一种苯胺高效降解菌及其应用

摘要

本发明提供了一种苯胺高效降解菌及其应用，所述菌株为白色芽孢杆菌(Bacillus albus)，相比较于其他苯胺降解菌，该菌能够耐受更高的苯胺浓度，并且能够实现高浓度下苯胺的完全降解。在苯胺初始浓度在5 g/L的条件下，对苯胺的去除率在48h之内能够达到100%，降解效果十分显著。本发明可有效解决了高浓度苯胺废水生化效果差的问题，为高苯胺废水的生化处理提供了一个新的有效途径。

权利要求

1.一种苯胺高效降解菌，其分类命名为白色芽孢杆菌(Bacillus albus)BA‑7，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.20936。

2.权利要求1所述苯胺高效降解菌在降解苯胺中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将白色芽孢杆菌(Bacillus albus)BA‑7进行菌株培养后，加入到含苯胺待处理废水中降解苯胺。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：白色芽孢杆菌(Bacillus albus)BA‑7进行菌株培养包括活化、转接、扩培步骤，活化：从固体平板中挑取苯胺高效降解菌的单菌落，转接至含苯胺的LB液体培养基中，摇床转速为150 rpm，37℃摇床培养3‑4 h直至对数期；

转接：将处在对数期的苯胺降解菌液按照5%的接入量转接至种子罐中进行培养，控制种子罐温度维持在30‑37℃、转速保持在220‑250 rpm，溶氧DO控制在4‑6 mg/L，培养24h‑

48h；

扩培：将种子罐培养的苯胺降解菌液按照2%‑5%的接种量转接至发酵罐中扩大培养，发酵罐培养基成分与种子罐的相同，各物化参数指标为：温度37℃、转速250rpm、溶氧8 mg/L、发酵时间48h‑60h。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的LB液体培养基组分为：1g/L苯胺、

5g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠，pH保持在7.2‑7.5之间。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：种子罐的培养基成分为：苯胺0.2％，葡萄糖0.6％，NH4Cl 0.2%，KH2PO4 0.1％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.02％，CaCO3 0.3％，酵母膏

0.01％，pH维持在7.2‑7.5之间。

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7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：菌株经过培养后菌液有效活菌数可达10个/ml以上，发酵培养液出罐后包装即可得到苯胺高效降解菌菌剂。

说明书

一种苯胺高效降解菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及到环境微生物领域，特别是一种苯胺高效降解菌及其应用，以微生物的方式处理污水中的污染物，符合现代污水处理工艺。

背景技术

[0002] 苯胺是农药、染料、塑料以及医药行业重要的化工原料和中间体之一，由苯胺生产加工的化工产品和中间体多达上百种。在染料工业中可用于制造酸性墨水蓝G、酸性媒介BS、酸性嫩黄、直接橙S、直接桃红、靛蓝、分散黄棕等；在有机颜料方面有用于制造金光红、大红粉、酚菁红、油溶黑等。在印染工业中用于染料苯胺黑；在农药工业中用于生产许多杀虫剂、杀菌剂如DDV、除草醚、毒草胺等；苯胺是橡胶助剂的重要原料，用于制造防老剂甲、防老剂丁、防老剂RD及防老剂4010、促进剂M、808、D及CA等；也可作为医药磺胺药的原料，苯胺是生产农药的重要原料，由苯胺可衍生N‑烷基苯胺、烷基苯胺、邻硝基苯胺、环己胺等，可作为杀菌剂敌锈钠、拌种灵、杀虫剂三唑磷、哒嗪硫磷、喹硫磷，除草剂甲草胺、环嗪酮、咪唑喹啉酸等的中间体。

[0003] 苯胺广泛存在于农药、染料等生产废水中，由于苯胺对普通微生物具有一定的毒害性，导致目前含苯胺废水的生化处理效果不理想，因此实际多采用一些物理化学方法对苯胺废水进行处理，成本较高，且易造成二次污染。因此筛选到能够高效降解苯胺的菌株对解决苯胺废水难处理的问题就显得极其重要。

[0004] 目前文献上已报到过多种细菌对苯胺具有降解效果，其中包括芽孢杆菌、假单胞菌、不动杆菌、微球菌等不同类型的微生物。由于苯胺对一般微生物具有毒害性，因此绝大多数报道过的苯胺降解菌降解效果都不太理想，所耐受的苯胺浓度太低。如假单胞菌ZD‑13和芽孢杆菌SA‑9，虽然能够实现500 mg/L以内苯胺的100%降解，但随着苯胺浓度的提高，降解率显著下降。2000 mg/L的苯胺在48h的降解率仅为40%（章健，2007）。因此本发明所要解决的技术问题就是要找到一株既能够耐受高浓度苯胺而且还能快速实现其降解的微生物。除此之外，本发明提供一种快速培养苯胺高效降解菌的发酵工艺。

发明内容

[0005] 针对苯胺废水难处理问题，本发明筛选分离出了一株苯胺高效降解菌，能够有效快速降解污水中的苯胺，同时提供了一种苯胺高效降解菌的发酵培养工艺，实现了菌种在短时间内快速富集扩培。

[0006] 本发明提供了一种苯胺高效降解菌 BA‑7，分类命名为白色芽孢杆菌(Bacillus albus)，已于2020年10月22日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20936。

[0007] 生理学特征为：菌体形态呈杆状，产芽孢，液化明胶，异养好氧型细菌，革兰氏染色阳性。在琼脂固体平板培养24 h出现明显菌落，菌落呈圆形或椭圆形，边缘整齐，白色，大而扁平，不透明，湿润无光泽。

[0008] 本发明所提供的这种苯胺降解菌BA‑7，能够以苯胺作为唯一碳源进行生长。在实验室摇床培养的条件下BA‑7可实现48h之内初始浓度5g/L苯胺的100%完全。同时我们又验证了苯胺高效降解菌BA‑7在含苯胺废水的实际处理效果。将BA‑7发酵而来的菌剂按10%的体积比加入到含2g/L的苯胺废水中，曝气处理24h后，苯胺的降解率可达到98%，处理效果十分理想。

[0009] 本发明提供了一种苯胺高效降解菌简便快速培养发酵的工艺，其发酵扩培工艺包括活化—转接—扩培等步骤，具体工艺流程如下：

[0010] （1）活化：从固体平板中挑取苯胺高效降解菌的单菌落，转接至含苯胺的LB液体培养基中，摇床转速为150 rpm，37℃摇床培养3‑4 h直至对数期。所述的LB培养基组分为：1g/L苯胺、5g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠，pH保持在7.2‑7.5之间。

[0011] （2）转接：将流程1活化处于对数期的苯胺降解菌液按照5%的接入量转接至50L种子罐中进行培养，控制种子罐温度维持在30‑37℃、转速保持在220‑250 rpm，溶氧DO控制在4‑6 mg/L，培养24h‑48h。种子罐的培养基成分为（质量比）：苯胺0  .2％，葡萄糖0  .6％，NH4Cl 0.2%，KH2PO4 0  .1％，MgSO4 0  .05％，NaCl 0  .02％，CaCO3 0  .3％，酵母膏0 .01％，余量为水。pH维持在7.2‑7.5之间。

[0012] （3）扩培：将流程2种子罐培养的苯胺降解菌液按照2%‑5%的接种量转接至1000L发酵罐中扩大培养，发酵罐培养基成分与种子罐的相同，各物化参数指标为：温度37℃、转速9
250rpm、溶氧8 mg/L、发酵时间48h‑60h。发酵结束后，罐体菌液有效活菌数可达10个/ml以上，发酵培养液出罐后用塑料桶包装后便可得到苯胺高效降解菌菌剂。

[0013] 所述苯胺高效降解菌在降解苯胺中的应用。

[0014] 将白色芽孢杆菌(Bacillus albus)BA‑7进行菌株培养后，加入到含苯胺待处理废水中降解苯胺。该菌株能够耐受高浓度的苯胺废水，降解率高。

[0015] 本发明所提供的一种苯胺高效降解菌能够实现对苯胺的快速高效降解，对含苯胺废水生化处理难的问题提供了一个有效的解决途径。对保护生态环境，保护人类健康具有重要的现实意义。同时公开了一种苯胺高效降解菌的发酵培养工艺，该工艺简单便捷、易于操作，极大程度上降低了中间环节的染菌风险，而且生产成本低、发酵周期时间短、扩培迅速，在生物发酵领域有着广泛的应用前景。

附图说明

[0016] 图1为本发明中苯胺降解菌BA‑7菌体在x1000倍油镜下的结晶紫染色照片；

[0017] 图2为菌株BA‑7在实验室摇瓶条件下，5g/L的苯胺初始量随时间变化的曲线以及在该条件下菌株BA‑7随时间变化的生长曲线。

[0018] 图3为菌株BA‑7发酵液在处理实际含苯胺废水的实验中，苯胺浓度和降解率随时间变化的曲线。

具体实施方式

[0019] 以下实施例适用于本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0020] 实施例1 菌种的分离与纯化

[0021] 菌株BA‑7分离纯化步骤如下：

[0022] （1）驯化富集

[0023] 取50ml活性污泥加入到含有以苯胺为唯一碳源的基础培养液的1L驯化装置中，活性污泥来自于江苏一长期处理苯胺废水的污水处理厂生化池。基础培养液配方为：苯胺0.5 g/L、NH4Cl 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgCl2 0.02g/L、CaCl2 0.03g/L。通入空气驯化培养15‑20天左右，期间定期监测苯胺浓度及污泥生长情况。检测到苯胺降解完全后，及时补加，并逐渐提高苯胺浓度至5 g/L，即得到苯胺降解菌富集液。

[0024] （2）分离

[0025] 在无菌条件下，取驯化富集菌液按2%的接种量转接至以苯胺为唯一碳源的无菌新鲜基础培养液中，基础培养液配方与步骤1相同。37℃摇床培养至对数期，利用稀释涂布平板法将培养菌液稀释涂布于苯胺为唯一碳源的固体分离培养基中，固体分离培养基成分为苯胺 1 g/L、NH4Cl 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、MgCl2 0.02g/L、CaCl2 0.03g/L、琼脂2%。放置于37℃恒温培养箱中培养2‑3天。

[0026] （3）纯化

[0027] 在超净工作台中，用接种针挑取苯胺分离固体培养基中长出的单菌落，利用平板划线法对苯胺降解菌进一步划线纯化培养，直至长出单菌落。重复3次以上操作，直至平板上长出的菌落形态单一为止，即得到了纯化的苯胺高效降解菌一株。

[0028] 实施例2 菌株的鉴定

[0029] 将纯化的苯胺降解菌进行16s  rDNA测序，测序比对结果为白色芽孢杆菌(Bacillus albus)，命名为BA‑7。其主要生理学特征为革兰氏染色为阳性，好氧生长，能够以苯胺作为唯一碳源、能源进行生长。取少许菌样进行结晶紫染色，在x1000倍油镜下观察到菌体形态成杆状，有芽孢，菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行，镜检照片如附图1所示。

[0030] 实施例3菌株BA‑7的生长曲线和对苯胺的降解实验

[0031] 挑取本发明中已纯化的苯胺降解菌BA‑7单菌落于含有5g/L苯胺的无机盐培养基摇瓶中，无机盐培养基配方包含：NH4Cl 0.5g/L、KH2PO4 1g/L、Na2HPO4 1g/L、MgCl2 0.02g/L、CaCl2 0.03g/L。摇床转速为180 rpm，温度为37℃，摇床培养。分别在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、60h、72h取样测定菌体浓度OD600以及苯胺浓度。OD600采用可见光分光光度计测定、苯胺浓度利用液相色谱进行测定。数据如附图2所示，在苯胺初始浓度5g/L下，菌株BA‑7在12h之内生长缓慢，导致苯胺降解也比较缓慢，随着菌体浓度的提高，苯胺降解速度得到了明显提高，在24h后苯胺去除率便达到了50%。培养48h时，苯胺已达到完全降解的效果，随着苯胺的降解完全，菌体生长失去碳源因此趋于稳定，OD600值稳定在1.2左右。
以上数据表明，本发明涉及的菌株BA‑7对苯胺降解菌具有良好的降解效果，同时菌体培养也十分方便快捷。

[0032] 实施例4菌株BA‑7的发酵培养工艺

[0033] 从固体平板中挑取苯胺高效降解菌的单菌落，转接至含苯胺的LB液体培养基中，摇床转速为150 rpm，37℃摇床培养3‑4 h直至对数期。所述的LB培养基组分为：1g/L苯胺、5g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠，pH保持在7.2‑7.5之间。再将活化处于对数期的苯胺降解菌液按照5%的接入量转接至50L种子罐中进行培养，控制种子罐温度维持在37℃、转速保持在220‑250 rpm，溶氧DO控制在4‑6 mg/L，培养36h。种子罐的培养基成分为（质量比）：苯胺0  .2％，葡萄糖0  .6％，NH4Cl 0.2%，KH2PO4 0  .1％，MgSO4 0  .05％，NaCl 0 .02％，CaCO3 0 .3％，酵母膏0  .01％，余量为水，pH维持在7.2‑7.5之间。最后将种子罐培养的苯胺降解菌液按照2%‑5%的接种量转接至1000L发酵罐中扩大培养，发酵罐培养基成分与种子罐的相同，各物化参数指标为：温度37℃、转速250rpm、溶氧8 mg/L、发酵时间56h。发
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酵结束后，罐体菌液有效活菌数可达10 个/ml以上，发酵培养液出罐后用塑料桶包装后便可得到苯胺高效降解菌菌剂。

[0034] 实施例5菌株BA‑7在实际苯胺废水中的应用

[0035] 为了进一步验证本发明所用到的苯胺高效降解菌BA‑7在实际含苯胺废水中的应用效果，从以苯胺为主要生产原料的化工厂污水站获得了含苯胺的生产废水。经过测定，废水中苯胺浓度为2g/L，浓度较高。我们将苯胺降解菌BA‑7发酵液按10%的接种量直接加入到苯胺的生产废水中，适量补充氮源NH4Cl和磷源KH2PO4并调节体系pH在7.2，以满足微生物正常生长的需要。在室温曝气条件下，按0h、2h、6h、12h、18h、24h定时取样监测体系中苯胺的变化。苯胺降解数据如附图3所示：废水中的苯胺在2h之内便发生了降解，苯胺浓度从2g/L降到了1.8g/L，降解效果达到了10%，经过12h，苯胺浓度已下降到0.6g/L,降解率实现70%。24h后，苯胺浓度已降到0.04 g/L，降解率高达98%。以上实验数据表明，苯胺高效降解菌BA‑
7在实际含苯胺废水中也具有良好的处理效果，有着广阔的应用前景。