一种用于眼部护理的中药组合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种用于眼部护理的中药组合物及其制备方法和应用，选用川芎、茯苓、白术、白及、白蔹、人工牛黄、珍珠、冰片等常见中药材，合理配伍，采用简单的酶解、热回流、醇沉等制备工艺，得到的药材有效成分含量高，且产品稳定性和质量均较好，对因睡眠状态不佳、压力等原因造成眼部皮肤微循环不畅和黑色素沉着造成黑眼圈的效果显著，对眼部干燥和衰老引起的细纹和松弛也具有较好的效果。本发明提供的一种用于眼部护理的中药组合物成分常见、副作用小，具有良好的应用前景。

权利要求

1.一种用于眼部护理的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料制成：原料        重量份川芎        120 180份~

茯苓        80 120份~

白术        80 120份~

白及        40 60份~

白蔹        40 60份~

人工牛黄 0.5 1.5份~

珍珠 2 4份~

冰片        0.5 1.5 份；

~

其中，所述中药组合物的制备包括如下步骤：（1）药材粉碎：按比例称取川芎、茯苓、白术、白及、白蔹，粉碎、过筛，得药材粉末；

（2）酶解：将步骤（1）所得药材粉末进行酶解，酶解完成后过滤，得滤渣和滤液；

（3）热回流提取：向步骤（2）所得滤渣中加入蒸馏水，进行热回流提取，得热回流提取液，然后将所述热回流提取液与步骤（2）所得滤液合并，减压浓缩，得浓缩液A；

（4）醇沉：向步骤（3）所得浓缩液A中加入乙醇进行醇沉，得上清液，将所述上清液过滤后再次进行减压浓缩，得浓缩液B；

（5）混匀：取冰片和人工牛黄溶于丙二醇，加入珍珠及步骤（4）所得浓缩液B，然后加水搅拌，过滤灭菌，即得所述中药组合物。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料制成：原料         重量份川芎         140 160份~

茯苓         90 110份~

白术         90 110份~

白及         45 55份~

白蔹         45 55份~

人工牛黄 0.8 1.2份~

珍珠 2.5 3.5份~

冰片         0.8 1.2 份。

~

3.根据权利要求2所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料制成：原料         重量份川芎         150份茯苓         100份白术         100份白及         50份白蔹         50份人工牛黄     1份珍珠         3份冰片         1份。

4.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，步骤（1）中所述药材粉末的粒度不大于60目。

5.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，步骤（2）中，所述酶为复合酶，所述复合酶由质量比为2:1:0.5的纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶组成，所述酶解的工艺参数为：酶用量为7 15mg/g、酶解pH值为3.5 6.5、酶解时间为20 120min、酶解温度为40 60℃、料液~ ~ ~ ~

比为1g:（20 50）mL。

~

6.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，步骤（3）中，所述热回流提取的工艺参数为：热回流温度为90 100℃、滤渣与水的质量比为1:（8 12）、热回流时间为1.5 2.5h。

~ ~ ~

7.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，步骤（3）中，所述减压浓缩的温度为

70 80℃，真空度为‑0.06 ‑0.08Mpa，浓缩比重为1.05‑1.10。

~ ~

8.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，步骤（4）中，所述醇沉浓度为50~

70%，所述减压浓缩的浓缩温度为70℃ 80℃，真空度不大于‑0.08Mpa，减压浓缩至相对密度~

为1.15 1.25。

~

9.权利要求1 8任一项所述中药组合物作为添加剂在制备眼部护理产品中的应用。

~

说明书

一种用于眼部护理的中药组合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及中药组合物，具体涉及一种用于眼部护理的中药组合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 眼部肌肤是人体最薄的肌肤，同时又是活动最频繁的部位，现代社会高节奏的生活方式使得眼睛及眼周肌肤长时间处于紧张状态，从而容易导致眼部疲劳、眼睛干涩、眼周
皮肤微循环不畅。同时，暖气、空调器的长时间使用易造成皮肤缺水，眼部皮肤表皮和真皮
层的厚度只有0.55毫米，只有面部皮肤的四分之一厚，更容易出现缺水干燥问题；而且眼部
化妆使用的眼影、眼线、睫毛膏等彩妆品的使用和卸妆带来的频繁的物理及化学伤害，都使
得人们的眼部皮肤变得更为脆弱敏感，从而产生黑眼圈、细纹、松弛等一系列问题。

[0003] 目前，市场上有许多用于眼部护理的产品，品种繁多，大部分的眼部护理产品都是化学合成产品(如文献资料CN106963706A、CN107456508A、CN110755465A等)，多用会对眼部
造成不适，虽然能暂时且快速地改善眼部健康问题，但可能存在一些副作用和依赖作用。

[0004] 同时，申请人检索后发现，现有研究中，用于眼部皮肤，且针对黑眼圈的外用中药方剂很少。基于此，亟需一种由纯天然药物制得的、副作用小、无依赖、安全性高的眼部护理
品。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种用于眼部护理的中药组合物，该中药组合物副作用小、安全性高，具有良好的抗氧化、美白、活血化瘀的功效；本
发明的另外一个目的在于提供一种用于眼部护理的中药组合物的制备方法，以及其作为添
加剂在眼部护理产品中的应用，该中药组合物对黑眼圈、眼部细纹和松弛效果显著。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一种用于眼部护理的中药组合物，由以下重量份的原料组成：

[0008]

[0009] 优选地，所述中药组合物由以下重量份的原料组成：

[0010]

[0011]

[0012] 优选地，所述中药组合物由以下重量份的原料组成：

[0013]

[0014] 本发明还提供了一种上述用于眼部护理的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

[0015] (1)药材粉碎：按比例称取川芎、茯苓、白术、白及、白蔹，粉碎、过筛，得药材粉末；

[0016] (2)酶解：将步骤(1)所得药材粉末进行酶解，酶解完成后过滤，得滤渣和滤液；

[0017] (3)热回流提取：向步骤(2)所得滤渣中加入蒸馏水，进行热回流提取，得热回流提取液，然后将所述热回流提取液与步骤(2)所得滤液合并，减压浓缩，得浓缩液A；

[0018] (4)醇沉：向步骤(3)所得浓缩液A中加入乙醇进行醇沉，得上清液，将所述上清液过滤后再次进行减压浓缩，得浓缩液B；

[0019] (5)混匀：取冰片和人工牛黄溶于丙二醇，加入珍珠及步骤(4)所得浓缩液B，加水搅拌，过滤灭菌，即得所述中药组合物。

[0020] 优选地，步骤(1)中所述药材粉末的粒度不大于60目。

[0021] 优选地，步骤(2)中，所述酶为复合酶，所述复合酶由质量比为2:1:0.5的纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶组成，所述酶解的工艺参数为：酶用量为7～15mg/g、酶解pH值为3.5
～6.5、酶解时间为20～120min、酶解温度为40～60℃、料液比为1g：(20～50)mL。

[0022] 优选地，步骤(3)中，所述热回流提取的工艺参数为：热回流温度为90～100℃、滤渣与水的质量比为1:(8～12)、热回流时间为1.5～2.5h。

[0023] 优选地，步骤(3)中，所述减压浓缩的温度为70～80℃，真空度为‑0.06～‑0.08Mpa。

[0024] 优选地，步骤(3)中浓缩比重为1.05～1.10(70～80℃)。

[0025] 优选地，步骤(4)中，所述醇沉浓度为50～70％，所述减压浓缩的浓缩温度为70℃～80℃，真空度不大于‑0.08Mpa。

[0026] 优选地，步骤(4)中减压浓缩至相对密度1.15～1.25(60℃～70℃)。

[0027] 优选地，步骤(5)中珍珠为珍珠提取液。

[0028] 本发明还提供了一种由上述方法制备得到的中药组合物作为添加剂在眼部护理产品中的应用。需要说明的是，所述眼部护理产品由所述中药组合物配以辅料经过常规工
艺制成，本发明不对辅料和工艺作特别限定，采用本领域技术人员常用和熟知的辅料和工
艺即可。所述眼部护理产品具体包括眼霜、眼膜、眼部精华、眼贴等。

[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0030] (1)本发明提供的一种用于眼部护理的中药组合物，由中药材配伍制备而成，副作用小，所有的原料均符合《已使用化妆品原料名称目录》的要求。其中，牛黄具有一定的抗氧
化功能；冰片起防腐生肌之效；珍珠起明目、安神、息风、生肌敛疮之效；选用白蔹、白及、白
术、茯苓、川芎五味药材，进一步强化美白、抗氧化功能；且在保证效果的基础上，优化用量，
重用白术、茯苓、川芎，确保针对黑眼圈的治疗效果，同时，减少冰片的用量，以减少其对皮
肤带来的不适感。优选上述各成分并合理配伍，达到最佳的药效。

[0031] (2)本发明的中药组合物具有清除DPPH自由基、抑制酪氨酸酶和透明质酸酶的作用，具有拮抗ADP诱导血小板凝集的作用，还能延长凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)，
并降低纤维蛋白原(FIB)水平，其制得的添加剂具有较好的抗氧化、美白、活血化瘀的功效。

[0032] (3)本发明优化制备工艺，采用含酶解、热回流及醇沉的主要工艺路线，大大提高了川芎、茯苓、白术、白及、白蔹五味原料的提取效率，得到的提取物中有效成分阿魏酸的含
量较高，同时制得的产品稳定性和质量均较好。

[0033] (4)本发明制得的眼部护理产品成分纯天然、质量安全可靠、无任何不良反应；对因睡眠状态不佳、压力等原因造成眼部皮肤微循环不畅和黑色素沉着造成黑眼圈的效果显
著，对眼部干燥和衰老引起的细纹和松弛也具有较好的效果。

[0034] (5)本发明制得的一种中药组合物，作为添加剂和辅助物相互配合在各剂型的眼部护理产品中使用，工艺简单，使用方便。

[0035] (6)本发明中优选纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶三种复合酶，增强酶解效果，促进有效成分的充分提取。

具体实施方式

[0036] 以下通过具体较佳实施例结合效果试验例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

[0037] 实施例1

[0038] 一种用于眼部护理的中药组合物，由以下重量的原料组成：

[0039]

[0040]

[0041] 所述用于眼部护理的中药组合物的制备方法包括如下：

[0042] (1)药材粉碎：按比例称取川芎、茯苓、白术、白及、白蔹，干燥、粉碎，过筛，得60目药材粉末；

[0043] (2)酶解：向步骤(1)所得药材粉末中加入蒸馏水和复合酶(纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶的质量比为2:1:0.5)进行酶解，酶解料液比为1g：30mL，酶用量为12mg/g，酶解pH
＝4.5，酶解时间为90min，酶解温度为55℃，酶解后过滤，得到滤渣和滤液；

[0044] (3)热回流提取：向步骤(2)所得滤渣中加入10倍质量的蒸馏水，加热升温到100℃，热回流提取2h，得热回流提取液，然后将所述热回流提取液与步骤(2)所得滤液合并，将
合并滤过后的药液减压浓缩(温度70～80℃，真空度‑0.06～‑0.08MPa)，药液浓缩比重为
1.05‑1.10(70～80℃)，得浓缩液A；

[0045] (4)醇沉：向步骤(3)所得浓缩液A中缓慢加入乙醇至含醇含量达60％，静置24h，将上清液经200目过滤至回流提取浓缩罐，残渣弃去，得上清液，将所述上清液减压浓缩至相
对密度1.15～1.25(60℃～70℃)，浓缩温度70℃～80℃，真空度≤‑0.08Mpa，减压回收上清
液中乙醇，至无醇味，得浓缩液B；

[0046] (5)混匀：取冰片和人工牛黄添加到250mL丙二醇中，水浴加热至80℃充分溶解，依次加入10mL珍珠提取液(相当于3g珍珠)及步骤(4)所得浓缩液B，搅拌混匀，在搅拌过程中
缓慢加水至5L；将得到的溶液分别经0.8μm和0.45μm微孔滤膜滤过，灌封，湿热灭菌(100℃，
45分钟)，即得所述中药组合物。

[0047] 实施例2

[0048] 一种用于眼部护理的中药组合物，由以下重量的原料组成：

[0049]

[0050] 所述用于眼部护理的中药组合物的制备方法包括如下：

[0051] (1)药材粉碎：按比例称取川芎、茯苓、白术、白及、白蔹，干燥、粉碎，过筛，得60目药材粉末；

[0052] (2)酶解：向步骤(1)所得药材粉末中加入蒸馏水和复合酶(纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶的质量比为2:1:0.5)进行酶解，酶解料液比为1g：20mL，酶用量为9mg/g，酶解pH＝
5，酶解时间为100min，酶解温度为50℃，酶解后过滤，得到滤渣和滤液；

[0053] (3)热回流提取：向步骤(2)所得滤渣中加入12倍质量的蒸馏水，加热升温到90℃，热回流提取2h，得热回流提取液，然后将所述热回流提取液与步骤(2)所得滤液合并，将合
并滤过后的药液减压浓缩(温度70～80℃，真空度‑0.06～‑0.08MPa)，药液浓缩比重为
1.05‑1.10(70～80℃)，得浓缩液A；

[0054] (4)醇沉：向步骤(3)所得浓缩液A中缓慢加入乙醇至含醇含量达70％，静置24h，将上清液经200目过滤至回流提取浓缩罐，残渣弃去，得上清液，将所述上清液减压浓缩至相
对密度1.15～1.25(60℃～70℃)，浓缩温度70℃～80℃，真空度≤‑0.08Mpa，减压回收上清
液中乙醇，至无醇味，得浓缩液B；

[0055] (5)混匀：取冰片和人工牛黄添加到250mL丙二醇中，水浴加热至80℃充分溶解，依次加入12mL珍珠提取液(相当于3.6g珍珠)及步骤(4)所得浓缩液B，搅拌混匀，在搅拌过程
中缓慢加水至5L；将得到的溶液分别经0.8μm和0.45μm微孔滤膜滤过，灌封，湿热灭菌(100
℃，45分钟)，即得所述中药组合物。

[0056] 实施例3

[0057] 一种用于眼部护理的中药组合物，由以下重量的原料组成：

[0058]

[0059]

[0060] 所述用于眼部护理的中药组合物的制备方法包括如下：

[0061] (1)药材粉碎：按比例称取川芎、茯苓、白术、白及、白蔹，干燥、粉碎，过筛，得60目药材粉末；

[0062] (2)酶解：向步骤(1)所得药材粉末中加入蒸馏水和复合酶(纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶的质量比为2:1:0.5)进行酶解，酶解料液比为1g：40mL，酶用量为14mg/g，酶解pH
＝4，酶解时间为70min，酶解温度为50℃，酶解后过滤，得到滤渣和滤液；

[0063] (3)热回流提取：向步骤(2)所得滤渣中加入9倍质量的蒸馏水，加热升温到100℃，热回流提取2h，得热回流提取液，然后将所述热回流提取液与步骤(2)所得滤液合并，将合
并滤过后的药液减压浓缩(温度70～80℃，真空度‑0.06～‑0.08MPa)，药液浓缩比重为
1.05‑1.10(70～80℃)，得浓缩液A；

[0064] (4)醇沉：向步骤(3)所得浓缩液A中缓慢加入乙醇至含醇含量达65％，静置24h，将上清液经200目过滤至回流提取浓缩罐，残渣弃去，得上清液，将所述上清液减压浓缩至相
对密度1.15～1.25(60℃～70℃)，浓缩温度70℃～80℃，真空度≤‑0.08Mpa，减压回收上清
液中乙醇，至无醇味，得浓缩液B；

[0065] (5)混匀：取冰片和人工牛黄添加到250mL丙二醇中，水浴加热至80℃充分溶解，依次加入8mL珍珠提取液(相当于2.4g珍珠)及步骤(4)所得浓缩液B，搅拌混匀，在搅拌过程中
缓慢加水至5L；将得到的溶液分别经0.8μm和0.45μm微孔滤膜滤过，灌封，湿热灭菌(100℃，
45分钟)，即得所述中药组合物。

[0066] 对比例1

[0067] 一种用于眼部护理的中药组合物，由以下重量的原料组成：

[0068]

[0069] 所述用于眼部护理的中药组合物的制备方法包括如下：

[0070] (1)水提：按比例称取川芎、茯苓、白术、白及、白蔹，加入10倍量的蒸馏水，煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，将过滤后的药液减压浓缩(温度70～80℃，真空度‑0.06～‑
0.08MPa)，得浓缩液A；

[0071] (2)醇沉：向步骤(1)所得浓缩液A中缓慢加入乙醇至含醇量达60％，静置24h，将上清液经200目过滤至回流提取浓缩罐，残渣弃去，得上清液，将所述上清液减压浓缩至相对
密度1.15～1.25(60℃～70℃)，浓缩温度70℃～80℃，真空度≤‑0.08Mpa，减压回收上清液
中乙醇，至无醇味，得浓缩液B；

[0072] (3)混匀：取冰片和人工牛黄添加到250mL丙二醇中，水浴加热至80℃充分溶解，依次加入珍珠提取液及步骤(2)所得浓缩液B，搅拌混匀，在搅拌过程中缓慢加水至5L；将得到
的溶液分别经0.8μm和0.45μm微孔滤膜滤过，灌封，湿热灭菌(100℃，45分钟)，即得所述中
药组合物。

[0073] 对比例2

[0074] 一种用于眼部护理的中药组合物，由以下重量的原料组成：

[0075]

[0076] 所述用于眼部护理的中药组合物的制备方法包括如下：

[0077] (1)药材粉碎：按比例称取川芎、茯苓、白术、白及、白蔹，干燥、粉碎，过筛，得60目药材粉末；

[0078] (2)酶解：向步骤(1)所得药材粉末中加入蒸馏水和复合酶(纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶的质量为2:1:0.5)进行酶解，酶解料液比为1g：30mL，酶用量为12mg/g，酶解pH＝
4.5，酶解时间为90min，酶解温度为55℃，酶解后过滤，得到滤渣和滤液；对所述滤液减压浓
缩(温度70～80℃，真空度‑0.06～‑0.08MPa)，药液浓缩比重为1.05‑1.10(70～80℃)，得浓
缩液A；

[0079] (3)醇沉：向步骤(2)所得浓缩液A中缓慢加入乙醇至含醇量达60％，静置24h，将上清液经200目过滤至回流提取浓缩罐，残渣弃去，得上清液，将所述上清液减压浓缩至相对
密度1.15～1.25(60℃～70℃)，浓缩温度70℃～80℃，真空度≤‑0.08Mpa，减压回收上清液
中乙醇，至无醇味，得浓缩液B；

[0080] (4)混匀：取冰片和人工牛黄添加到250mL丙二醇中，水浴加热至80℃充分溶解，依次加入珍珠提取液及步骤(3)所得浓缩液B，搅拌混匀，在搅拌过程中缓慢加水至5L；将得到
的溶液分别经0.8μm和0.45μm微孔滤膜滤过，灌封，湿热灭菌(100℃，45分钟)，即得所述中
药组合物。

[0081] 对比例3

[0082] 与实施例1相比，仅步骤(2)中所述的复合酶替换为质量比为2:1的纤维素酶和果胶酶，其他步骤一致。

[0083] 试验例1

[0084] 提取效率评价：利用实施例1～2和对比例1～3所述方法制得浓缩液B，继续干燥后得到干浸膏，测定干浸膏的质量，测定结果见表1。

[0085] 表1

[0086] 试验例 干浸膏质量/g实施例1 122
实施例2 124
对比例1 92
对比例2 77
对比例3 110

[0087] 由表1可知，与对比例相比，本发明实施例提取得到的有效成分更多，由此说明酶辅助提取配合热回流提取能进一步提高产率和产品质量，大大提高了所述中药原料的提取
效率和有效成分阿魏酸的含量；且从对比例3的结果来看，复合酶的种类选择对提取效率也
有影响。

[0088] 试验例2

[0089] 采用影响因素试验对实施例和对比例制得的添加剂的稳定性进行测试，测试主要包括高温试验和强光照射试验；其中，试验中对添加剂中的阿魏酸的含量利用HPLC进行检
测，具体检测参数如下：

[0090] (1)色谱条件：以甲醇‑0.1％醋酸溶液(30:70)为流动相；流速为1mL·min‑1；检测波长为321nm；

[0091] (2)对照品溶液的制备：取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得；

[0092] (3)供试品溶液的制备：精密量取添加剂溶液约3mL，置具10mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，静置，取上清液，经0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0093] (4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0094] 高温试验：将本品置稳定性考察箱中，在60℃条件下放置10天，于0、5、10天取样检测样品的性状、澄清度以及有效成分阿魏酸的含量，具体的检测结果如表2所示。

[0095] (2)强光照射试验：将本品置于装有光源的箱内，在照度为4500lx±500lx条件下放置10天，在0、5、10天取样检测样品的性状、澄清度以及有效成分阿魏酸的含量，具体的检
测结果如表3所示。

[0096] 稳定性试验表明：高温和强光照射对试验品的性状和澄清度均影响不大，本发明中药组合物具有较好的稳定性，但对本品中有效成分阿魏酸的含量有一定影响，建议采用
遮光阴凉处保存。此外，与对比例相比，本发明实施例制得的添加剂溶液中有效成分更多、
澄清度更好，因此，本发明提取效率较高，提取得到的产品质量较好。

[0097] 表2

[0098]

[0099] 表3

[0100]

[0101] 试验例3

[0102] 按照实施例1所述方法制备添加剂，并以5倍量处方制备起始生药量为3.80g/mL的高浓度添加剂，接着进行药效评价，评价维度包括：

[0103] 1)清除DPPH自由基抗氧化实验；

[0104] 2)抑制透明质酸酶抗炎实验；

[0105] 3)抑制酪氨酸酶美白实验；

[0106] 4)对ADP诱导血小板凝集实验；

[0107] 5)体外抗凝血实验，包括检测：凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)。

[0108] 1、实验方法

[0109] (1)药液配制

[0110] 添加剂临用前涡旋至均匀，起始生药量为3.80g/ml，加入50％乙醇稀释至所需倍数。

[0111] (2)DPPH自由基清除

[0112] 实验分为空白对照组(溶剂对照，50％乙醇)、试验组(3.80，1.90，0.95，0.48，0.24，0.12，0.06，0.03，0.015，0.0074g/ml)及阳性对照药维生素C(100.00、50.00、25.00、
12.50、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.20μg/ml)。吸取各样品100μl于96孔板，加入100μl 
DPPH溶液，混匀后室温避光30min，517nm处测定吸光值(A)；以空白肠吸收液为空白对照
(A0)，各样品与DPPH溶液为测定样品(A1)，各样品与样品稀释液为对照样品(A2)，则样品吸
光值为A(A1‑A2)。

[0113] DPPH自由基清除率计算公式如下：

[0114] 清除率(％)＝(A0‑A)/A0×100％。

[0115] (3)酪氨酸酶抑制筛选

[0116] 实验分为酪氨酸酶对照组(酪氨酸酶反应液，EC)、试验组(3.80，1.90，0.95，0.48，0.24，0.12，0.06，0.03，0.015，0.0074g/ml)及对照抑制剂组曲酸(7.5mM)。吸取各样品20μl
于96孔板，每个孔加入50μl酪氨酸酶溶液(48μl酶反应液和2μl酪氨酸酶)，混匀，室温孵育
10min。每孔加入30μl酪氨酸底物溶液(30μl酶反应液、2μl酪氨酸底物和5μl酪氨酸增强
剂)，混匀；室温孵育至30min，510nm测量吸光值(Abs1)，室温孵育至60min再次测量吸光值
(Abs2)。

[0117] 酪氨酸酶抑制率(％)计算公式如下：

[0118] ％Relative Inhibition＝(slope of EC‑Slope of S)/slope of EC×100％；

[0119] 其中，S为受试样品；EC为酪氨酸酶反应液。

[0120] (4)数据处理

[0121] 采用SigmaStat 3.5统计软件处理数据，实验结果以均数±标准差(x±s)表示。每个实验重复3次，每组至少3个独立样本。多组间比较使用单因素方差(ANOVA)分析，任意两
组间比较使用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

[0122] 2、实验结果

[0123] (1)对DPPH自由基清除的影响

[0124] 如表4所示，与空白对照组(清除率为0)相比较，试验组的10个浓度均有DPPH自由基清除的作用，以0.48、0.24和0.12g/ml等三个浓度自由基清除能力较佳，清除率分别为
(90.05±3.49)％、(84.61±2.43)％和(82.72±2.94)％(P＜0.01)；阳性对照药维生素C
(1.57μg/ml)的最大自由基清除率为(83.35±3.20)％(P＜0.01)。上述试验结果表明，本发
明制备得到的添加剂具有良好的抗氧化能力。

[0125] 表4对DPPH自由基清除的影响( n＝9)

[0126]

[0127]

[0128] 注：与空白对照组比较，**P<0.01。

[0129] (2)对酪氨酸酶抑制的影响

[0130] 如表5所示，与酪氨酸酶对照组(抑制率为0)相比较，试验组的10个浓度均有酪氨酸酶抑制作用，以0.48、0.24、0.12、0.06和0.03g/ml抑制作用较佳，抑制率分别为(87.76±
3.38)％、(83.19±13.93)％、(92.03±5.18)％、(93.59±7.83)％和(86.24±11.31)％(P
＜0.01),而对照抑制剂组曲酸(7.5mM)的抑制率为(50.52±10.34)％(P＜0.01)。上述试验
结果表明：本发明制备得到的添加剂具有良好的酪氨酸酶抑制作用，具有潜在的去黑色素
能力。

[0131] 表5对酪氨酸酶抑制的影响( n＝9)

[0132] 试验组浓度(g/ml) 抑制率(％)3.80 29.80±14.17*
1.90 46.42±19.05**
0.95 43.02±0.79**
0.48 87.76±3.38**
0.24 83.19±13.93**
0.12 92.03±5.18**
0.06 93.59±7.83**
0.03 86.24±11.31**
0.015 54.15±4.32**
0.0074 26.43±0.82*

[0133] 注：与酪氨酸酶对照组比较，**P<0.01；*P<0.05。

[0134] (3)对透明质酸酶抑制的影响

[0135] 如表6所示，试验组最大浓度3.80g/ml对透明质酸酶的抑制率为(63.40±3.17)％，结果表明本发明制得的中药组合物对透明质酸酶有一定的抑制作用，具有潜在的
抗过敏效果。

[0136] 表6对透明质酸酶抑制的影响( n＝3)

[0137] 试验组浓度(g/ml) 抑制率(％)3.80 63.40±3.17
1.90 47.83±6.29
0.95 44.21±6.59
0.48 38.48±4.48
0.24 34.08±3.26
0.12 29.75±3.20
0.06 22.47±3.59
0.03 16.51±3.54
0.015 0
0.0074 0

[0138] (4)对ADP诱导血小板凝集的影响

[0139] 如表7所示，与ADP诱导血小板凝集模型组相比较，试验组中、高剂量均可抑制血小板凝集(P<0.05)，血小板凝集率分别为(14.70±2.37)％和(10.22±1.51)％；阿司匹林也
可抑制ADP诱导血小板凝集，血小板凝集率为(13.75±2.69)％。

[0140] 表7对ADP诱导血小板凝集的影响( n＝4)

[0141]组别 浓度(mg/ml) 血小板凝集率(％)
模型组 / 26.55±8.92
低剂量组 1.25 21.90±11.49
中剂量组 2.50 14.70±2.37*
高剂量组 5.00 10.22±1.51*
阿司匹林组 0.25 13.75±2.69*

[0142] 注：与模型组比较，*P<0.05。

[0143] (5)对凝血四项的影响

[0144] 如表8所示，与模型组相比较，试验组不同剂量均能延长凝血酶原时间(PT)，中、高剂量延长凝血酶时间(TT)，不同剂量均能降低纤维蛋白原(FIB)水平，阿司匹林延长活化部
分凝血活酶时间(APTT)，并降低纤维蛋白原(FIB)水平。

[0145] 表8对凝血四项的影响( n＝4)

[0146]

[0147] 注：与模型组相比较，**P<0.01；*P<0.05。

[0148] 试验例4

[0149] 向实施例1制得的添加剂中加入山梨酸钾、环糊精包合物、黄原胶、甘油等辅料，混匀得半成品药液，涂布于无纺布上；每贴含药液4g，灭菌，即得；再将所制得的眼贴进行临床
试用评价，试用人群选择有去除黑眼圈和眼周细纹需求的人群。

[0150] 1、临床试用评价方法

[0151] 每日清水洁面后，将眼贴贴敷于双眼外眼部，2次/日，每次20分钟，试用第14天和第28天进行观察并统计。

[0152] 2、临床试用评价结果

[0153] (1)一般情况

[0154] 本次试用人群共50人，共计发放调查问卷50份，回收50份，回收率100.0％，其中男性19人(38.0％)，女性31人(62.0％)，试用人群的年龄波动范围：25～48岁，年龄25‑30岁的
有27人，占比54.0％；31‑40岁的有15人，占比30.0％；40岁以上的有8人，占比16.0％。

[0155] 调查问卷中的试用效果评价标准具体为4类：无改善或者改善不明显、轻度改善、中度改善、明显改善或完全改善。显效＝中度改善+明显改善或完全改善；有效＝轻度改善+
中度改善+明显改善或完全改善。

[0156] (2)试用产品黑眼圈改善效果评价

[0157] 试用14天后和试用28天的黑眼圈改善效果见表9，由表可知，本发明组合物制备的眼贴见效快，针对黑眼圈14天有效率可达80.0％，28天有效率达98.0％，且没有出现任何过
敏和不适的现象。本发明眼贴对眼部皮肤微循环不畅和黑色素沉着造成黑眼圈有较好的效
果。

[0158] 表9试用产品黑眼圈改善效果

[0159]

[0160] (3)试用产品眼纹改善效果评价

[0161] 试用14天后和试用28天的眼纹改善效果见表10，由表可知，本发明组合物制备的眼贴见效快，针对眼纹14天有效率可达82％，28天有效率达98％，且没有出现任何过敏和不
适的现象。本发明眼贴对眼周皮肤衰老或干燥缺水造成的细纹同样有较好的效果。

[0162] 表10试用产品眼纹改善效果

[0163]

[0164] 最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上
所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。