒；由其他有鞭毛能运动的沙门氏菌所引起的禽类疾病则统称为禽副伤寒。禽沙门氏菌病在世界各地普遍存在，严重危害禽类养殖业的发展。据报道，一些沙门氏菌携带具耐药因子的遗传质粒，耐药因子可传递对多种抗生素的耐药性，尤其可在敏感细菌中散播，给治疗沙门氏菌感染造成困难。

[0006] 阴沟肠杆菌是肠杆菌目肠杆菌科肠杆菌属的一种细菌，广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，是肠道正常菌种之一。阴沟肠杆菌已成为医院感染越来越重要的病原菌，其引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组织感染、泌尿道感染呼吸道感染以及败血症等。由于阴沟肠杆菌可产生具致病性的细菌内毒素，同时该菌对消毒剂及抗生素具有强烈的耐药性。据报道，阴沟肠杆菌可引起肉雏鸡发病并导致死亡。

[0007] 志贺氏菌，又称痢疾杆菌，是一类革兰氏阴性菌。该菌耐寒，能在普通琼脂培养基上经过24小时生长，形成直径达2mm大小、半透明的光滑型菌落；志贺氏菌在肠道杆菌选择性培养基上则形成无色菌落，大小为0.5～0.7×2～3μ m。志贺氏菌无芽胞，无荚膜，无鞭毛，多数有菌毛。志贺氏菌是人类和灵长类动物的肠道致病菌，可引起细菌性痢疾。此外，有学者发现志贺氏菌可感染雏鸡，导致其大批发病和死亡，其发病率可达100％,用药后死亡率仍达 31.84％～33.13％,给养鸡业造成了较大经济损失。

[0008] 噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具备强大的杀菌能力，噬菌体可作为一种抗细菌感染制剂使用，自20世纪初以来一直受到国内外许多学者关注。

[0009] 孙利厂等人(《中国动物传染病学报》2018,12,10)从养殖场采集的污水样品中分离到宽噬菌谱肠出血性大肠杆菌烈性噬菌体，并进行了噬菌斑、噬菌谱、形态学(透射电镜)、遗传物质、酸碱及热稳定性、一步生长曲线等生物学特性及控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌的污染研究。

[0010] 中国专利CN106591241A公开了一种新型肠出血性大肠杆菌O157，以用于防治污水排放或回用引发的肠出血性大肠杆菌O157的污染。

[0011] 中国专利CN110129283A公开了一种短尾强裂解性大肠杆菌噬菌体，命名为PD38，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日，保藏编号为CGMCC No.16391。该噬菌体对大肠杆菌具有较好的裂解作用，对食品、养殖环境中的大肠杆菌具有良好的消杀作用，同时可以防治鸡大肠杆菌引起的疾病。

[0012] 中国专利CN109251899A公开了一种耐药大肠杆菌噬菌体及其应用。分类命名为Escherichia phage vB_EcoP‑EG1，保藏号为：CCTCC M 2018562，保藏日期为2018年8月21日。

[0013] 中国专利CN106754751A一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用，该噬菌体菌株保藏号为CCTCC NO：M 2016539，于2016年9月29日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，分类命名为肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_ ECM_MIE，Entero‑hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 phage vB_ECM_MIE；对EHEC具有高效杀菌能力。

[0014] 韩国专利KR102003786B1公开了一种新的大肠杆菌特异性噬菌体EcoH7 及其制备方法。该噬菌体EcoH7对大肠杆菌具有非常高的特异性，可以解决大肠杆菌对抗生素的耐药性与食品中的大肠杆菌的残留问题，且具有广泛的宿主范围，可广泛用于抗生素、组合物、饲料、消毒剂或清洗剂领域。

[0015] 美国专利US10265353B2公开了一种从自然界中分离的能够特异性杀死肠出血性大肠杆菌菌株的肌病毒科噬菌体ESC‑CHP‑1，保藏号：KCTC12660bp，使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物可以预防和治疗肠出血性大肠杆菌的感染。

[0016] 美国专利US7635584B2公开了一种对大肠杆菌O157:H7菌株具有强裂解活性的分离的噬菌体，以及使用该噬菌体和/或衍生自该噬菌体的后代或衍生物来控制大肠杆菌O157:H7在各种环境中的生长的方法。

[0017] 上述技术存在以下缺陷：关于大肠杆菌噬菌体的研究主要集中于肠出血性噬菌体裂解性方面，针对大肠杆菌噬菌体还能裂解其它属的细菌和应用方面的研究鲜见报道。故亟需寻找一株能同时杀灭多种细菌、且稳定性高、安全性好、效价高的新型大肠杆菌噬菌体分离物。

发明内容

[0018] 本发明的目的之一在于提供一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体、组合物及其应用，具有稳定性高，安全性好，效价高的特点。

[0019] 本发明采用一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)，保藏编号为CCTCC M 2020438；所述大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

[0020] 进一步的，所述大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 在pH为4～11，温度为4℃～70℃条件下具有良好的耐受性，MOI＝0.1条件下培养8h，其效价高达11
1×10 PFU/mL。

[0021] 通过上述技术方案，大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichiacoli phage EC35P1)，除了对大肠杆菌有较高的裂解率，还对沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌具有较好的裂解效果。

[0022] 本发明的目的之二在于提供一种能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的组合物，大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)具有较广的宿主范围，且耐受性强，也可以与其它物质混合，满足一些特异性的用途要求。

[0023] 本发明的上述发明目的二是通过以下技术方案得以实现的：一种含有上述能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的组合物，组合物中至少含有一株大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)。

[0024] 通过上述技术方案，将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)和其他噬菌体联合使用，以获得更宽的裂解谱范围。作为示例性的说明，大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)与其他噬菌体之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。

[0025] 本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：组合物还包括化学性消毒剂。

[0026] 本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：采用的化学性消毒剂为0.05％的双癸基二甲基氯化铵或浓度为0.01％的新洁尔灭中的一种。

[0027] 本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述组合物中还包括金黄色葡萄球菌噬菌体JIP2(Staphylococcus aureus phage JIP2)。

[0028] 将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)和其他抗菌剂混合使用，以获得抗菌广谱性的同时还可对大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌特异性杀灭。此处能与本方案中的噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化学抗菌剂。作为示例性的说明，大肠杆菌噬菌体EC35P1与其他抗菌剂之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。本方案的大肠杆菌噬菌体EC35P1还可以与其它噬菌体形成组合物联用。

[0029] 本发明的目的之三在于提供一种含有上述能同时裂解大肠杆菌沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的组合物的试剂或试剂盒。

[0030] 本发明的目的之四在于提供一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的应用。

[0031] 本发明的上述发明目的四是通过以下技术方案得以实现的：将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)作为生物杀菌剂、消毒剂使用。

[0032] 通过采用上述技术方案，将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)作为新型的安全的环境生物杀菌剂，可以特异性地杀灭环境中的大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌，改善环境中的微生物分布。

[0033] 将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)用于畜禽产品养殖、运输及保存的生物杀菌剂，可以防治在畜禽养殖、运输及保存过程中致病性的大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌的污染。

[0034] 将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)单独或与其他抗菌5
物质混合使用，对被大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌污染的食品表面喷洒10
6
～10 PFU/mL的噬菌体，可以在12h内完全灭活上述细菌，可以应用于防治食品表面的上述细菌污染。

[0035] 将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)作为杀菌剂，喷洒于食品生产车间，可特异性、持续性地防治该环境中的大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌，同时可防治食品加工过程中上述细菌的污染。

[0036] 将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)作为新型的安全的环境消毒剂，可以有效地杀灭环境中的大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌。

[0037] 本发明的目的之五在于提供一株能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的应用。

[0038] 本发明的上述发明目的五是通过以下技术方案得以实现的：将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)作为饲料添加剂、保健品、预防药品、治疗药物或医疗器械。

[0039] 通过采用上述技术方案，将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)作为一种潜在药物或保健品，治疗和预防因大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌引起的细菌感染。将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)单独或混合使用，作为潜在的饲料添加剂，添加于饲料中，可特异性、持续性地防治饲料生产储存及动物养殖中大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌的污染。此外，还可抑制动物肠道中上述四种细菌的感染，增强动物抵抗力。

[0040] 将大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)可以做为一种医疗器械，治疗和预防因大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌及志贺氏菌引起的细菌感染。

[0041] 本发明的目的之六在于提供一种能同时裂解上述四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的组合物，或上述能同时裂解四种细菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的试剂或试剂盒。

[0042] 本发明的上述发明目的六是通过以下技术方案得以实现的：一种能同时裂解四种菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的组合物，或能同时裂解四种菌的宽谱大肠杆菌噬菌体的试剂或试剂盒，在预防和治疗由大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌引起的疾病中的应用。

[0043] 本申请具有如下有益效果：

[0044] (1)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；对沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌也具有高毒性；具有较广的宿主范围。

[0045] (2)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 是从自然界中分离获得的烈性噬菌体，经毒理实验证明其安全、无任何副作用；供试噬菌体DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白，且不含毒力基因或不良基因；本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。

[0046] (3)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 在非致11
病性细菌宿主上可较好增殖；MOI＝0.1条件下培养8h，其效价高达1×10  PFU/mL，可进行大规模发酵培养；本发明为工业化生产噬菌体杀菌剂提供了优质噬菌体株来源。

[0047] (4)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 具有良好的稳定性：其培养液可于室温下存活41周；且于4℃下可保存24个月；大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)在50℃下水浴24h，效价仅降低一个数量级；在608
℃下水浴48h依然有10 PFU/mL的噬菌体存在；同时在70℃水浴2h仍具有80％存活率。大肠杆菌噬菌体EC35P1具有良好的耐高温特性。

[0048] (5)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 具有良好的应用开发前景，可以由本领域技术人员根据本申请的记载和本领域常识制备成应用于治疗或预防由大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌等引起的禽类鸡脐炎，成鸡心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎综合征、鸡白痢，禽伤寒，禽副伤寒的药剂或试剂；也可由本领域技术人员根据本申请的记载和本领域常识制备成应用于治疗或预防由大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌等引起的其他病症的药剂或试剂。

[0049] (6)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 可被作为有效成分应用于制备组合物或快速检测试剂或试剂盒，以此检测由大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌引起的各类病症，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中携带的大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，因噬菌体稳定性高，故可有效确保检测的灵敏度。

[0050] (7)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)，可以单独或混合使用，用于但不限于杀死大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌，在浓度为3 9
10PFU/mL的大肠杆菌培养基中10PFU/mL的噬菌体对该浓度的大肠杆菌的杀灭率达到99％以上。大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、TSB培养基、LB培养基、氯游离水等。

[0051] (8)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)，可以有效杀灭鸡肉表面的大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌并防治鸡肉等肉类在保存过程中大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌的污染，可作为食品防护的各种产品的有效成分。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。

[0052] (9)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 可以单独或混合使用，可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成生物杀菌剂，饲料添加剂及治疗药物，应用于治疗或预防由大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌引起的感染性疾病。可被大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌感染的寄主包括人类、家畜(猪、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭、鹅等)，以及各种兽类、鱼类、鼠类等。

[0053] (10)本发明的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1) 可以应用于工业生产，可由宿主菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，可以开发为一种生物杀菌剂，用于防治大肠杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌感染。产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。

附图说明

[0054] 图1是大肠杆菌噬菌体EC35P1噬菌斑形态照片。

[0055] 图2是透射电子显微镜下大肠杆菌噬菌体EC35P1形态结构示意图。

具体实施方式

[0056] 以下实施例用于进一步阐述本申请，但不以任何的方式限制本申请的有效范围。

[0057] 以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。

[0058] 大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)，保藏编号为 CCTCC M2020438，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年 8月20日，保藏地址为中国武汉武汉大学；

[0059] 大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)，保藏编号为CCTCC M2018937，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年12月28 日，保藏地址为中国武汉武汉大学；

[0060] 沙门氏菌噬菌体SG8P3(Salmonella pullorumphage SG8P3)，保藏编号为CCTCC M2020205，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年6月12 日，保藏地址为中国武汉武汉大学；

[0061] 金黄色葡萄球菌噬菌体JIP2(Staphylococcus aureusphage JIP2)，保藏编号为 CCTCC M 2016285，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2016年 5月26日，保藏地址为中国武汉武汉大学；

[0062] 以下实例中，

[0063] TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；

[0064] TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；

[0065] TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000mL；

[0066] SM液配方为：氯化钠5.8g，硫酸镁2g，1mol/L Tris‑HCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水1000mL。

[0067] 实施例1大肠杆菌噬菌体EC35P1的分离制备及纯化培养

[0068] 本申请中大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)的来源样品采集于江苏省南京市江宁区生活污水，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22 μm滤膜过滤上清。

[0069] 噬菌体的分离：取10mL过滤后上清液，加入10mL 2倍TSB培养基中，同时加入1mL噬菌体宿主菌EC35对数期菌液，放置于37℃条件下培养8h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5mL噬菌体宿主菌对数期菌液，加入5mL、48℃半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μl，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养8h，形成噬菌体点滴斑。

[0070] 噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mL SM缓冲液中震荡1min，进行 10倍梯度稀2 4 6
释，取10 、10 和10稀释液分别加入对数期宿主菌0.5mL，混合均匀静置15min后，加入5mL，
48℃半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养8h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mL SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少 3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，参见图 1，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mL TSB培养基中，37℃条件下180rpm 摇培
8h。取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化的大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)。

[0071] 实施例2大肠杆菌噬菌体EC35P1的电镜观察

[0072] 取实施例1制得的噬菌体EC35P1培养物上清作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(PTA) 于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察。结果如图 2所示，在电子显微镜下观察大肠杆菌噬菌体EC35P1形态发现，为有尾噬菌体，无折叠，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部长约90～105nm，头部横径约50～60nm；尾部长约95～110nm,尾部宽约15～
25nm。基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，大肠杆菌噬菌体EC35P1被系统分类为肌尾科噬菌体(Myoviridae)。

[0073] 大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)保藏编号为 CCTCC M 2020438。

[0074] 实施例3大肠杆菌噬菌体EC35P1颗粒制备及基因组的提取与测序

[0075] 取100mL实施例1制得的噬菌体EC35P1，加入终浓度1μg/mL的DNaseI、RNaseA，37℃条件孵育60min后加入5.84g NaCl(终浓度1mol/L)，溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体聚乙二醇(PEG8000)至终浓度为10％(w/v)，待其完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀，即获得噬菌体颗粒浓缩液，4℃保存待用。

[0076] 采用λ噬菌体基因组DNA试剂盒提取噬菌体核酸并进行测序。经过核苷酸测序，所述大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

[0077] 实施例4大肠杆菌噬菌体EC35P1效价的测定

[0078] 用SM液做稀释液，将大肠杆菌噬菌体EC35P1(由实施例1制得)的原液10 倍梯度逐8 5 6 7 8
级稀释至l0 倍。分别取l0 、l0 、l0 及l0 稀释度的噬菌体培养液l000 μL与其宿主菌菌液
300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至
50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于
37℃倒置培养6～8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价 (PFU/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数

[0079] 从表1可以得出，大肠杆菌噬菌体EC35P1培养12h后具有1010PFU/mL以上的效价。

[0080] 表1培养12h后大肠杆菌噬菌体EC35P1的效价培养时间 4h 8h 12h
9 10 10
噬菌体EC35P1效价(PFU/mL) 5.5x10 1.0x10 1.5x10

[0081] 实施例5大肠杆菌噬菌体EC35P1的毒力基因或不良基因缺失检测试验

[0082] 本发明选取103种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表2)，通过测定大肠杆菌噬菌体EC35P1的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明供试噬菌体不含有下列毒力基因。

[0083] 表2病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因

[0084]

[0085]

[0086]

[0087]

[0088] 实施例6毒理实验

[0089] 实验小鼠20只，雌雄各半，适应性饲养三天后，随机分为两组(噬菌体组、对照组)，10
每组10只(雌雄各5只)，给予噬菌体组剂量为10 PFU/kg的大肠杆菌噬菌体EC35P1，对照组给予等量生理盐水，连续给药15d，将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。

[0090] 实验结果显示，此剂量的大肠杆菌噬菌体EC35P1对小鼠日常行为没有影响。解剖检查内脏未见异常。具有生物安全性，可应用于饲料添加剂。

[0091] 实施例7大肠杆菌噬菌体EC35P1对大肠杆菌最佳感染复数(MOI)的测定[0092] 挑取大肠杆菌EC35单个菌落，接种到盛有3mL TSB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养8h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到10mL TSB培养液，37℃下160rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为1000、 100、10、1、0.1、0.01和0.0001的比例加入噬菌体EC35P1的纯培养液(由实施例1制得)和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。37℃下160rpm振荡培养8h。培养完毕后
10000g离心10min 并收集上清液，采用双层平板法测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表 3所示。

[0093] 结果表明，培养8h条件下，大肠杆菌噬菌体EC35P1效价达到最高(1 ×1011PFU/mL)时，其MOI＝0.1。

[0094] 表3不同感染复数下大肠杆菌噬菌体EC35P1的效价

[0095]

[0096] 实施例8大肠杆菌噬菌体EC35P1的热稳定性试验

[0097] 取1mL噬菌体EC35P1纯培养液(由实施例7制得)装于无菌EP管中，分别于 50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用2h、12h、24h和48h。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。

[0098] 结果如表4所示，与对照相比大肠杆菌噬菌体EC35P1在50℃下水浴24h，效价仅降8
低一个数量级，在60℃下水浴48h依然有10PFU/mL的噬菌体存活，同时在70℃水浴2h仍具有80％存活率，由此说明大肠杆菌噬菌体EC35P1具有良好的耐高温特性。

[0099] 表4大肠杆菌噬菌体EC35P1于不同温度下的效价

[0100]

[0101]

[0102] 实施例9大肠杆菌噬菌体EC35P1的pH稳定性试验

[0103] 取无菌EP管分别加入不同pH(1‑14)的TSB培养基900μL后将上述EP管置于 25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μL大肠杆菌噬菌体EC35P1纯培养液(由实施例7制得)，10
使其初始效价为1x10  PFU/mL，室温下静置1h。待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。之后分别于 4h、8h、24h及96h后重复上述过程，重复实验3次。

[0104] 结果如表5所示，大肠杆菌噬菌体EC35P1在pH4～pH11之间，效价无显著变化，表明其在中性，微酸和碱性条件下有较好的稳定性。

[0105] 在pH＝1的酸性条件下和pH＝13的碱性条件下，噬菌体EC35P1的效价于处理4小时后下降为0，说明噬菌体EC35P1能够耐受的pH为1～13。

[0106] 表5大肠杆菌噬菌体EC35P1的pH稳定性(起始效价1x1010 PFU/mL)

[0107]

[0108]

[0109] 实施例10大肠杆菌噬菌体EC35P1的存活稳定性试验

[0110] 取5mL大肠杆菌噬菌体EC35P1纯培养液(由实施例1制得)分装于无菌试管中，分别于4℃、25℃、30℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。

[0111] 结果如表6所示，4℃条件下大肠杆菌噬菌体EC35P1存放50周效价仅仅降低一半左9
右，仍具6x10 PFU/mL；25℃下大肠杆菌噬菌体EC35P1存放12周内效价数量级未降低超过一个数量级，到41周仍能检测出效价；30℃下大肠杆菌噬菌体EC35P1可在8周内效价维持在同一数量级上，到32周仍能检测出效价；各保存温度下噬菌体EC35P1均对宿主菌具有较强裂解能力。大肠杆菌噬菌体EC35P1适宜4℃下存放。

[0112] 表6大肠杆菌噬菌体EC35P1于不同保存温度下的存活稳定性

[0113]

[0114]

[0115]

[0116] 实施例11大肠杆菌噬菌体EC35P1对大肠杆菌及沙门氏菌裂解范围试验[0117] 分别取效价为1x108PFU/mL大肠杆菌噬菌体EC35P1(由实施例1制得)、沙门氏菌噬菌体SG8P3、大肠杆菌噬菌体CL9的原液，采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。

[0118] 分别挑取100株动物源大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，37℃下160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，取5μL噬菌体EC35P1原液点滴于平板上。待自然风干后37℃培养6～8h，观察结果。

[0119] 分别挑取100株动物源沙门氏菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，37℃下160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL噬菌体EC35P1、沙门氏菌噬菌体SG8P3、大肠杆菌噬菌体CL9的原液滴于平板的不同位置上。加样时噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6～8h，观察结果。

[0120] 结果如表7所示，大肠杆菌噬菌体EC35P1对大肠杆菌菌株的裂解率为 88％。大肠杆菌噬菌体EC35P1对沙门氏菌的裂解率为60％；作为对比，大肠杆菌噬菌体CL9对沙门氏菌的裂解率为2％，沙门氏菌噬菌体SG8P3对沙门氏菌的裂解率为86％。

[0121] 该实施例说明大肠杆菌噬菌体EC35P1不但对大肠杆菌具有较高的裂解率，同时对沙门氏菌也有较好的裂解效果，且其对沙门氏菌的裂解能力与沙门氏菌噬菌体SG8P3相差不远，相比大肠杆菌噬菌体CL9对沙门氏菌的裂解能力更好。

[0122] 表7大肠杆菌噬菌体EC35P1对大肠杆菌及沙门氏菌的裂解谱测定结果

[0123]

[0124]

[0125]

[0126] 注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“‑”[0127] 实施例12大肠杆菌噬菌体EC35P1对阴沟肠杆菌及志贺氏菌裂解范围试验分别取8
效价为1x10 PFU/mL大肠杆菌噬菌体EC35P1(由实施例1制得)、大肠杆菌噬菌体CL9的原液，采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。

[0128] 分别挑取100株动物源阴沟肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB 的试管中，30℃下160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL大肠杆菌噬菌体EC35P1、大肠杆菌噬菌体CL9的原液滴于平板的不同位置上。加样时噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后30℃培养
6‑8h，观察结果。

[0129] 分别挑取100株动物源志贺氏菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL大肠杆菌噬菌体EC35P1、大肠杆菌噬菌体CL9的原液滴于平板的不同位置上。加样时噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6‑8h，观察结果。

[0130] 结果如表8所示，大肠杆菌噬菌体EC35P1对阴沟肠杆菌与志贺氏菌的裂解率分别为56％与70％；大肠杆菌噬菌体CL9对阴沟肠杆菌与志贺氏菌的裂解率分别为6％与30％。说明大肠杆菌噬菌体EC35P1对阴沟肠杆菌与志贺氏菌均具有较好的裂解效果。

[0131] 表8大肠杆菌噬菌体EC35P1对阴沟肠杆菌及志贺氏菌的裂解谱测定结果[0132]

[0133]

[0134]

[0135] 注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“‑”[0136] 实施例13大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)对小鸡鸡白痢的田间实验应用

[0137] 取360只小鸡，随机分为4组(大肠杆菌攻毒组、沙门氏菌攻毒组、阴沟肠杆菌攻毒组、志贺氏菌攻毒组)，每组90只。分别在4组小鸡的养殖饮用水槽中加入终浓度为5 5 5
1x10cfu/mL大肠杆菌、终浓度为6x10cfu/mL沙门氏菌、终浓度为 7x10cfu/mL阴沟肠杆
5
菌、终浓度为9x10 cfu/mL志贺氏菌对小鸡进行攻毒试验。随机选取每组90只小鸡中的30
5
只，向其饮用水中加入终浓度为5x10 PFU/mL 大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)制剂(参照实施例7 的方法制得)。观察2周，每日观察小鸡的发病率和
5
死亡率(参见表9)。并且每组同时设置了阳性对照组(4组分别为终浓度为1x10cfu/mL大肠
5 5
杆菌、终浓度为6x10 cfu/mL沙门氏菌、终浓度为7x10 cfu/mL阴沟肠杆菌、终浓度为9x10 
5
cfu/mL志贺氏菌)和阴性对照组(4 组均为无攻毒处理，给予等量生理盐水)。死亡率＝(小鸡死亡数/小鸡总数)×100％。

[0138] 结果如表9所示，4个攻毒组中，大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)处理组的小鸡死亡率均低，说明大肠杆菌噬菌体EC35P1 (Escherichia coliphage EC35P1)对四种细菌攻毒的小鸡均具有治疗效果。

[0139] 表9肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coliphage EC35P1)对小鸡死亡率的影响[0140]

[0141] 实施例14大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)的组合物在液体中杀菌效果实验

[0142] 将效价为5x109PFU/mL大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1) 原液、终浓度为0.05％的双癸基二甲基氯化铵、终浓度为0.01％新洁尔灭等体积均匀混合制成1∶1∶1的组合物1。

[0143] 将效价为5x109PFU/mL大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage9
EC35P1)原液、将效价为5x10 pFU/mL金黄色葡萄球菌噬菌体JIP2  (Staphylococcus aureusphage JIP2)原液等体积均匀混合制成1∶1的组合物2。

[0144] 培养大肠杆菌至对数生长期，分装进4个试管中，用TSB液体培养基稀释菌液至使3
大肠杆菌的终浓度为1x10cfu/mL，其中2个试管分别接种组合物1 和组合物2。设置对照组
3
和空白组(CK)，对照组给予终浓度1x10 cfu/mL的大肠杆菌；空白组给予等量生理盐水。4h后检测大肠杆菌的残留量，检测方法见实施例6。结果参见表10。

[0145] 表10大肠杆菌噬菌体EC35P1的组合物在液体中杀菌效果

[0146]

[0147] 表10测试结果显示：带有大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)的组合物1和组合物2不仅杀菌效果好，而且对其它组合成分无拮抗作用。大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)的组合物1和组合物2具有应用为生物杀菌剂的潜力。

[0148] 实施例15大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物对牛肉样品保存过程中大肠杆菌污染的防治

[0149] 1.组合物1～组合物2的配制方法：同实施例14所描述的方法。

[0150] 2.将高压蒸汽灭菌的牛肉切成1cm见方的小方块75块，分为5组(单噬菌体EC35P1组、组合物1、组合物2、对照组和空白组)，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种3 8 3
1x10cfu/mL大肠杆菌和剂量为10PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种1x10cfu/mL大肠杆菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于37℃培养箱中培养。每2h取一块牛肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体的大肠杆菌含量，实验重复3次。结果参见表 11。

[0151] 表11大肠杆菌噬菌体EC35P1及其组合物对牛肉样品保存过程中大肠杆菌污染的防治结果

[0152]

[0153] 表11结果显示：8h后对照组的牛肉表面生长了大量的大肠杆菌；而各实验组由于大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2的添加，牛肉表面的大肠杆菌始终控制在极低的水平。大肠杆菌噬菌体 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭牛肉表面的大肠杆菌并防治牛肉在保存过程中大肠杆菌的污染。当然，大肠杆菌噬菌体EC35P1也可以应用成保健品去运用或药剂去应用。

[0154] 实施例17大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物对牛肉样品保存过程中阴沟肠杆菌污染的防治

[0155] 1.组合物1～组合物2的配制方法：同实施例14所描述的方法。

[0156] 2.将高压蒸汽灭菌的牛肉切成1cm见方的小方块75块，分为5组(单噬菌体EC35P1组、组合物1、组合物2、对照组和空白组)，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种3 8 3
2x10cfu/mL阴沟肠杆菌和剂量为10PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种2x10cfu/mL阴沟肠杆菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于37℃培养箱中培养。
每2h取一块牛肉置于10mL 无菌水中，充分震荡，测定该液体的阴沟肠杆菌含量，实验重复3次。结果参见表12。

[0157] 表12大肠杆菌噬菌体EC35P1及其组合物对牛肉样品保存过程中阴沟肠杆菌污染的防治结果

[0158]

[0159] 表12结果显示：8h后对照组的牛肉表面生长了大量的阴沟肠杆菌；而各实验组由于大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2的添加，牛肉表面的阴沟肠杆菌始终控制在极低的水平。大肠杆菌噬菌体 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭牛肉表面的阴沟肠杆菌并防治牛肉在保存过程中阴沟肠杆菌的污染。当然，大肠杆菌噬菌体EC35P1也可以应用成保健品去运用或药剂去应用。

[0160] 实施例18大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物对牛肉样品保存过程中沙门氏菌污染的防治

[0161] 1.组合物1～组合物2的配制方法：同实施例14所描述的方法。

[0162] 2.将高压蒸汽灭菌的牛肉切成1cm见方的小方块75块，分为5组(单噬菌体EC35P1组、组合物1、组合物2、对照组和空白组)，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种3 8 3
3x10cfu/mL沙门氏菌和剂量为10PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种3x10cfu/mL沙门氏菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于37℃培养箱中培养。每2h取一块牛肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体的沙门氏菌含量，实验重复3次。结果参见表 13。

[0163] 表13大肠杆菌噬菌体EC35P1及其组合物对牛肉样品保存过程中沙门氏菌污染的防治结果

[0164]

[0165]

[0166] 表13结果显示：8h后对照组的牛肉表面生长了大量的沙门氏菌；而各实验组由于大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2的添加，牛肉表面的沙门氏菌始终控制在极低的水平。大肠杆菌噬菌体 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭牛肉表面的沙门氏菌并防治牛肉在保存过程中沙门氏菌的污染。当然，大肠杆菌噬菌体EC35P1也可以应用成保健品去运用或药剂去应用。

[0167] 实施例19大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物对牛肉样品保存过程中志贺氏菌污染的防治

[0168] 1.组合物1～组合物2的配制方法：同实施例14所描述的方法。

[0169] 2.将高压蒸汽灭菌的牛肉切成1cm见方的小方块75块，分为5组(单噬菌体EC35P1组、组合物1、组合物2、对照组和空白组)，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种3 8 3
4x10cfu/mL志贺氏菌和剂量为10PFU/kg的供试噬菌体；对照组每块接种4x10cfu/mL志贺氏菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于37℃培养箱中培养。每2h取一块牛肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体的志贺氏菌含量，实验重复3次。结果参见表 14。

[0170] 表14大肠杆菌噬菌体EC35P1及其组合物对牛肉样品保存过程中志贺氏菌污染的防治结果

[0171]

[0172] 表14结果显示：8h后对照组的牛肉表面生长了大量的志贺氏菌；而各实验组由于大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2的添加，牛肉表面的志贺氏菌始终控制在极低的水平。大肠杆菌噬菌体 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭牛肉表面的志贺氏菌并防治牛肉在保存过程中沙门氏菌的污染。当然，大肠杆菌噬菌体EC35P1也可以应用成保健品去运用或药剂去应用。

[0173] 实施例20大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物对牛肉样品保存过程中金黄色葡萄球菌污染的防治

[0174] 1.组合物1～组合物2的配制方法：同实施例14所描述的方法。

[0175] 2.将高压蒸汽灭菌的牛肉切成1cm见方的小方块75块，分为5组(单噬菌体EC35P1组、组合物1、组合物2、对照组和空白组)，每组15块，置于无菌平皿中。实验组每块接种3 8
5x10 cfu/mL金黄色葡萄球菌和剂量为10 PFU/kg 的供试噬菌体；对照组每块接种
3
5x10cfu/mL金黄色葡萄球菌和等量无菌水；空白组给与等量无菌生理盐水。将各处理置于
37℃培养箱中培养。每2h取一块牛肉置于10mL无菌水中，充分震荡，测定该液体的金黄色葡萄球菌含量，实验重复3次。结果参见表15。

[0176] 表15大肠杆菌噬菌体EC35P1及其组合物对牛肉样品保存过程中金黄色葡萄球菌污染的防治结果

[0177]

[0178] 表15结果显示：8h后对照组的牛肉表面生长了大量的金黄色葡萄球菌；而各实验组由于大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2的添加，牛肉表面的金黄色葡萄球菌始终控制在极低的水平。大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物1、组合物2可以用作为生物杀菌剂，有效杀灭牛肉表面的金黄色葡萄球菌并防治牛肉在保存过程中金黄色葡萄球菌的污染。当然，大肠杆菌噬菌体EC35P1也可以应用成保健品去运用或药剂去应用。

[0179] 实施例21大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)及其组合物的试剂盒的制备及使用

[0180] 试剂盒中含有5～10mL的效价为5x109PFU/mL的大肠杆菌噬菌体EC35P1 (Escherichia coli phage EC35P1)或大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)的组合物，1L TSB半固体琼脂培养基，1LTSA固体培养基。

[0181] 试剂盒的使用方法为：取效价为1×107PFU/mL大肠杆菌噬菌体EC35P1 (Escherichia coli phageEC35P1)噬菌体液体或大肠杆菌噬菌体EC35P1 (Escherichia coli phage EC35P1)的组合物(此处的组合物可参照实施例14的组合物1或组合物2进行配制)的液体，采用双层平板点滴法来测定供试噬菌体的裂解谱。挑取待检测单菌落，将其接种于目标液体培养基中，于目标温度下结合待检测菌株生长特性进行振荡培养，制得待检测菌株菌液。取300μL待检测菌株菌悬液分别与1mL TSB半固体琼脂培养混合铺于平板上，取10μL大肠杆菌噬菌体EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)液体或大肠杆菌噬菌体 EC35P1(Escherichia coli phage EC35P1)的组合物点滴于平板上。待自然风干后根据待检测菌株生长特性于目标温度下进行培养，观察结果即可。

[0182] 本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到申请法的保护。