保加利亚乳杆菌TCI904、其组合物及其用于减少体重的用途

摘要

本发明提供一种保加利亚乳杆菌TCI904、其组合物及其用于减少体重的用途，保加利亚乳杆菌TCI904其具有抑制脂肪酶活性的功能。此外，所述保加利亚乳杆菌TCI904及其代谢产物可进一步提供做为食品组合物。其中保加利亚乳杆菌TCI904寄存于德国微生物菌种保藏中心DSMZ，寄存编号为DSM33505。

权利要求

1.一种保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)TCI904，其特征在于，其寄存于德国微生物菌种保藏中心DSMZ，寄存编号DSM33505。

2.如权利要求1所述的保加利亚乳杆菌TCI904，其特征在于，其包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

3.如权利要求1所述的保加利亚乳杆菌TCI904，其特征在于，其具有抑制脂肪酶活性的能力。

4.如权利要求3所述的保加利亚乳杆菌TCI904，其特征在于，其抑制脂肪酶的活性至少

35％。

5.一种组合物，其特征在于，包含保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)TCI904及/或其代谢产物，所述保加利亚乳杆菌寄存于德国微生物保藏菌种中心DSMZ，寄存编号DSM33505。

6.一种如权利要求5所述的组合物的用途，其特征在于，其用于制备减少人体的体重或体脂的组合物。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述体脂为躯干体脂。

8.一种如权利要求5所述的组合物的用途，其特征在于，其用于制备非治疗目的的调节人体的脂联素、三酸甘油酯、极低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的组合物。

9.如权利要求6或8所述的用途，其特征在于，所述人体为身高体重指数大于24或身体体脂率大于25％的人体。

8

10.如权利要求6或8所述的用途，其特征在于，所述组合物含有1× 10CFU个菌数的保加利亚乳杆菌TCI904。

说明书

保加利亚乳杆菌TCI904、其组合物及其用于减少体重的用途

技术领域

[0001] 本发明关于一种保加利亚乳杆菌TCI904(Lactobacillus bulgaricus TCI904)，特别是关于一种保加利亚乳杆菌TCI904或其代谢产物用于减少体重的用途。

背景技术

[0002] 益生菌(Probiotics)一般认为是指食入后对宿主(或称受体，如动物或人类)有正面效益的食入性微生物。其命名源于希腊语「for life」(对生命有益)，又称为「原生保健性
菌种」；并且，益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。

[0003] 一般而言「，乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)」是指能利用碳水化合物进行发酵生产多量乳酸的细菌总称，为一相当庞杂的菌群。在诸多乳酸菌的菌种中，部分乳酸菌菌种的
菌株经研究发现其对于受体健康有益，故此些菌株被视为益生菌。换言之，益生菌大部分是
乳酸菌，但乳酸菌中只有少数经研究证明对受体健康有益的菌株能被称为益生菌。

[0004] 举例来说，常见的可作为益生菌的乳酸菌的菌种包括肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)等，而
可作为益生菌的酵母菌的菌种包括酵母菌属(Saccharomyces)。

[0005] 乳杆菌属是一群具有发酵能力、兼性厌氧、不会产生孢子的革兰氏阳性杆菌。乳杆菌因能够将碳水化合物发酵成乳酸而得名，通常存在于发酵食物中，例如泡菜与味增等。

发明内容

[0006] 本发明的一目的，在于提供一种保加利亚乳杆菌TCI904，其寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)(寄存编号DSM33505)。

[0007] 在一些实施例中，保加利亚乳杆菌TCI904菌株包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

[0008] 在一些实施例中，保加利亚乳杆菌TCI904具有抑制脂肪酶活性的能力。

[0009] 在一些实施例中，保加利亚乳杆菌TCI904抑制脂肪酶的活性至少35％。

[0010] 本发明的另一目的，在于提供一种组合物，其包含一保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)TCI904及/或其代谢产物，所述保加利亚乳杆菌寄存于德国
微生物菌种保藏中心(DSMZ)(寄存编号DSM33505)。

[0011] 在一些实施例中，组合物用于制备减少一个体的体重或体脂的组合物。

[0012] 在一些实施例中，体脂为躯干体脂。

[0013] 在一些实施例中，组合物用于制备调节一个体的脂联素、三酸甘油酯(Triglyceride)、极低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein)或高密度脂蛋白
(High density lipoprotein)的组合物。

[0014] 在一些实施例中，个体为身高体重指数(BMI)大于24或身体体脂率大于25％的个体。

[0015] 在一些实施例中，组合物含有1X108CFU个菌数的保加利亚乳杆菌TCI904。

[0016] 本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将结合附图和具体实施例描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征，但不作为对本发明
的限定。

附图说明

[0017] 图1是试管实验中的脂肪酶活性检测的结果图；

[0018] 图2是细胞实验中的脂联素含量检测的结果图(*表示与空白组比较有显著差异，p<0.05)；

[0019] 图3是人体实验中的体重检测的结果图(*表示与第0周比较有显著差异，p<0.05)；

[0020] 图4是人体实验中的躯干体脂检测的结果图；

[0021] 图5是人体实验中的腰围检测的结果图(*表示与第0周比较有显著差异，p<0.05)；

[0022] 图6是人体实验中的三酸甘油酯含量检测的结果图(***表示与第0周比较有显著差异，p<0.001)；

[0023] 图7是人体实验中的极低密度脂蛋白含量检测的结果图(*表示与第0周比较有显著差异，p<0.05)；

[0024] 图8是人体实验中的高密度脂蛋白含量检测的结果图(**表示与第0周比较有显著差异，p<0.01)。

具体实施方式

[0025] 为了使本领域具有通常知识者能了解本发明的特点，以下就说明书及申请专利范围中提及术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有说明，否则文中使用的所有技术
及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，
应以本说明书的定义为准。

[0026] 本案使用Excel软体进行统计分析。数据以平均值±标准差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t‑test)进行分析。

[0027] 本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。

[0028] 本文所述的用语「组合物」，组合物为食品、保养品或医药品，较佳是指食品组合物。

[0029] 本文所述的用语「个体」是指人类或非人的哺乳动物，较佳为人类。

[0030] 本案发明人自泡菜筛选出一新颖菌株，经16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)序列分析，依亲缘关系鉴定为Lactobacillus delbrueckii  subsp.bulgaricus(又称
Lactobacillus bulgaricus，中文名称为保加利亚乳杆菌)，为德氏乳杆菌(Lactobacillus 
delbrueckii)的亚种，经命名为Lactobacillus bulgaricus TCI904(以下称为保加利亚乳
杆菌TCI904，简称TCI904)，其系寄存于德国微生物保藏菌种中心(DSMZ)(寄存编号为
DSM33505)。所述保加利亚乳杆菌TCI904系具有如SEQ ID NO:1所示的16S核糖体核糖核酸
(16S rRNA)片段。

[0031] 本案发明人研究发现，相较于本案发明人由泡菜筛选出的其他保加利亚乳杆菌(LF063、LF006、LF049)，本案的保加利亚乳杆菌TCI904具有明显更佳的抑制脂肪酶活性功
效，可抑制至少35％的脂肪酶活性，更佳可抑制至少39％的脂肪酶活性。

[0032] 本案发明人研究发现，保加利亚乳杆菌TCI904及/或其代谢产物系具有减少一个体的体重或体脂的功效。因此，本发明系提供一种保加利亚乳杆菌TCI904及/或其代谢产物
在制备减少一个体的体重或体脂的组合物的用途，其中，所述体脂所指可为躯干体脂。

[0033] 本案发明人研究发现，保加利亚乳杆菌TCI904及/或其代谢产物系具有减少一个体的脂联素、三酸甘油酯、极低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的功效。因此，本发明系提供一
种保加利亚乳杆菌TCI904及/或其代谢产物在制备减少一个体的的脂联素、三酸甘油酯、极
低密度脂蛋白或高密度脂蛋白的组合物的用途，其中，所述个体所指可为身高体重指数
(BMI)大于24或身体体脂率大于25％的个体。

[0034] 根据本发明，所采用的保加利亚乳杆菌TCI904的代谢产物可以是透过在适于保加利亚乳杆菌TCI904生长的环境下进行培养所产生者。例如：先以适当的培养液对保加利亚
乳杆菌TCI904进行培养，其后，视需要地去除前述培养液中的菌体等固体物，以获得含有代
谢产物的液体。或例如，先以适当的培养液对保加利亚乳杆菌TCI904进行培养，其后，以离
心等方法使菌体沉降于底部，再直接吸取上清液所获得含有代谢产物的液体。

[0035] 可选用任意合宜的培养液以进行保加利亚乳杆菌TCI904的培养，以提供所欲的代谢产物，只要所述培养液可提供保加利亚乳杆菌TCI904生长、代谢所需养分(如乳杆菌萃取
物、蛋白质及葡萄糖)与条件(如酸碱值)即可。此外，保加利亚乳杆菌TCI904的培养时间亦
无特殊限制，只要足以使保加利亚乳杆菌TCI904完成至少一次代谢循环即可。举例言之，于
本发明一具体实施态样中，系以MRS培养液对保加利亚乳杆菌TCI904进行培养，历时18小
时，使菌株进行代谢作用并产生代谢产物。

[0036] 于本发明中，系可直接使用经历保加利亚乳杆菌TCI904的代谢循环的含保加利亚乳杆菌TCI904与代谢产物的培养液，或使用经移除保加利亚乳杆菌TCI904等固体物的含代
谢产物的液体。可采用任何合宜的操作以移除固体物，只要对培养后所产生的代谢产物的
所欲效益没有不利的影响即可。一般而言，系采用物理手段以移除固体物，所述物理手段包
括，例如：离心分离、滤膜过滤、沉淀倾析等操作。视需要地，可重复或合并进行前述物理操
作，以尽可能去除培养液中的菌体等固体物。

[0037] 根据本发明所提供的组合物可为食品组合物，食品组合物系可以为健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、或特殊营养食品，且可制成例如乳制品、肉类加工品、面
包类、面食类、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为
限。

[0038] 根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品、及特殊营养食品系可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率食用，端视投予个体的年龄、体重、
及健康状况而异。亦可针对特定族群的需要，调整据本发明所提供的健康食品、保健食品、
机能性食品、营养补充品、及特殊营养食品中的保加利亚乳杆菌TCI904及/或其代谢产物的
含量，例如，调整至每日应服用的量。

[0039] 针对根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品及/或特殊营养食品，可于其外包装上标示建议使用量、特定族群(例如高血脂患者、孕妇等)的使用
标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项等，以利使用者在无医师、药师或相
关执事人员的指导下自行服用而无安全虞虑。于根据本发明所提供的食品组合物中，有关
所述保加利亚乳杆菌TCI904及/或其代谢产物的态样，系如上述的说明。

[0040] 视需要地，可于根据本发明所提供的食品组合物、或饲料组合物中另外含有合宜用量的添加剂，例如可提高所述医药组合物、食品组合物、或饲料组合物于服用时的口适感
及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善所述医药组合物、食品组合物、或饲料
组合物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。

[0041] 兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中所述等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围系如后附申请专利范围所示。

[0042] 实施例

[0043] [制备实施例]

[0044] 例1：保加利亚乳杆菌TCI904的筛选与鉴定

[0045] (1‑1)筛选

[0046] 取泡菜(产地：中国台湾)中的汁液分别与MRS培养液(BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth，型号DF0881‑17‑5)以体积比1：100的比例混合，并置于37℃下进行厌氧培养(氧
气浓度介于10％至1％，较佳为低于5％)，历时18小时。其后，将前述培养液涂布于MRS固态
培养基(MRS agar)上，并置于37℃下进行厌氧培养，以生成不同的菌落。接着，为确保菌株
的单一性，使用无菌接种环挑选一菌落，于固态培养基上进行分区划线，再置于37℃的厌氧
培养箱中培养直到单一菌落(single colony)出现。

[0047] (1‑2)鉴定

[0048] 取(1‑1)泡菜样品所分离出的单一菌落的菌株后，进行基因族谱分析(phylogenetic analysis)，确认所述菌株具有如SEQ ID NO:1所示的16S核糖体核糖核酸
(16S rRNA)片段。使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)线上资
料库进行比对，将SEQ ID NO:1所示的基因序列分别与其他保加利亚乳杆菌亚种的16SrDNA
序列进行序列比对后，可知分离菌株的16S rDNA序列与其他保加利亚乳杆菌亚种的
16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此，将此分离菌株命名为保加利亚乳杆菌TCI904(后
文以TCI904表示)。在此，将此保加利亚乳杆菌TCI904以寄存编号DSM33505寄存于德国微生
物菌种保藏中心(DSMZ)。

[0049] 取(1‑1)泡菜样品所分离出的另一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认所述菌株具有如SEQ ID NO:2所示的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线上资料库
进行比对，将SEQ ID NO:2所示的基因序列分别与其他保加利亚乳杆菌亚种的16S rDNA序
列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他保加利亚乳杆菌亚种的16SrDNA序
列的相似性如表一所示。在此，将此分离菌株命名为保加利亚乳杆菌LF063(后文以LF063表
示)。

[0050] 其中，取(1‑1)泡菜样品所分离出的再另一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认所述菌株具有如SEQ ID NO:3所示的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线
上资料库进行比对，将SEQ ID NO:3所示的基因序列分别与其他保加利亚乳杆菌亚种的
16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他保加利亚乳杆菌亚种的
16SrDNA序列的相似性如表一所示。在此，将此分离菌株命名为保加利亚乳杆菌LF006(后文
以LF006表示)。

[0051] 其中，取(1‑1)泡菜样品所分离出的再另一个菌落的菌株后，进行基因族谱分析，确认所述菌株具有如SEQ ID NO:4所示的16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI线
上资料库进行比对，将SEQ ID NO:4所示的基因序列分别与其他保加利亚乳杆菌亚种的
16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他保加利亚乳杆菌亚种的
16SrDNA序列的相似性如表一所示。因此，将此分离菌株命名为保加利亚乳杆菌LF049(后文
以LF049表示)。

[0052] 表一

[0053]

[0054]

[0055] 综合以上，本发明自泡菜样品共筛选出四种保加利亚乳杆菌，分别命名为TCI904、LF063、LF006、LF049。

[0056] (1‑3)保存

[0057] 使用液态培养的方式将(1‑1)所获得的具单一性的四种保加利亚乳杆菌菌株培养于MRS培养液中，以提供菌液，接着于菌液中添加25％的甘油，将所得混合液移至冷冻保存
管中后，置于‑80℃保存。

[0058] 例2：保加利亚乳杆菌TCI904的活化与样品制备

[0059] (2‑1)活化

[0060] 将存有保加利亚乳杆菌TCI904菌株的冷冻保存管解冻，以1％的植菌量(约1x104 CFU/mL)将TCI904菌株接种于MRS培养液中，并置于37℃下进行厌氧培养，历时18小时，以提
供保加利亚乳杆菌TCI904菌液，供后续实验使用。其余保加利亚乳杆菌LF063、LF006、LF049
也是按照此方式进行活化，本处不再赘述。

[0061] (2‑2)样品制备

[0062] 取(2‑1)提供的保加利亚乳杆菌TCI904菌液，以1％的植菌量(约1x104CFU/mL)接种于MRS培养液之中，并置于37℃下进行厌氧培养，历时18小时。其后，以5000rpm转速对培
养后的菌液进行离心，历时5分钟，再使用0.2μm的滤膜对所获得的上清液进行过滤，确保已
将菌体去除，所得滤液即为TCI904样品(即为TCI904的代谢产物，不含TCI904菌体)。其余保
加利亚乳杆菌LF063、LF006、LF049也是按照此方式进行样品制备，本处不再赘述。

[0063] [实验实施例]

[0064] 例3：保加利亚乳杆菌TCI904抑制脂肪酶活性的试管实验

[0065] (3‑1)脂肪酶活性的分析原理

[0066] 脂肪酶(lipase)是一种催化脂类中酯键水解反应的水溶性酵素，其与酯解酶(esterase)的主要差异为具有界面活化(interfacial activation)的特性，必须在油水界
面(lipid‑water interface)中进行水解催化反应，即：当受质呈乳化状态(emulsion)时，
酵素反应的速率为最高。大多数的脂肪酶系作用于脂类甘油骨架的特定位置，例如：脂肪酶
能够催化三酸甘油酯(triacylglycerols)水解成甘油、单酸甘油酯(monoacylglycerols)、
双酰基甘油酯(diacylglycerols)及游离脂肪酸。依脂肪酶水解三酸甘油酯的特异性，可分
为：(1)非特异性脂肪酶(non‑specific lipase)、(2)1,3‑特异性脂肪酶(1,3‑specific 
lipase)、(3)2‑特异性脂肪酶(2‑specific lipase)、(4)脂肪酸特异性脂肪酶(fatty acid 
specific lipase)等，而脂肪酶主要可进行的催化反应有酯解反应(ester hydrolysis)、
酯化反应(ester synthesis)、以及转酯化反应(interesterification)等。

[0067] 本实施例是利用硝基苯酚(p‑nitrophenol,pNP)生成量测定法来分析脂肪酶的活性。由于脂肪酶会将硝酸苯酚脂类基质(p‑nitrophenyl esters)进行水解，产生硝基苯酚
(p‑nitrophenol,pNP)及脂肪酸，可于波长约400nm测得硝基苯酚的吸光值定量，利用96孔
盘进行分析后，计算脂肪酶活性。硝酸苯酚脂类基质的种类并不限制，在本发明一较佳实施
例中，是以4‑硝基苯基月桂酸酯(4‑Nitrophenyl laurate)作为反应基质，脂肪酶能将其分
解成硝基苯酚，再以硝基苯酚的生成量来分析脂肪酶的活性。

[0068] (3‑2)脂肪酶活性实验的试剂配制

[0069] 首先，配置一第一缓冲溶液，所述第一缓冲溶液是将17mg十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)与1g聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X‑100)溶于100mL水中；亦配置
一第二缓冲溶液，所述第二缓冲溶液系66mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，并以盐酸
(Hydrochloric acid，HCl)滴定至pH 7.4后，补适量的水至体积为100ml，所述第二缓冲溶
液是作为制备脂肪酶溶液的缓冲液，以及作为酶解反应的终止剂。接着，取51.4mg的4‑硝基
苯基月桂酸酯加入100mL上述第一缓冲溶液，并于65℃下搅拌15分钟使其均匀混合，待溶液
呈澄清状后，于室温下冷却后，获得1.6mM的4‑硝基苯基月桂酸酯溶液。所述4‑硝基苯基月
桂酸酯溶液可置于4℃冷藏保存3天，使用时需再加热至65℃待溶液呈透明澄清状后，置于
室温下冷却后即可使用。另一方面，秤取99.21mg脂肪酶(型号L3126，Sigma，来自猪胰脏的
脂肪酶)加入上述第二缓冲溶液中，并定量至10mL后混合均匀，以获得150U/mL的脂肪酶溶
液。

[0070] (3‑3)脂肪酶活性实验的实验步骤

[0071] 取一96孔盘执行实验，分为控制组及四组实验组(以各种保加利亚乳杆菌的代谢产物做为测试样品)，下表二说明各组别采用的测试样品、反应酵素及反应基质。

[0072] 表二

[0073]

[0074]

[0075] 将25μL的测试样品加入96孔盘的孔中，接着在控制组及各实验组(实验组A、实验组B、实验组C、实验组D)孔中加入脂肪酶，在各空白组(控制组(空白)、实验组A(空白)、实验
组B(空白)、实验组C(空白)、实验组D(空白))中加入第二缓冲溶液，混合均匀。接着将50μL
的1.6mM的4‑硝基苯基月桂酸酯溶液加入孔中，混合均匀。封上塑胶膜防止挥发，置于37℃
反应30分钟，此时控制组及各实验组中的脂肪酶会与4‑硝基苯基月桂酸酯进行反应。最后，
加入100μL的第二缓冲溶液来中止所有孔中的反应，接着以ELISA读取仪(BioTek)读取各组
的OD400nm读值，以下列公式计算出脂肪酶活性抑制率。

[0076] 脂肪酶活性抑制率(％)公式＝[1‑(A实验组‑A实验组(空白)/A控制组‑A控制组(空白)]X100％，其中A代表OD400nm读值的读值。

[0077] 本发明的保加利亚乳杆菌TCI904及其他菌种抑制脂肪酶活性的效果如图1所示，由图1可见，将控制组的脂肪酶活性计为100％，实验组A(TCI904)的脂肪酶活性为60.71％，
代表TCI904可抑制脂肪酶活性高达约39.29％；实验组B(LF063)的脂肪酶活性为78.03％，
代表LF063可抑制脂肪酶活性约21.97％；实验组C(LF006)的脂肪酶活性为76.10％，代表
LF006可抑制脂肪酶活性约23.9％；实验组D(LF049)的脂肪酶活性为71.0％，代表LF049可
抑制脂肪酶活性约29.0％。

[0078] 根据此数据，说明本发明的保加利亚乳杆菌TCI904相较于其他同种菌株，具有明显更佳抑制脂肪酶活性的能力，表示本发明的保加利亚乳杆菌TCI904具有与其他同种菌株
不同的菌学特征。

[0079] 例4：保加利亚乳杆菌TCI904刺激脂联素分泌的细胞实验

[0080] 脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种功能性胜肽，能够促进肌肉细胞燃烧脂肪转换成能量，减少体内脂肪堆积，为改善肥胖的关键因子，当脂联素上升时，会促使
肌肉燃烧脂肪产生能量维持身体所需。研究证实，中高强度的运动会促使脂联素上升，帮助
肌肉代谢脂肪产生能量，达到减脂的效果。可参见例如：Effects of  exercise on 
adiponectin:a systematic review，Med Sci(Basel).2018Dec；6(4):97，所述文献的全文
并于此处以供参考。

[0081] 在此实施例中，利用细胞模式，检测TCI904样品调节脂联素分泌的能力。

[0082] (4‑1)实验材料

[0083] 1.细胞株：小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，OP9细胞购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection， )的OP9细胞株(ATCC CRL‑
2749)。

[0084] 2.培养基：MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，美国)细胞培养液、20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国，Cat#10437‑028)，且
加入0.1％的青霉素/链霉素(Penicillin‑streptomycin，购自Gibco，美国)。

[0085] 3.脂联素检测试剂套组(购自CUSABIO，型号CSB‑E07272m)，套组内含有以下溶液：

[0086] 3‑1：检测盘(Assay plate)

[0087] 3‑2：标准品(Standard)

[0088] 3‑3：100倍生物素抗体(100X Biotin‑antibody)

[0089] 3‑4：100倍HRP亲和素(100X HRP‑avidin)

[0090] 3‑5：生物素抗体稀释剂(Biotin‑antibody diluent)

[0091] 3‑6：HRP亲和素稀释剂(HRP‑avidin diluent)

[0092] 3‑7：样品稀释剂(Sample diluent)

[0093] 3‑8：25倍洗涤缓冲液(25X Wash buffer)

[0094] 3‑9：TMB液(TMB substrate)

[0095] 3‑10：终止液(Stop solution)

[0096] 3‑11：清洗液(Wash buffer)

[0097] 3‑12：检测盘封盖(Plate sealers)

[0098] (4‑2)操作前的试剂制备

[0099] 1. 1倍生物素抗体：将1μl的100倍生物素抗体加入999μl的生物素抗体稀释剂，混和均匀备用

[0100] 2. 1倍HRP亲和素：将1μl的100倍HRP亲和素加入999μl的HRP亲和素稀释剂，混和均匀备用

[0101] 3. 1倍洗涤缓冲液：将25倍洗涤缓冲液回温后，轻摇至结晶全部溶解，将20ml的25倍洗涤缓冲液加入480ml的水，混和均匀备用

[0102] 4.标准液：将标准品小管以6000‑10000rpm离心30秒，使粉末聚集至底部。加入1ml样品稀释剂混和均匀，静置15分钟使其充分溶解，达最终浓度10ng/ml

[0103] 5.标准液序列稀释：准备7个1.5ml微量离心管，分别加入250μl样品稀释剂，取250μl标准液至第6管，混和均匀后再从第6管取250μl至第5管，序列稀释至第1管，最终获得浓
度为10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.313ng/ml、0.156ng/ml的标准
液

[0104] 以下简述脂联素检测步骤，详细操作步骤可参照脂联素检测试剂套组所附的使用说明书执行，可参见https://www.cusabio.com/uploadfile/Ins/CSB‑E07272m.pdf，所述
使用说明书的全文并于此处以供参考。

[0105] (4‑3)脂联素检测前处理(细胞培养及分组方式)

[0106] 首先，取24孔培养盘，将每孔接种8×104个OP9细胞及500μL上述培养基，在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后，以显微镜(ZEISS；放大倍率
400x)观察细胞内油滴形成，藉以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。

[0107] 然后，将分化完成的脂肪细胞分为以下三组：控制组、空白组与实验组，下列表三说明各组的添加成分、细胞实验浓度以及处理时间。

[0108] 表三

[0109]

[0110]

[0111] 详细来说，各组是以以下方式进行培养。

[0112] 空白组：依照每孔500μL培养基体积量的方式培养分化后脂肪细胞，在37℃下培养24小时。

[0113] 控制组：依照每孔500μL培养基含有2.5μL的MRS培养液(即，浓度为0.5％(v/v))的方式，培养分化后脂肪细胞，在37℃下培养24小时。

[0114] 实验组：依照每孔500μL培养基含有2.5μL的例(2‑2)所制备的TCI904样品(TCI904的代谢产物，不含TCI904菌体)(即，TCI904样品浓度为0.5％(v/v))的方式，培养分化后脂
肪细胞，在37℃下培养24小时。

[0115] (4‑4)脂联素检测流程

[0116] 上述细胞培养后，将孔内培养液移至1.5ml微量离心管。于2‑8℃以1000xg离心15分钟，将离心后的上清液移至新的1.5ml微量离心管，接着将上清液稀释2000倍，接着以脂
联素检测试剂套组进行检测，操作方式如下。

[0117] 取100μl序列稀释标准品和测试样品(上清液)至检测盘孔中，用检测盘封盖封好，于37℃静置2小时。接着将孔内液体移除，不须冲洗。

[0118] 加入100μl 1倍生物素抗体，用新的检测盘封盖封好，于37℃静置1小时。将孔盘内液体移除，以200μl 1倍洗涤缓冲液润洗2次。清洗完后将孔内液体移除，并倒置于纸巾上去
除多余液体。

[0119] 加入100μl 1倍HRP亲和素，用新的检测盘封盖封好，于37℃静置1小时。将孔盘内液体移除，以200μl 1倍洗涤缓冲液润洗2次。清洗完后将孔内液体移除，并倒置于纸巾上去
除多余液体。

[0120] 加入90μl TMB液，于37℃避光反应15‑30分钟，接着加入50μl终止液，轻拍使其充分混和。以ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD548nm读值(O.D.值越大，表示脂联素的含量
越高)。最后使用Excel软体中的student t‑test进行统计分析。

[0121] 经过吸光值的比较换算并乘回稀释倍数，空白组所测得脂联素含量为2254.75ng/ml，控制组所测得脂联素含量为1974.02ng/ml，实验组所测得脂联素含量为2508.51ng/ml。

[0122] 请参阅图2。将空白组的脂联素含量为2254.75ng/ml视为1(即100％)时，控制组的脂联素的含量(1974.03ng/ml)为0.87(即87％)，实验组的脂联素的含量(2508.51ng/ml)为
1.11(即111％)，代表细胞经TCI904样品(TCI904的代谢产物，不含TCI904菌体)处理后，细
胞分泌脂联素的含量显著增加，为空白组的1.11倍。

[0123] 由此可知，当分化后脂肪细胞经TCI904样品处理后，脂联素的含量提升，代表TCI904能有效提升脂联素的含量，具有减脂的潜力。

[0124] 例5：保加利亚乳杆菌TCI904的人体实验

[0125] 为进一步确认保加利亚乳杆菌TCI904对于人体的影响，令9位受试者每日服用1颗8 8
保加利亚乳杆菌TCI904的活菌胶囊(每颗胶囊含有1X10CFU(即1X10 CFU/cap)菌数的保加
利亚乳杆菌TCI904)，并服用4周。其中，9位受试者的身高体重指数(BMI)大于24，或为体脂
高的族群(身体体脂率大于25％)。并且，每颗胶囊含有100毫克保加利亚乳杆菌TCI904的活
菌粉。

[0126] 于试验前(即未开始服用TCI904活菌胶囊前，视为第0周)及于试验后(即服用TCI904活菌胶囊4周后，视为第4周)分别进行体重、躯干体脂率、腰围、三酸甘油酯
(Triglyceride，TG)、极低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein，VLDL)、高密度脂
蛋白(High density lipoprotein，HDL)的检测，各项数值的量测方式如下所述。

[0127] 体重和躯干体脂率是利用体重体脂计(TANITA四肢与躯干体组成计，型号BC‑545F)进行检测，而腰围是以皮尺进行量测，详细来说，除去受试者腰部覆盖衣物，受试者保
持轻松站立，双手自然下垂，检测者将皮尺绕过受试者腰部，调整高度，以肚脐为水平量测
点，同时注意皮尺与地面保持平，并紧贴、不挤压皮肤，受试者维持正常呼吸。在吐气结束
时，量取腰围数值。

[0128] 三酸甘油酯、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的检测方式是对受试者进行静脉采血，并将血液样本送至检验所(立人医事检验所)测定三酸甘油脂、极低密度脂蛋白及高密
度脂蛋白的数值。

[0129] 需要特别说明的是，第0周的量测结果与第4周的量测结果的间的统计学显著差异是藉由Excel软体中的student t‑test来统计分析。

[0130] 请参阅图3。于试验前(即图3中第0周)，所有受试者的平均体重为86.3公斤，而在试验后(即图3第4周)，所有受试者的平均体重为85.7公斤。换言之，经过4周每日服用一颗
8
含有1X10 CFU的TCI904的活菌胶囊后，受试者的平均体重下降0.6公斤。基此，保加利亚乳
杆菌TCI904能降低体重。

[0131] 请参阅图4。于试验前(即图4的第0周)，所有受试者的平均躯干体脂率为36.9％，而在试验后(即图4的第4周)，所有受试者的平均躯干体脂率为36.3％。

[0132] 请参阅图5，于试验前(即图5的第0周)，所有受试者的平均腰围为99.9公分，而在试验后(即图5第4周)，所有受试者的平均腰围为98.2公分。

[0133] 换言之，经过4周每日服用一颗含有1X108 CFU的TCI904的活菌胶囊后，受试者的平均躯干体脂率下降0.6％，腰围平均减少1.7公分。基此，保加利亚乳杆菌TCI904能降低躯
干体脂率及腰围。

[0134] 因此，保加利亚乳杆菌TCI904具有降低体重、降低躯干体脂率及腰围的功效。

[0135] 三酸甘油酯，又叫中性脂肪，是人体内的一种脂肪，也存在许多食物中。人体摄取油脂、蛋白质或碳水化合物产生的热量，未被消耗掉的部份转变成三酸甘油酯，储存在肝脏
或脂肪细胞中，作为备用能量。热量过盛则增加三酸甘油酯，构成皮下脂肪主要成分，导致
肥胖或动脉硬化等疾病。

[0136] 请参阅图6，于试验前(即图6的第0周)，所有受试者的平均三酸甘油脂为113.8mg/dL，而在试验后(即图6的第4周)，所有受试者的平均三酸甘油脂为108.9mg/dL，相当于三酸
甘油脂降低了约4.3％。

[0137] 极低密度脂蛋白，主要成分为三酸甘油脂，于肝脏或小肠内合成。若食入大量的脂肪或醣类，则会增加极低密度脂蛋白的合成。低密度脂蛋白其主要的作用是将胆固醇由肝
脏带到周边组织。若血液中的低密度脂蛋白过高，容易造成冠状动脉硬化及心脏病。

[0138] 请参阅图7，于试验前(即图7的第0周)，所有受试者的平均极低密度脂蛋白为19.9mg/dL，而在试验后(即图7第4周)，所有受试者的平均极低密度脂蛋白为17.7mg/dL，相
当于极低密度脂蛋白降低了约11.0％。

[0139] 高密度脂蛋白主要的功能是将周边组织的胆固醇带回肝脏代谢。血液中高密度脂蛋白越高，罹患冠状动脉硬化及心脏病的机率越低。

[0140] 请参阅图8，于试验前(即图8的第0周)，所有受试者的平均高密度脂蛋白为53.2mg/dL，而在试验后(即图8第4周)，所有受试者的平均高密度脂蛋白为59.3mg/dL，相当
于高密度脂蛋白提升了约11.4％。

[0141] 换言之，经过4周每日服用一颗含有1X108 CFU的TCI904的活菌胶囊后，受试者的三酸甘油脂降低了约4.3％，极低密度脂蛋白降低了约11.0％，高密度脂蛋白提升了约
11.4％。基此，保加利亚乳杆菌TCI904能降低三酸甘油脂、极低密度脂蛋白以及提升高密度
脂蛋白。

[0142] 综上，透过例3可知，在试管模式中证实，保加利亚乳杆菌TCI904可抑制脂肪酶活性，且抑制程度明显多于其他保加利亚乳杆菌菌株。透过例4可知，保加利亚乳杆菌TCI904
有提升脂联素的能力。透过例5可知，保加利亚乳杆菌TCI904能降低体重、降低躯干体脂、降
低腰围、减少三酸甘油脂、减少极低密度脂蛋白、提升高密度脂蛋白。

[0143] 虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的
范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

[0144] 当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形
都应属于本发明权利要求的保护范围。

[0145] 【生物材料寄存】

[0146] DE德国德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche  Sammlung  von Mikroorganismen und Zellkulturen)2020/4/17寄存编号为DSM33505