一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32及其应用转让专利
申请号 : CN202110107729.9
文献号 : CN112694981B
文献日 : 2022-05-06
发明人 : 刘冰 , 葛谦 , 魏晓琴 , 李英武 , 李振永 , 孙翔宇 , 马婷婷 , 苏龙 , 张艳 , 苟春林 , 张静 , 李彩虹 , 闫玥
申请人 : 宁夏农产品质量标准与检测技术研究所(宁夏农产品质量监测中心) , 宁夏回族自治区国有林场和林木种苗工作总站
摘要 :
本发明“一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32及其应用”属于微生物技术领域。所述一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32的保藏号为CCTCC M 2021090。该菌株发酵葡萄汁生成的正己醇产量高达681.26μg/L，苯甲醛的产量高达205.95μg/L。
权利要求 :
1.一株泽普林假丝酵母(Candida zemplinina)菌株YC32，其保藏号为CCTCC M
2021090。
2.保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母(Candida zemplinina)菌株YC32在生产香气物质方面的应用；所述香气物质选自由异戊醇、2‑庚醇、正辛醇、正庚醇、1‑辛烯‑3‑醇、癸醛、芳樟醇、3‑辛酮、大马士酮、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的组。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述香气物质选自由法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的组。
4.保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母(Candida zemplinina)菌株YC32在酿酒方面的应用。
5.一种酿酒发酵剂，其特征在于，其发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母(Candida zemplinina)菌株YC32。
6.根据权利要求5所述的一种酿酒发酵剂，其特征在于，所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。
7.根据权利要求5或6所述的一种酿酒发酵剂，其特征在于，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的一种酿酒发酵剂，其特征在于，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质。
9.根据权利要求8所述的一种酿酒发酵剂，其特征在于，所述菌的培养基物质包括：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。
10.一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，采用保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母(Candida zemplinina)菌株YC32进行发酵酿造。
11.根据权利要求10所述的一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，所述发酵指采用所述泽普林假丝酵母(Candida zemplinina)菌株YC32以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵。
12.根据权利要求11所述的一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，所述泽普林假丝酵母
6 7
(Candida zemplinina)菌株YC32在底物中的添加浓度为10‑10CFU/ml。
13.根据权利要求12所述的一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，所述泽普林假丝酵母6
(Candida zemplinina)菌株YC32在底物中的添加浓度为10CFU/ml。
说明书 :
一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina 菌株YC32及其应用。
背景技术
[0002] 目前已报道的泽普林假丝酵母菌（Candida zemplinina）较少，其中“Candida zemplinina for Production of Wines with Less Alcohol and More Glycerol”一文披
露了一株名为Cz3的泽普林假丝酵母菌（Candida zemplinina）菌株，用它发酵获得的酒，相
比商业菌株发酵获得的酒，酒精含量更少而甘油含量更多。
露了一株名为Cz3的泽普林假丝酵母菌（Candida zemplinina）菌株，用它发酵获得的酒，相
比商业菌株发酵获得的酒，酒精含量更少而甘油含量更多。
[0003] 本领域目前更是从未报道过可产法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛等香气物质的泽普林假丝酵母( Candida zemplinina )。
发明内容
[0004] 基于本领域的上述空白，本发明筛选得到一株以葡萄汁为底物发酵高产法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛等香气物质的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株
YC32。
YC32。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32，其保藏号为CCTCC M 2021090。
[0007] 保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32在生产香气物质方面的应用。
[0008] 所述香气物质选自由异戊醇、2‑庚醇、正辛醇、正庚醇、1‑辛烯‑3‑醇、癸醛、芳樟醇、3‑辛酮、大马士酮、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、法呢醇、正己
醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的组。
醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的组。
[0009] 所述香气物质选自由法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的组。
[0010] 保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32在酿酒方面的应用。
[0011] 一种酿酒发酵剂，其特征在于，其发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32。
[0012] 所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。
[0013] 所述酿酒发酵剂为菌剂；
[0014] 优选地，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料；
[0015] 优选地，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养基物质包括但不限于：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。
[0016] 一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，采用保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32进行发酵酿造。
[0017] 所述发酵指采用所述泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵。
[0018] 优选地，所述泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32在底物中的添加浓度6 7 6
为10‑10CFU/ml，优选10CFU/ml。
为10‑10CFU/ml，优选10CFU/ml。
[0019] 本发明筛选得到一株菌株，经香气物质成分鉴定实验测得其可高产法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛等一系列香气物质，并且对比商业的酿酒酵母菌株F33，本发明的
菌株还可产生F33无法生成或产量较低的香气物质，例如：法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正
己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇，其中正己醇产量高达681.26μg/L，苯甲醛的
产量高达205.95μg/L。经鉴定，该菌株为一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株，申
请人将其命名为YC32，并将该菌株送保藏。
菌株还可产生F33无法生成或产量较低的香气物质，例如：法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正
己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇，其中正己醇产量高达681.26μg/L，苯甲醛的
产量高达205.95μg/L。经鉴定，该菌株为一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株，申
请人将其命名为YC32，并将该菌株送保藏。
[0020] 本发明的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32的保藏信息如下：
[0021] 命名：YC32
[0022] 分类名称：泽普林假丝酵母
[0023] 拉丁名称：Candida zemplinina
[0024] 保藏号：CCTCC M 2021090
[0025] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0026] 保藏日期：2021年1月15日。
具体实施方式
[0027] 下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体说明，但并不以此限制本发明的保护范围。
[0028] 生物材料的来源及记载出处
[0029] 实验例1中使用的葡萄品种的来源和产地如下表1所示：
[0030] 表1
[0031] 葡萄品种 产地 来源赤霞珠 宁夏贺兰山东麓产区 采集
美乐 宁夏贺兰山东麓产区 采集
西拉 宁夏贺兰山东麓产区 采集
蛇龙珠 宁夏贺兰山东麓产区 采集
小味儿多 宁夏贺兰山东麓产区 采集
贵人香 宁夏贺兰山东麓产区 采集
威代尔 宁夏贺兰山东麓产区 采集
雷司令 宁夏贺兰山东麓产区 采集
霞多丽 宁夏贺兰山东麓产区 采集
美乐 宁夏贺兰山东麓产区 采集
西拉 宁夏贺兰山东麓产区 采集
蛇龙珠 宁夏贺兰山东麓产区 采集
小味儿多 宁夏贺兰山东麓产区 采集
贵人香 宁夏贺兰山东麓产区 采集
威代尔 宁夏贺兰山东麓产区 采集
雷司令 宁夏贺兰山东麓产区 采集
霞多丽 宁夏贺兰山东麓产区 采集
[0032] 上表1中的葡萄品种均为公知公用的葡萄品种，也可商购获得。
[0033] 实验例2中使用的葡萄品种为威代尔冰葡萄，购自宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司；
[0034] 商业菌株‑酿酒酵母F33购自法国拉氟德（Laffort）公司。
[0035] 实施例1、本发明的菌株YC32
[0036] 本组实施例提供一株泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32，其保藏号为CCTCC M 2021090。
[0037] 实施例2、本发明菌株YC32的应用
[0038] 本组实施例提供保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32在生产香气物质方面的应用。
[0039] 在一些实施例中，所述香气物质选自由异戊醇、2‑庚醇、正辛醇、正庚醇、1‑辛烯‑3‑醇、癸醛、芳樟醇、3‑辛酮、大马士酮、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙
酯、法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的
组。
酯、法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的
组。
[0040] 在另一些实施例中，所述香气物质选自由法呢醇、正己醇、庚醛、丁烯醛、正己醛、异丁醛、苯甲醛、异戊醛、正癸酸、香叶醇组成的组，这些香气物质中的任意一种在产量上
YC32菌株都比已知酿酒酵母F33的要高很多，具体对比数值可参考下面的表1。
YC32菌株都比已知酿酒酵母F33的要高很多，具体对比数值可参考下面的表1。
[0041] 实施例3、本发明菌株YC32的酿酒应用
[0042] 本组实施例提供保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32在酿酒方面的应用。
[0043] 实施例4、本发明的酿酒发酵剂
[0044] 本组实施例提供一种酿酒发酵剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述酿酒发酵剂的发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida
zemplinina菌株YC32。
zemplinina菌株YC32。
[0045] 在进一步的实施例中，所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。本领域技术人员可根据本发明的教导，将本发明的YC32菌株与本领域现有常见的酿酒酵母联用，用于来发酵酿
酒。
酒。
[0046] 在具体的实施例中，所述酿酒发酵剂为菌剂；
[0047] 在优选的实施例中，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料；
[0048] 在另一些优选的实施例中，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养基物质包括但不限于：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。
[0049] 实施例5、本发明的葡萄酒酿造方法
[0050] 本组实施例提供一种葡萄酒酿造方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用保藏号为CCTCC M 2021090的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32进行发酵
酿造。
酿造。
[0051] 在具体的实施例中，所述发酵指采用所述泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵。
[0052] 在优选的实施例中，所述泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32在底物中6 7 6
的添加浓度为10‑10CFU/ml，优选10CFU/ml。
的添加浓度为10‑10CFU/ml，优选10CFU/ml。
[0053] 实验例1、本发明泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32的筛选过程
[0054] 采集宁夏贺兰山东麓不同产地、不同品种酿酒葡萄（如表1所示），剔除腐烂、发霉、破损的果粒及杂物，称取均匀完整葡萄果粒10.0 g，加入90 mL无菌的YPD液体培养基中，振
荡10 min，制成菌悬液，采用梯度稀释的方法，将适宜稀释度菌悬液涂布在添加100 mg/L氯
霉素的YPD固体培养基上，28 ℃培养2d 3 d，依据菌落形态，在YPD固体培养基上多次划线
~
纯化，获得纯化菌株。纯化后的菌株于YPD培养基活化24 h后，取1 mL菌液按照接Biospin真
菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取泽普林假丝酵母基因组，以引物NL‑1（5'‑
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG‑3'）和NL‑4（5'‑ GGTCCGTGTTTCAAGACGG ‑3'）进行PCR扩增，测
序获得26S rDNA片段的基因序列，通过NCBI的BLAST比对，获得同源性较高的已知标准菌株
信息，并对相似度超过99%以上的菌株做种属鉴定，最终获得菌株种属信息。
荡10 min，制成菌悬液，采用梯度稀释的方法，将适宜稀释度菌悬液涂布在添加100 mg/L氯
霉素的YPD固体培养基上，28 ℃培养2d 3 d，依据菌落形态，在YPD固体培养基上多次划线
~
纯化，获得纯化菌株。纯化后的菌株于YPD培养基活化24 h后，取1 mL菌液按照接Biospin真
菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取泽普林假丝酵母基因组，以引物NL‑1（5'‑
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG‑3'）和NL‑4（5'‑ GGTCCGTGTTTCAAGACGG ‑3'）进行PCR扩增，测
序获得26S rDNA片段的基因序列，通过NCBI的BLAST比对，获得同源性较高的已知标准菌株
信息，并对相似度超过99%以上的菌株做种属鉴定，最终获得菌株种属信息。
[0055] 本实验例中一共获得33株Candida zemplinina菌株。分别将33株Candida 6
zemplinina菌株按初始浓度10 CFU/mL接入已灭菌的威代尔葡萄汁中（100℃，10 min），18
℃±2℃发酵18天，测定其香气含量，最终获得一株产香效果最好的Candida zemplinina菌
株YC32，并将该菌株送保藏，其保藏信息如下：
zemplinina菌株按初始浓度10 CFU/mL接入已灭菌的威代尔葡萄汁中（100℃，10 min），18
℃±2℃发酵18天，测定其香气含量，最终获得一株产香效果最好的Candida zemplinina菌
株YC32，并将该菌株送保藏，其保藏信息如下：
[0056] 命名：YC32
[0057] 分类名称：泽普林假丝酵母
[0058] 拉丁名称：Candida zemplinina
[0059] 保藏号：CCTCC M 2021090
[0060] 保藏机构：中国典型培养物保藏中心
[0061] 保藏日期：2021年1月15日。
[0062] 实验例2、本发明泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32产香气物质的数据
[0063] 葡萄品种：威代尔冰葡萄
[0064] 葡萄汁生产过程：对采收后的冰葡萄通过气囊压榨机进行带冰压榨操作，同时添加二氧化硫（50mg /L K2S2O5）和20 mg/L果胶酶(≥500 U/mg)，抑制细菌病提高出汁率。
[0065] 葡萄汁发酵条件：浸渍后的葡萄汁分别按初始浓度106 CFU/mL接入F33酿酒酵母和Candida zemplinina菌株YC32，发酵温度为18℃±2℃，待葡萄汁失重连续三天不再变化
终止发酵。所有葡萄酒样品在7500 rpm下离心8分钟，取上清液于4℃保存。
终止发酵。所有葡萄酒样品在7500 rpm下离心8分钟，取上清液于4℃保存。
[0066] 各香气物质的检测方法：采用顶空‑固相微萃取法‑气相质谱法（HS‑SPME‑GC/MS）。准确量取8 mL葡萄酒样品加入含有1.5 g NaCl顶空瓶中，同时394.08 μg/L 4‑甲基‑1‑戊
醇（内标物），加盖密封。插入CAR/DVB/PDMS萃取纤维，45℃下吸附30 min后将萃取纤维在GC
进样口250℃下解吸3 min，进行GC‑MS分析。色谱柱：InertCap WAX极性色谱柱（60 m×0.25
mm，0.25 μm）；升温程序为：40℃保持5 min，以3℃/ min升至120℃，再以8℃/ min升至230
℃，保持10 min；载气（He）流速0.8 mL/ min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70 eV；传
输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5 V；灯丝流量0.25 mA；质量扫描范围m/z
33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。
醇（内标物），加盖密封。插入CAR/DVB/PDMS萃取纤维，45℃下吸附30 min后将萃取纤维在GC
进样口250℃下解吸3 min，进行GC‑MS分析。色谱柱：InertCap WAX极性色谱柱（60 m×0.25
mm，0.25 μm）；升温程序为：40℃保持5 min，以3℃/ min升至120℃，再以8℃/ min升至230
℃，保持10 min；载气（He）流速0.8 mL/ min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70 eV；传
输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5 V；灯丝流量0.25 mA；质量扫描范围m/z
33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。
[0067] 以同一品种的葡萄生产的同一批葡萄汁为底物，在相同的发酵条件下，分别以商业菌株‑酿酒酵母F33和本发明的泽普林假丝酵母Candida zemplinina菌株YC32对等量的
葡萄汁进行发酵酿酒处理，再经通过顶空‑固相微萃取法‑气相质谱方法检测各香气物质的
含量（单位：μg/L，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量），得到下表2：
葡萄汁进行发酵酿酒处理，再经通过顶空‑固相微萃取法‑气相质谱方法检测各香气物质的
含量（单位：μg/L，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量），得到下表2：
[0068] 表2
[0069] 编号 香气物质名称 香气阈值 香味描述 F33 菌株YC321 异戊醇 1000 威士忌、指甲油、溶剂、麦芽、灼烧 11842.45 2663.36
2 法呢醇 1 花香 0 28.4
3 2‑庚醇 0.07 柠檬、橘子、铜 18.18 9.12
4 正己醇 6 草香、绿植、木香、松香、花香、脂肪、药草、果香 0 681.26
5 正辛醇 0.9 橘子、玫瑰、甜草、强烈的柑橘 252.86 55.93
6 正庚醇 3 柠檬、橘子、铜、绿植、甜香 199.48 66.37
7 1‑辛烯‑3‑醇 1 蘑菇 529.75 476.69
8 庚醛 0.18 干鱼 0 1.24
9 癸醛 0.1 绿植、肥皂 35.06 17.13
10 丁烯醛 0.3 花香 0 16.11
11 正己醛 4.5 甜香、橘子、腥味、草香 0 7.4
12 异丁醛 0.1 清香、乙醛、花香、绿植 0 9.35
13 苯甲醛 50 苦杏仁、坚果、烟味 0 205.95
14 异戊醛 0.1 绿植、麦芽、杏仁、坚果 0 10.41
15 正癸酸 15 酸味、脂肪、柑橘 0 49.76
16 香叶醇 3.6 玫瑰、天竺葵 0 41.68
17 芳樟醇 6 柑橘、花香、甜香、玫瑰、木香、绿植、蓝莓 313.19 123.05
18 3‑辛酮 21.4 药草 31.61 24.81
19 大马士酮 0.002 苹果、玫瑰、蜂蜜、番茄、甜香 1711.25 716.25
20 乙酸异戊酯 2 香蕉、果香、甜香 243.58 10.03
21 癸酸乙酯 1 果香、肥皂 7302.33 40.4
22 辛酸乙酯 2 甜香、花香、果香、香蕉、梨、白兰地、菠萝、糖果 8608.18 70.72
23 庚酸乙酯 2.2 菠萝、果香 230.8 14.53
24 己酸乙酯 1 甜香、果香、菠萝、蜡香、绿植、香蕉 1994.24 7.73
2 法呢醇 1 花香 0 28.4
3 2‑庚醇 0.07 柠檬、橘子、铜 18.18 9.12
4 正己醇 6 草香、绿植、木香、松香、花香、脂肪、药草、果香 0 681.26
5 正辛醇 0.9 橘子、玫瑰、甜草、强烈的柑橘 252.86 55.93
6 正庚醇 3 柠檬、橘子、铜、绿植、甜香 199.48 66.37
7 1‑辛烯‑3‑醇 1 蘑菇 529.75 476.69
8 庚醛 0.18 干鱼 0 1.24
9 癸醛 0.1 绿植、肥皂 35.06 17.13
10 丁烯醛 0.3 花香 0 16.11
11 正己醛 4.5 甜香、橘子、腥味、草香 0 7.4
12 异丁醛 0.1 清香、乙醛、花香、绿植 0 9.35
13 苯甲醛 50 苦杏仁、坚果、烟味 0 205.95
14 异戊醛 0.1 绿植、麦芽、杏仁、坚果 0 10.41
15 正癸酸 15 酸味、脂肪、柑橘 0 49.76
16 香叶醇 3.6 玫瑰、天竺葵 0 41.68
17 芳樟醇 6 柑橘、花香、甜香、玫瑰、木香、绿植、蓝莓 313.19 123.05
18 3‑辛酮 21.4 药草 31.61 24.81
19 大马士酮 0.002 苹果、玫瑰、蜂蜜、番茄、甜香 1711.25 716.25
20 乙酸异戊酯 2 香蕉、果香、甜香 243.58 10.03
21 癸酸乙酯 1 果香、肥皂 7302.33 40.4
22 辛酸乙酯 2 甜香、花香、果香、香蕉、梨、白兰地、菠萝、糖果 8608.18 70.72
23 庚酸乙酯 2.2 菠萝、果香 230.8 14.53
24 己酸乙酯 1 甜香、果香、菠萝、蜡香、绿植、香蕉 1994.24 7.73
[0070] 上表1中的香气阈值指人类可以嗅闻到该物质的最低浓度下限值。