一种抗干扰、稳定的血清直接胆红素（酶法）测定试剂盒及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种直接胆红素（DB）测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：磷酸盐缓冲液、NaCl、N‑乙酰半胱氨酸、氟化钠、乙二胺四乙酸二钠、抗坏血酸氧化酶、表面活性剂、防腐剂。试剂R2：三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液、胆红素氧化酶、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒采用不同种类的稳定剂和表面活性剂，可以有效避免血脂的干扰，是一种抗干扰能力强，灵敏度高，稳定性好，成本低的液体试剂盒。

权利要求

1.一种直接胆红素测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

磷酸缓冲液                           25mmol/L；

NaCl                                 1g/L；

N‑乙酰半胱氨酸                       1g /L；

氟化钠 0.1g /L；

乙二胺四乙酸二钠                      0.1g /L；

抗坏血酸氧化酶                        1KU/L；

失水山梨醇月桂酸酯                    1%；

聚氧丙烯甘露醇二油酸酯               1%；

proclin300                            1ml/L；

试剂R2中含有以下成分：

哌嗪‑1,4‑二乙磺酸缓冲液               50mmol/L；

牛血清白蛋白                          5g/L；

甘露醇                                10g/L；

曲拉通100                             1%；

胆红素氧化酶                          1KU/L；

proclin300                            1ml/L；

其中所述百分比为体积比；

所述试剂R1的pH为5.2，试剂R2的pH为9.0。

2.一种权利要求1所述的直接胆红素测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：试剂R1先加入磷酸盐缓冲液、R2先加入哌嗪‑1,4‑二乙磺酸缓冲液，再按照比例添加其他物质溶解，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1的pH值调节为5.2，试剂R2的pH调节为9.0，最后加入胆红素氧化酶，制成直接胆红素测定试剂盒。

3.一种权利要求1所述的直接胆红素测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中直接胆红素的浓度。

说明书

一种抗干扰、稳定的血清直接胆红素（酶法）测定试剂盒及其

制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种直接胆红素测定试剂盒，还涉及所述直接胆红素测定试剂盒制备方法和应用。

背景技术

[0002] 胆红素是胆色素的一种，是人胆汁中的主要色素。胆红素是体内铁卟啉化合物的主要代谢产物，有毒性，可对大脑和神经系统引起不可逆的损害，但也有抗氧化剂功能，可
以抑制亚油酸和磷脂的氧化。胆红素是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指
标。

[0003] 直接胆红素：间接胆红素偏高，直接胆红素偏高，说明肝细胞性黄疸，肝细胞受到损害，肝功能减退，肝脏不能完全将间接胆红素转化为直接胆红素，同时肝内胆管受压引起
了排泄障碍，直接胆红也不能完全排到胆道，同时有可能伴有急性黄疸型肝炎，慢性活动性
肝炎，肝硬化，肝癌等疾病。

[0004] 直接胆红素：说明是由阻塞性黄疸造成的。间接胆红素：说明可能是溶血性黄疸造成的，直接胆红素升高也可能会有输血时血型不合，贫血等原因。

[0005] 目前检测直接胆红素的方法主要有重氮法，钒酸盐发，氧化酶法。重氮盐法检测胆红素被临床实验室广泛采用，但该法易受许多因素的干扰、试剂无法长期稳定，在疾病诊断
中受到一定的影响。钒酸氧化法容易污染仪器，对别的测试产生影响。氧化酶法具有特异性
高，准确度高，但现有试剂盒存在抗干扰能力差，稳定性差，容易受血脂影响等缺点，本发明
针对现有直接胆红素试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明提供一种直接胆红素测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。

[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0008] 一种直接胆红素测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

[0009] 试剂R1中含有以下成分：

[0010] 缓冲液                                    20‑50mmol/L；

[0011] NaCl                                      1‑9g/L；

[0012] N‑乙酰半胱氨酸                            1g /L；

[0013] 氟化钠                                                      0.1g /L；

[0014] 乙二胺四乙酸二钠                          0.1g /L；

[0015] 抗坏血酸氧化酶                            1‑5KU/L；

[0016] 表面活性剂                                0.1%‑2%；

[0017] 防腐剂                                    0.5‑1 g/L；

[0018] 试剂R2中含有以下成分：

[0019] 缓冲液                                    20‑50mmol/L；

[0020] 稳定剂                                    10‑20g/L；

[0021] 胆红素氧化酶                              2‑6KU/L；

[0022] 表面活性剂                                0.1%‑2%；

[0023] 防腐剂                                    0.5‑1g/L；

[0024] 其中所述百分比为体积比。

[0025] 优选地，所述试剂R1的pH 为5.0‑5.5。

[0026] 优选地，所述试剂R2 的pH为8.5‑9.0。

[0027] 优选地，所述试剂 R1 和R2试剂中的表面活性剂选自失水山梨醇月桂酸酯、曲拉通x‑100、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯中的一种或多种。更优选地，试剂 R1中表面活性剂为失
水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，R2试剂中表面活性剂为曲拉通x‑100。

[0028] 优选地，所述试剂 R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮k30和甘露醇中的一种或多种。更优选地，稳定剂由牛血清白蛋白与甘露醇组成。

[0029] 优选地，所述试剂R1 和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种，更优选地，防腐剂为proclin300。

[0030] 优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。

[0031] 上述所述的直接胆红素测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1的pH值调节为5.0‑
5.5，试剂R2的pH调节为8.5‑9.0，再按照比例添加其他物质溶解，制成直接胆红素测定试剂
盒。

[0032] 本发明还公开了直接胆红素测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中直接胆红素的浓度。

[0033] 本发明试剂盒采用比色法，其反应原理为样本中的直接胆红素在 pH 为7.2的缓冲液中，在胆红素氧化酶（BOD）的作用下氧化成胆绿素，通过在450nm波长下测定此反应所
引起的吸光度变化可求得直接胆红素的含量。反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检
测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。

[0034] 有益效果

[0035] 1）本发明稳定的直接胆红素测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

[0036] 2）通过在试剂R2中加入牛血清白蛋白与甘露醇组成复合稳定剂，有效地提高了试剂中酶的稳定性，使试剂稳定性能优异，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

[0037] 3）添加失水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯共同作用，可以有效的去除血脂的干扰，大大增强试剂的抗干扰能力，一定程度的提高了试剂的稳定性。

[0038] 4）该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步推广。

附图说明

[0039] 图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线；

[0040] 图2为实施例1线性曲线；

[0041] 图3为实施例1和对比例1、2、3的直接胆红素测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。

具体实施方式

[0042] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

[0043] 本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用速率法进行测定，检测主波长为450nm，副波长为600nm操作如下：

[0044] 加入生理盐水、样本或校准品8µL，再加入225µL 的R1试剂，预孵育5min后再加入75µL的R2试剂，混匀，延迟1min，读取吸光度 A1，5min后读取吸光度A2，

[0045] 计算∆A=(A2‑A1)。

[0046] 直接胆红素含量（µmol/L）=（ΔA样本÷ΔA校准品）*校准品浓度。

[0047] 样本要求：

[0048] 1.不溶血血清，注意避光保存。

[0049] 2.样本稳定性：标本2 8℃保存可稳定3天，‑20℃保存可稳定2周。~

[0050] 实施例1

[0051] 一种常规的直接胆红素测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

[0052] 试剂R1中含有以下成分：

[0053] 磷酸缓冲液                                25mmol/L；

[0054] NaCl                                      1g/L；

[0055] N‑乙酰半胱氨酸                            1g /L；

[0056] 氟化钠                                                      0.1g /L；

[0057] 乙二胺四乙酸二钠                          0.1g /L；

[0058] 抗坏血酸氧化酶                            1KU/L；

[0059] 失水山梨醇月桂酸酯                        1%；

[0060] 聚氧丙烯甘露醇二油酸酯                    1%；

[0061] proclin300                                1 ml/L。

[0062] 试剂R1的pH值为5.2。

[0063] 试剂R2中含有以下成分：

[0064] 哌嗪‑1,4‑二乙磺酸(PIPES)缓冲液            50mmol/L；

[0065] 牛血清白蛋白（BSA）                       5g/L；

[0066] 甘露醇                                    10g/L；

[0067] 曲拉通100                                 1%；

[0068] 胆红素氧化酶                              1KU/L；

[0069] proclin300                                1ml/L。

[0070] 试剂R2的pH值为9.0。

[0071] 其中所述百分比为体积比。

[0072] 对比例1

[0073] 市售的进口Sigma直接胆红素测定试剂盒。

[0074] 对比例 2

[0075] 与实施例1中直接胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中稳定剂全部为牛血清白蛋白，牛血清白蛋白为10g/L；其它与实施例1相同。

[0076] 对比例 3

[0077] 与实施例1中直接胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中稳定剂全部为甘露醇，甘露醇为20g/L其它与实施例1相同。

[0078] 对比例 4

[0079] 与实施例1中直接胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有失水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，其它与实施例1相同。

[0080] 对比例5

[0081] 与实施例1中直接胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有失水山梨醇月桂酸酯，聚氧丙烯甘露醇二油酸酯为2%，其它与实施例1相同。

[0082] 对比例6

[0083] 与实施例1中直接胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，失水山梨醇月桂酸酯为2%，其它与实施例1相同。

[0084] 对比例7

[0085] 与实施例1中总胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有失水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，SDS为2%，其它与实施例1相同。

[0086] 对比例8

[0087] 与实施例1中总胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有失水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，三烷基氯化铵为2%，其它与实施例1相同。

[0088] 对比例9

[0089] 与实施例1中总胆红素测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有失水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，吐温80为2%，其它与实施例1相同。

[0090] 性能验证

[0091] 试验一

[0092] 相关性实验：实施例1、对比例1，同时检测了40个临床血清样本，对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以对比例1检测结果作为对照值，分别计算40对数据的相
对偏差（r）。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10%。

[0093] 检测结果如表1所示，并获得了实施例1和对比例1试剂的相关性曲线（如图1所示）。

[0094] 表1相关性对比实验结果

[0095] 样本号 实施例1（µmol/L） 对比例1（µmol/L） 实施例1与对比例1相对偏差1 2.44 2.49 ‑2.01%
2 0.28 0.27 3.70%
3 5.05 4.78 5.65%
4 6.54 6.20 5.48%
5 3.20 3.09 3.56%
6 1.77 1.79 ‑1.12%
7 8.73 8.51 2.57%
8 6.22 6.33 ‑1.74%
9 2.17 2.27 ‑4.41%
10 6.67 6.60 1.06%
11 2.63 2.52 4.37%
12 2.97 3.12 ‑4.81%
13 3.19 3.01 5.98%
14 2.89 2.82 2.48%
15 1.75 1.80 ‑2.78%
16 6.83 7.23 ‑5.53%
17 1.54 1.50 2.67%
18 6.07 6.08 ‑0.16%
19 3.11 3.21 ‑3.12%
20 5.99 6.18 ‑3.07%
21 7.69 7.56 1.72%
22 5.62 5.69 ‑1.23%
23 5.47 5.45 0.37%
24 8.98 8.90 0.90%
25 1.26 1.24 1.61%
26 0.82 0.85 ‑3.53%
27 2.07 1.95 6.15%
28 5.10 4.99 2.20%
29 8.96 9.11 ‑1.65%
30 3.61 3.42 5.56%
31 4.60 4.63 ‑0.65%
32 3.26 3.24 0.62%
33 2.14 2.17 ‑1.38%
34 1.32 1.40 ‑5.71%
35 0.55 0.54 1.85%
36 3.78 3.57 5.88%
37 4.71 4.67 0.86%
38 4.24 4.26 ‑0.47%
39 8.21 8.63 ‑4.87%
40 8.52 8.33 2.28%

[0096] 由表1和图1的可以看出，实施例 1 和对比例 1 的试剂盒血清测试低值偏差最大值为6.15%，两种试剂的相关系数为0.998，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本
发明提供的实施例1检测试剂与的进口检测试剂相关性良好，完全可以替代进口试剂，用于
临床检验。

[0097] 试验二

[0098] 精密度试验：实施例1和对比例1，对临床样品进行20次检测，计算20次检测结果平均值、标准差和变异系数。检测结果见表2。

[0099] 表2 精密度检测数据表

[0100] 测试次数 实施例1 （µmol/L） 对比例1 （µmol/L）1 13.83 13.83
2 13.90 14.06
3 14.30 14.53
4 13.99 13.84
5 14.07 14.02
6 14.13 13.72
7 14.03 14.55
8 14.03 14.06
9 14.05 14.55
10 13.87 13.90
11 13.82 14.12
12 13.90 14.07
13 13.76 13.71
14 13.99 13.37
15 14.00 14.19
16 14.09 13.71
17 14.12 13.47
18 13.99 13.63
19 14.03 13.58
20 13.92 13.95
平均值（X） 13.99 13.94
标准差（S） 0.13 0.34
变异系数（CV） 0.90% 2.43%

[0101] 由表2可以看出，实施例1、对比例1的检测数值标准偏差小，变异系数小，重复性较好，实施例1的变异系数0.90%小于对比例1变异系数2.43%，实施例1精密度较高，优于进口
试剂，实施例1试剂完全可以替代进口试剂。

[0102] 试验三

[0103] 线性实验：取直接胆红素高值样本为428µmol/L，并进行稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为428µmol/L 、214µmol/L、107µmol/L、53.5µmol/L、26.75µmol/L、0µmol/L浓度
的样本，用实施例1试剂进行检测，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。检
测结果如表3。

[0104] 表3线性相关验证实验检测数据表

[0105]理论浓度（µmol/L） 实施例1 （µmol/L）
0.00 0.00
26.75 26.30
53.50 53.07
107.00 105.87
214.00 208.53
428.00 426.60
相关系数r 0.999

[0106] 由表3和图2可以看出，本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化，线性相关系数达到0.999，大于0.990，符合标准要求，并且数值大于其他对照组。说明实施例1线性范围较好。
实施例1试剂较好的线性变化更能够符合临床病例样本的要求。

[0107] 试验四

[0108] 稳定性实验：对实施例1和对比例1、2、3提供的直接胆红素测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、3提供的试剂，每一例平行包含10组，一起放入37
℃恒温箱中存储，进行加速试验，每天检测靶值为9.80±0.5µmol/L的质控品，每组测试5
次，求平均值，并监测质控品测定值的变化，检测结果见表4。

[0109] 表4试剂热稳定性验证数据

[0110] 时间（天）实施例1试剂 µmol/L 对比例1试剂 µmol/L 对比例2试剂 µmol/L 对比例3试剂 µmol/L1 9.80 9.75 9.59 9.58
2 9.81 9.55 9.26 9.00
3 9.75 9.53 9.17 8.84
4 9.49 9.22 9.01 8.71
5 9.54 9.16 9.04 8.63
6 9.82 8.84 8.84 8.43
7 9.48 8.73 8.57 8.36
8 9.84 8.46 8.25 8.24
9 9.57 8.32 8.14 8.02
10 9.49 8.23 8.03 7.86

[0111] 由表4和图3可以看出，本发明提供的实施例1试剂在37℃条件下10天内基本无变化，稳定性较好；而对比例2，3试剂在10天内变化明显，两种稳定剂的实施例1优于单种稳定
剂的对比例2，3。实施例1的试剂盒稳定性优于对比实施例1、2、3试剂盒的稳定性，说明本发
明缓冲液和两种稳定剂的加入共同作用，显著提高直接胆红素测定试剂盒的稳定性。

[0112] 试验五

[0113] 干扰实验：取具有溯源性的质控物质，中值质控物（靶值9.80±0.5µmol/L），分别加入表格中脂肪乳的含量。然后分别用实施例1试剂，与对比例1试剂、对比例4试剂、对比例
5试剂、对比例6试剂同时对样本中直接胆红素的含量进行检测，分别测量5次求平均值，各
组的测定结果见表5。

[0114] 表5 试剂抗干扰验证结果

[0115]

[0116] 由表5可以看出，当脂肪乳为1mL/L时，实施例1试剂未受到明显干扰，对比例1、对比例4、对比例5、对比例6试剂受到一定的干扰，对比例4受到干扰较明显。当脂肪乳为4mL/L
时，实施例1试剂未受到明显干扰，对比例1、对比例4、对比例5、对比例6试剂受到显著的干
扰。实施例1与对比例4、对比例5、对比例6比较，包含两种组分的实施例1抗干扰能力更强。
对比例7、对比例8试剂说明，离子型表面活性剂对试剂抗血脂有显著效果，但是对试剂的准
确度有显著的干扰。非离子表面活性剂吐温80抗干扰能力明显差于实施例1的表面活性剂。
这说明通过加入失水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯成分后，两者协同作用使
实施例1试剂的抗干扰性能显著提高，优于对比例1试剂，满足临床要求。

[0117] 综上所述，该试剂盒采用失水山梨醇月桂酸酯和聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，不同的稳定剂和良好的缓冲液体系，是一种抗干扰性、稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的
液体试剂盒。为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上
竞争力。