一种用于对虾养殖水体调控的复合菌群转让专利
申请号 : CN202011335503.6
文献号 : CN112725217B
文献日 : 2022-03-15
发明人 : 单洪伟 , 雷柯柯 , 于鹏
申请人 : 中国海洋大学
摘要 :
本发明提供一种用于对虾养殖水体调控的复合菌群，其中包含有嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、鲁杰氏菌BD15‑5株和美丽盐单胞菌BD15‑8株；复合菌群中还包含有抑制对虾养殖过程中的常见弧菌的菌株。本发明在从对虾生物絮团养殖系统中筛选出对对虾安全，且具有高效降氮效果的菌株的基础上，将筛选的菌株进行复配获得了本发明的复合菌群，从而充分发挥菌株间的协同效果，提高对养殖水体的处理效果，并提高养殖对象的抗致病弧菌的能力。
权利要求 :
1.一种复合菌群，其特征在于，所述的复合菌群中包含有嗜碱盐单胞菌、鲁杰氏菌和美丽盐单胞菌；其中嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphlia)的保藏编号为CGMCC No.20971；
鲁杰氏菌(Ruegeria sp.)的保藏编号为CGMCC No.20973；美丽盐单胞菌(Halomonas venusta)的保藏编号为CGMCC No.20972。
2.如权利要求1所述的复合菌群，其特征在于，所述的复合菌群中还包含有抑制对虾养殖过程中的常见弧菌的菌株。
3.如权利要求2所述的复合菌群，其特征在于，所述的抑制对虾养殖过程中的常见弧菌的菌株，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BHK201801株,其保藏编号为CGMCC NO:17307。
4.一种养殖对虾的方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求1‑3任一项所述的复合菌群添加到养殖水体中。
5.权利要求1‑3任一项所述的复合菌群作为对虾饲料添加剂的应用。
6.一种对虾养殖用制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1‑3任一项所述的复合菌群。
7.一种对虾饲料，其特征在于，所述的饲料中添加有权利要求1‑3任一项所述的复合菌群。
说明书 :
一种用于对虾养殖水体调控的复合菌群
技术领域
[0001] 本发明属于益生菌筛选技术领域，具体涉及一种用于对虾养殖水体调控的复合菌群。
背景技术
[0002] 益生菌在养殖系统中定植并形成优势菌群是生物絮团发挥高效性能的关键。利用环境适应能力强并具有特定功能的菌株培育生物絮团，有助于提升絮团的稳定性和功效。
在生物絮团养殖模式下，外源添加益生菌能显著提升异育银鲫的消化酶活性，增加肠道肌
层厚度和黏膜下层厚度，促进异育银鲫生长。
在生物絮团养殖模式下，外源添加益生菌能显著提升异育银鲫的消化酶活性，增加肠道肌
层厚度和黏膜下层厚度，促进异育银鲫生长。
[0003] 外源益生菌常因不适合特定养殖环境难以定植形成优势菌群，而经筛选的具有特定功能土著益生菌更能适应当地的养殖环境，更容易定植并形成优势菌群。从海南热带海
洋分离的土著乳酸菌与现有市售某复合菌株产品拌料投喂凡纳滨对虾，土著乳酸菌能显著
提升凡纳滨对虾的增重率和成活率。
洋分离的土著乳酸菌与现有市售某复合菌株产品拌料投喂凡纳滨对虾，土著乳酸菌能显著
提升凡纳滨对虾的增重率和成活率。
[0004] 目前对于益生菌的研究主要集中在益生菌的益生作用及机制和益生菌作为生物工程中基因载体的潜能，而对益生菌安全性的关注相对较少。在水产养殖中被认为安全的
芽孢杆菌也存在引起水产动物腐皮病、败血症等病害的潜在风险。益生菌在使用过程中主
要存在致病性和感染能力、有害的代谢活动、过度的免疫反应和可能的基因转移等四个方
面的安全问题。通过安全性评价可以评估益生菌的使用风险，更加规范、安全地使用益生
菌，避免造成不可挽回的损失。目前，安全性评价尚没有统一的标准，主要包括益生菌的溶
血性、毒力因子、抗生素抗性和产有毒代谢产物检测的体外安全性评价和体内安全性评价
两方面。
芽孢杆菌也存在引起水产动物腐皮病、败血症等病害的潜在风险。益生菌在使用过程中主
要存在致病性和感染能力、有害的代谢活动、过度的免疫反应和可能的基因转移等四个方
面的安全问题。通过安全性评价可以评估益生菌的使用风险，更加规范、安全地使用益生
菌，避免造成不可挽回的损失。目前，安全性评价尚没有统一的标准，主要包括益生菌的溶
血性、毒力因子、抗生素抗性和产有毒代谢产物检测的体外安全性评价和体内安全性评价
两方面。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种用于对虾养殖水体调控的复合菌群，从而提高对虾养殖时水体处理的效率，并提高对虾的免疫抵抗力。
[0006] 本发明所提供的复合菌群，其中包含有嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphlia)AC3‑2株、鲁杰氏菌(Ruegeria sp.)BD15‑5株和美丽盐单胞菌(Halomonas venusta)BD15‑8
株；
株；
[0007] 所述的嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphlia)AC3‑2株，于2020年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20971；保藏地
址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
[0008] 所述的鲁杰氏菌(Ruegeria sp.)BD15‑5菌株，于2020年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20973；保藏地址为北京市
朝阳区北辰西路1号院3号。
朝阳区北辰西路1号院3号。
[0009] 所述的美丽盐单胞菌(Halomonas venusta)BD15‑8菌株，于2020年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20972；保藏地
址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0010] 更进一步的，所述的复合菌群中还包含有抑制对虾养殖过程中的常见弧菌的菌株；
[0011] 作为一个实施例的具体记载，所述的抑制对虾养殖过程中的常见弧菌的菌株，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号
院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏
编号为CGMCC NO:17307；
院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏
编号为CGMCC NO:17307；
[0012] 本发明还提供一种养殖对虾的方法，所述的方法是将复合菌群添加到养殖水体中。
[0013] 本发明另一个方面还提供复合菌群作为对虾饲料添加剂的应用。
[0014] 本发明再一个方面提供一种对虾养殖用制品，所述的制品中包含有上述的复合菌群。
[0015] 本发明在从对虾生物絮团养殖系统中筛选出对对虾安全，且具有高效降氮效果的菌株的基础上，将筛选的菌株进行复配获得了本发明的复合菌群，从而充分发挥菌株间的
协同效果，提高对养殖水体的处理效果，并提高养殖对象的抗致病弧菌的能力。
协同效果，提高对养殖水体的处理效果，并提高养殖对象的抗致病弧菌的能力。
附图说明
[0016] 图1：基于16S rDNA序列的系统发育树图；
[0017] 图2：三株菌在LB固体培养基上的菌落形态图；
[0018] 图3碳源对菌株AC3‑2(3A)和菌株BD15‑8(3B)的NO2‑‑N和BD15‑5(3C)的TAN去除效果的影响图，其中Glucose:葡萄糖；Sucrose蔗糖；Sodium acetate乙酸钠；Sodium
citrate:柠檬酸钠；
citrate:柠檬酸钠；
[0019] 图4：碳氮比对菌株AC3‑2(4A)、BD15‑8(4A)和BD15‑5(4B)降氮效果的影响图；
[0020] 图5：盐度对菌株AC3‑2(5A)、BD15‑8(5A)和BD15‑5(5B)降氮效果的影响图；
[0021] 图6：pH对菌株AC3‑2(6A)、BD15‑8(6A)和BD15‑5(6B)降氮效果的影响图；
[0022] 图7：不同菌株的溶血现象图；
[0023] 图8：注射感染实验中凡纳滨对虾的存活率图。
具体实施方式
[0024] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
[0025] 实施例1：筛选嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、鲁杰氏菌BD15‑5株和美丽盐单胞菌BD15‑8
[0026] 1)筛选样品来源与筛选用培养基
[0027] 2017年9月于威海文登泰裕水产良种繁育有限公司培养获得的对虾生物絮团养殖系统进行采样分析(盐度为30‰)，该生物絮团是以甘蔗渣、稻壳粉和芽孢杆菌为元件，通过
养殖系统中的絮团发生装置培育形成的，能有效提供养殖对虾的水体处理效果，并且对虾
不会产生应激反应。
养殖系统中的絮团发生装置培育形成的，能有效提供养殖对虾的水体处理效果，并且对虾
不会产生应激反应。
[0028] 在无菌状态下，取0.2mL涂布于固体LB平板上，4℃保存，带回实验室。
[0029] 筛选过程中使用的培养基的组分配比如下：
[0030] 富集培养基：NaNO2 1g，CH3COONa 4.8g，过滤海水1L，pH 7.5；
[0031] 筛选培养基：NaNO2 1g，CH3COONa 4.8g，过滤海水1L，琼脂15g，pH 7.5；
[0032] 测试培养基A：NaNO2 0.3g，C6H1206 0.225g，KH2PO4 0.05g,Na2HPO4 0.5g,MgSO4 0.2g,蒸馏水1L，PH 7.5；
[0033] 测试培养基B：NH4Cl 1g，CH3COONa 4.8g，过滤海水1L，pH 7.5；
[0034] LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠30g，纯水1L；
[0035] LB固体培养基：在液体培养基的基础上加15g琼脂粉。
[0036] 2)高效降解菌的筛选与鉴定
[0037] 富集：用无菌海水冲刷LB固体培养基上的菌苔形成菌液，然后按5％的比例接种到富集液体培养基中，以没有接菌的培养基作为对照，于恒温振荡培养箱(28℃,180r/min)中
培养24h，取5mL菌液离心(8000r/min,10min)，检测上清液的亚硝态氮浓度；然后选取亚硝
态氮降解程度较大的菌液以10％的比例转接至空白液体培养基中，于恒温振荡培养箱(28
℃,180r/min)中培养24h，连续转接三次以淘汰非目标菌。
培养24h，取5mL菌液离心(8000r/min,10min)，检测上清液的亚硝态氮浓度；然后选取亚硝
态氮降解程度较大的菌液以10％的比例转接至空白液体培养基中，于恒温振荡培养箱(28
℃,180r/min)中培养24h，连续转接三次以淘汰非目标菌。
[0038] 分离纯化：将所得的菌液稀释至10‑3，取10‑2和10‑3的稀释菌液0.1mL涂布于LB固体平板，28℃培养24h。用无菌接种环从平板上挑选颜色、形状、大小和透明度不同的菌落,采
用平板划线法分离纯化,直至得到纯的单菌落。采用甘油保种法将菌种于‑80℃保存。
用平板划线法分离纯化,直至得到纯的单菌落。采用甘油保种法将菌种于‑80℃保存。
[0039] 复筛：将上述分离纯化得到的菌株接种至LB液体培养基(28℃,180r/min)中培养24h，离心(8000r/min,10min)，弃上清，生理盐水重悬，重复3次，制备一定浓度的菌悬液。将
菌悬液按5％比例接种至测试培养基(28℃,180r/min)培养24h，取样测定OD600，离心
(8000r/min,10min)后取上清测定亚硝态氮浓度，筛选降解性能较高的菌株供下一步研究。
菌悬液按5％比例接种至测试培养基(28℃,180r/min)培养24h，取样测定OD600，离心
(8000r/min,10min)后取上清测定亚硝态氮浓度，筛选降解性能较高的菌株供下一步研究。
[0040] 3)筛选菌株的降氮性能
[0041] 分别以TAN(10mg/L)、NO2‑‑N(10mg/L)和TAN+NO2‑‑N(5+5mg/L)替代测试培养基中‑
的NO2‑N，检测复筛所得的高效降氮菌的降氮特性。
的NO2‑N，检测复筛所得的高效降氮菌的降氮特性。
[0042] 初步分离纯化得到109株菌，然后挑选生长优势明显、菌落差异较大的菌株以亚硝态氮和氨态氮作为唯一氮源进行复筛。
[0043] 在以亚硝态氮为唯一氮源时，菌株亚硝态氮降解的效果是BD15‑5>AC3‑2>14a>BD15‑8>2b>BD15‑1。以氨态氮和亚硝态氮为混合氮源时，菌株亚硝态氮降解率：BD15‑5＝
14a>BD15‑8>AC3‑2>2b>BD15‑1。在综合考虑总氮去除率、菌株生长以及安全因素，最终选择
AC3‑2、BD15‑5和BD15‑8作为后续研究的菌株。
14a>BD15‑8>AC3‑2>2b>BD15‑1。在综合考虑总氮去除率、菌株生长以及安全因素，最终选择
AC3‑2、BD15‑5和BD15‑8作为后续研究的菌株。
[0044] 表1菌株对不同氮源的利用效果表
[0045]
[0046] 4)菌株分子生物学鉴定
[0047] 将菌株送至上海生工生物工程技术有限公司进行16S rDNA的提取及鉴定，鉴定结果通过NCBI序列比对，然后用mega 5根据邻接法构建进化树。
[0048] 根据16S rDNA测序及系统发育分析(图1)，菌株AC3‑2与嗜碱盐单胞菌属菌株具有最高的相似度，菌株BD15‑5与鲁杰氏菌具有最高的相似度，菌株BD15‑8与美丽盐单胞菌具
有最高的相似度。因此将AC3‑2为命名为嗜碱盐单胞菌AC3‑2株，BD15‑5命名为为鲁杰氏菌
BD15‑5，BD15‑8命名为美丽盐单胞菌BD15‑8。
有最高的相似度。因此将AC3‑2为命名为嗜碱盐单胞菌AC3‑2株，BD15‑5命名为为鲁杰氏菌
BD15‑5，BD15‑8命名为美丽盐单胞菌BD15‑8。
[0049] 实施例2：菌株的理化性质
[0050] 菌株AC3‑2革兰氏染色阴性、无芽孢的杆状，菌体梭形，直或弯曲。LB固体培养基在28℃的恒温培养箱中培养24h后，菌落的表观特为：菌落呈较小的圆形，乳黄色不透明，边缘
整齐，表面光滑(图2)菌株的生长温度范围为20240℃，最适温度为37℃；生长pH范围为729，
最适pH为8；生长盐度范围为10240，最适盐度范围为20240。
整齐，表面光滑(图2)菌株的生长温度范围为20240℃，最适温度为37℃；生长pH范围为729，
最适pH为8；生长盐度范围为10240，最适盐度范围为20240。
[0051] 菌株BD15‑8革兰氏染色阴性、无芽孢的杆状，菌体梭形，直或弯曲。LB固体培养基在28℃的恒温培养箱中培养24h后，菌落的表观特为：菌落呈圆形，中央隆起，边缘整齐，表
面光滑，乳黄色不透明(图2)。菌株的生长温度范围为22242℃，最适温度为37℃；生长pH范
围为729，最适pH为8；生长盐度范围为10240，最适盐度范围为20240。
面光滑，乳黄色不透明(图2)。菌株的生长温度范围为22242℃，最适温度为37℃；生长pH范
围为729，最适pH为8；生长盐度范围为10240，最适盐度范围为20240。
[0052] 菌株BD15‑5用LB固体培养基在28℃的恒温培养箱中培养24h后，菌落的表观特为：菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，乳黄色半透明(图2)。菌株的生长温度范围为20240℃，最
适温度为30℃；生长pH范围为729，最适pH为8；生长盐度范围为10240，最适盐度范围为
20230。
适温度为30℃；生长pH范围为729，最适pH为8；生长盐度范围为10240，最适盐度范围为
20230。
[0053] 实施例3：三个菌株的降氮性能
[0054] 1)碳源对菌株生长和降解性能的影响
[0055] AC3‑2和BD15‑8菌株均能以葡萄糖、蔗糖、乙酸钠和柠檬酸钠为唯一碳源进行生长，以乙酸钠为唯一碳源时，菌株AC3‑2和BD15‑8的OD600值较高，以柠檬酸钠为唯一碳源时
菌株AC3‑2和BD15‑8亚硝态氮去除率最高(均为100％)，总氮去除率最高，且无硝态氮和总
氨态氮积累(图3A和图3B)。
菌株AC3‑2和BD15‑8亚硝态氮去除率最高(均为100％)，总氮去除率最高，且无硝态氮和总
氨态氮积累(图3A和图3B)。
[0056] 菌株BD15‑5分别以蔗糖和柠檬酸钠为唯一碳源时，总氨态氮去除率为84.6％和83.1％，总氮去除率为65.4％和63.7％；而以蔗糖为唯一碳源时，羟胺的积累量仅为0.7mg/
L(图3C)。因此，蔗糖为菌株BD15‑5的最适碳源。
L(图3C)。因此，蔗糖为菌株BD15‑5的最适碳源。
[0057] 2)碳氮比对菌株生长和降氮性能的影响
[0058] 碳氮比在5230范围内，菌株AC3‑2和菌株BD15‑8的生长均先升高后下降，在碳氮比为20时达到最大值；菌株AC3‑2和菌株BD15‑8的亚硝态氮去除率先升高后维持稳定，在碳氮
比升至15时达到最佳亚硝态氮去除效果。当碳氮比小于15时，菌株AC3‑2的生长效果和亚硝
酸盐去除率均强于菌株BD15‑8(图4A)。
比升至15时达到最佳亚硝态氮去除效果。当碳氮比小于15时，菌株AC3‑2的生长效果和亚硝
酸盐去除率均强于菌株BD15‑8(图4A)。
[0059] BD15‑5对总氨态氮的去除率和OD值随碳氮比的升高而显著升高，当C/N≥20时，BD15‑5对总氨态氮的去除率和OD值达到最大值(图4B)。
[0060] 3)盐度对菌株生长和降氮性能的影响
[0061] 盐度在0240‰范围内，菌株AC3‑2的OD值和亚硝态氮去除率均随盐度的升高而先升高后趋于平缓，当盐度高于20‰时亚硝态氮去除率达到最大值，当盐度高于30‰时OD达
到最大值(图5)。
到最大值(图5)。
[0062] 菌株BD15‑8的OD值和亚硝态氮去除率均随盐度的升高而升高，当盐度高于10‰时亚硝态氮去除率达到最大值，当盐度高于20‰时OD达到最大值(图5A)。菌株BD15‑8对低盐
的适应能力强于菌株AC3‑2。
的适应能力强于菌株AC3‑2。
[0063] BD15‑5对总氨态氮的去除率和OD值随盐度的升高呈先升高后下降趋势，当盐度为30‰时，BD15‑5对总氨态氮的去除率和OD值均达到最大值(图5B)。BD15‑5在盐度为20‰条
件下总氨态氮的去除率和OD值显著高于盐度为40‰，表明菌株对低盐的耐受性高于高盐。
件下总氨态氮的去除率和OD值显著高于盐度为40‰，表明菌株对低盐的耐受性高于高盐。
[0064] 4)pH对菌株生长和降氮性能的影响
[0065] 菌株AC3‑2和BD15‑8在初始pH为8时，亚硝态氮去除率分别为99％和96.8％(图6A)。菌株AC3‑2对碱性环境的适应能力强于菌株BD15‑8；而菌株BD15‑8对酸性环境的适应
能力强于菌株AC3‑2。
能力强于菌株AC3‑2。
[0066] BD15‑5在pH为8时，总氨态氮的去除率和OD值均达到最大值；且pH大于8时的菌株的生长量和总氨态氮降解率显著大于pH小于8菌株的生长量和总氨态氮降解率(图6B)。
[0067] 综上，本发明筛选的菌株AC3‑2以乙酸钠为碳源时，生长量和亚硝态氮降解率均比葡萄糖和蔗糖为碳源时高。菌株AC3‑2以柠檬酸钠为碳源时，亚硝态氮和总氮去除率最高，
且无硝态氮和总氨态氮积累。菌株AC3‑2的生长量和亚硝态氮降解率随碳氮比而升高，在碳
氮比为20时生长最好；在碳氮比为15时即达到最佳亚硝态氮去除效果，不随碳氮比的升高
而下降；表明菌株AC3‑2对高C/N的耐受性强。盐度为10时，AC3‑2菌株亚硝态氮(10mg/L,
24h)降解率达95％，且盐度为20240时，盐度对降解率没有影响；说明菌株AC3‑2的适盐范围
较广。
且无硝态氮和总氨态氮积累。菌株AC3‑2的生长量和亚硝态氮降解率随碳氮比而升高，在碳
氮比为20时生长最好；在碳氮比为15时即达到最佳亚硝态氮去除效果，不随碳氮比的升高
而下降；表明菌株AC3‑2对高C/N的耐受性强。盐度为10时，AC3‑2菌株亚硝态氮(10mg/L,
24h)降解率达95％，且盐度为20240时，盐度对降解率没有影响；说明菌株AC3‑2的适盐范围
较广。
[0068] 以蔗糖或柠檬酸钠为碳源时，菌株BD15‑5的总氨态氮和总氮去除率显著比葡萄糖和乙酸钠为碳源时高。BD15‑5在碳氮比为20时，总氨态氮的去除率和OD值达到最大值并不
随碳氮比的升高而继续增加；说明菌株BD15‑5对高C/N的耐受性强。
随碳氮比的升高而继续增加；说明菌株BD15‑5对高C/N的耐受性强。
[0069] 菌株BD15‑8以乙酸钠为碳源时，生长量和亚硝态氮降解率均比葡萄糖和蔗糖为碳源时高。菌株BD15‑8以柠檬酸钠为碳源时，亚硝态氮和总氮去除率最高，且无硝态氮和总氨
态氮积累。
态氮积累。
[0070] 菌株BD15‑8的生长量和亚硝态氮降解率随碳氮比而升高，在碳氮比为20时生长最好；在碳氮比为15时即达到最佳亚硝态氮去除效果，不随碳氮比的升高而下降；表明菌株
BD15‑8对高C/N的耐受性强。
BD15‑8对高C/N的耐受性强。
[0071] 菌株BD15‑8在盐度10240时，亚硝态氮(10mg/L,24h)降解率均达98％以上，说明菌株BD15‑8的适盐范围较广。
[0072] 因此，在对虾生物絮团养殖系统中筛选到的三株菌株在水产养殖水质调控中具有较大的巨大潜力。
[0073] 实施例4：菌株的安全性评价
[0074] 1)实验材料
[0075] 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)购于山东乳山对虾养殖场体长为(5.0±0.2)cm，平均体重(1.55±0.16)g。将对虾暂养于室内，水温26℃，盐度26，持续充气，早晚各
投喂1次，每天吸残饵粪便，换水1/3。暂养15d后开始实验。
投喂1次，每天吸残饵粪便，换水1/3。暂养15d后开始实验。
[0076] 试验菌株：AC3‑2、BD15‑5和BD15‑8
[0077] 副溶血弧菌由中国海洋大学病害与免疫实验室提供。
[0078] 血琼脂培养基(BZW12005)购于贝瑞特生物技术(郑州)责任有限公司，抗菌药物药敏纸片(S1099)购于杭州微生物试剂有限公司。
[0079] 注射感染实验在水族箱(规格为长21cm×宽31cm×高19cm)中进行，水体积大约为10.4L。
[0080] 实验数据用平均值±标准差(mean±SD)表示，通过SPSS 22软件对实验数据进行统计分析，采用单因子方差分析(One‑way ANOVA)和Duncan多重比较法进行差异显著性分
析，取P<0.05为差异显著。
析，取P<0.05为差异显著。
[0081] 2)溶血性实验
[0082] 将实验菌株活化后接种至LB液体培养基，在恒温震荡培养箱(28℃、180r/min)中8
培养24h(菌液浓度约为10CFU/mL)；然后将菌液点种(10μL)在血平板上，每株菌在同一个
血平板上点种3次(即3个平行)，在恒温培养箱(30℃)中培养24h，观察是否有溶血现象产
生。以副溶血弧菌作为阳性对照。
培养24h(菌液浓度约为10CFU/mL)；然后将菌液点种(10μL)在血平板上，每株菌在同一个
血平板上点种3次(即3个平行)，在恒温培养箱(30℃)中培养24h，观察是否有溶血现象产
生。以副溶血弧菌作为阳性对照。
[0083] 菌株溶血实验结果如图7所示，副溶血弧菌组血平板上的滤纸片周围有草绿色圆环，为α溶血；而AC3‑2组、BD15‑8组和BD15‑5组血平板上的滤纸片周围没有圆环，为γ溶血。
结果表明，嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株和鲁杰氏菌BD15‑5株不产生溶血
素，对养殖动物相对安全。
结果表明，嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株和鲁杰氏菌BD15‑5株不产生溶血
素，对养殖动物相对安全。
[0084] 3)抗生素敏感性实验
[0085] 菌株药敏实验结果如表2所示，美丽盐单胞菌AC3‑2株对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑林、头孢呋辛、头孢拉定、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、呋喃吡酮、多粘菌素
B、哌拉西林等12种抗生素敏感；对麦迪霉素、青霉素、头孢氨苄、羧苄西林等4种抗生素中度
敏感；对苯唑西林、氨苄西林、复方新诺明、万古霉素等4种抗生素耐药。嗜碱盐单胞菌BD15‑
8株对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑林、头孢呋辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、
呋喃吡酮、多粘菌素B、复方新诺明敏感等11种抗生素敏感，对麦迪霉素1种抗生素中度敏
感；对头孢拉定、青霉素、万古霉素、头孢氨苄、羧苄西林、氨苄西林、哌拉西林、苯唑西林8种
抗生素耐药。鲁杰氏菌BD15‑5株对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、头孢曲松、头孢他啶、头
孢呋辛、苯唑西林、哌拉西林、羧苄西林、多粘菌素B、复方新诺明、万古霉素等12种抗生素敏
感；对头孢哌酮、头孢唑林、头孢氨苄、氨苄西林、呋喃吡酮、青霉素、麦迪霉素等7种抗生素
中度敏感；对头孢拉定等1种抗生素耐药。
B、哌拉西林等12种抗生素敏感；对麦迪霉素、青霉素、头孢氨苄、羧苄西林等4种抗生素中度
敏感；对苯唑西林、氨苄西林、复方新诺明、万古霉素等4种抗生素耐药。嗜碱盐单胞菌BD15‑
8株对头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑林、头孢呋辛、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、
呋喃吡酮、多粘菌素B、复方新诺明敏感等11种抗生素敏感，对麦迪霉素1种抗生素中度敏
感；对头孢拉定、青霉素、万古霉素、头孢氨苄、羧苄西林、氨苄西林、哌拉西林、苯唑西林8种
抗生素耐药。鲁杰氏菌BD15‑5株对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、头孢曲松、头孢他啶、头
孢呋辛、苯唑西林、哌拉西林、羧苄西林、多粘菌素B、复方新诺明、万古霉素等12种抗生素敏
感；对头孢哌酮、头孢唑林、头孢氨苄、氨苄西林、呋喃吡酮、青霉素、麦迪霉素等7种抗生素
中度敏感；对头孢拉定等1种抗生素耐药。
[0086] 表2：不同菌株的药敏实验结果
[0087]
[0088] 注：R为耐药，I为中度敏感，S为敏感。
[0089] 4)注射感染实验
[0090] 注射感染实验各组对虾存活率如图8所示，AC3‑2组、BD15‑8组和BD15‑5组与生理盐水组的对虾存活率无显著性差异(P>0.05)，均显著高副溶血弧菌组(P<0.05)。由此可见，
向对虾体内注射107CFU/mL浓度的嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株和鲁杰氏
菌BD15‑5株菌体对对虾没有产生毒害作用。
向对虾体内注射107CFU/mL浓度的嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株和鲁杰氏
菌BD15‑5株菌体对对虾没有产生毒害作用。
[0091] 综合溶血性实验、抗生素敏感性实验和注射感染对虾实验结果，嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株和鲁杰氏菌BD15‑5株对凡纳滨对虾不具有致病性，可以在
凡纳滨对虾养殖生产中应用。
凡纳滨对虾养殖生产中应用。
[0092] 实施例5：芽孢杆菌(Bacillus sp.)BHK201801株
[0093] 芽孢杆菌(Bacillus sp.)BHK201801株,于2019年3月6日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
中心，保藏编号为CGMCC NO:17307。
中心，保藏编号为CGMCC NO:17307。
[0094] 1)实验结果表明饲喂芽孢杆菌BHK201801株显著提高对虾生长：
[0095] 养殖50天后测量对虾体长和体重并计算特定生长率，结果表明，相对于对照组，饲喂芽孢杆菌BHK201801株使对虾体长增加3.1％，体重增加15.5％，特定生长率增加28.5％。
饲喂陆地源芽孢杆菌LD05的对虾的体长、体重等较对照组均有不同程度的降低。
饲喂陆地源芽孢杆菌LD05的对虾的体长、体重等较对照组均有不同程度的降低。
[0096] 2)芽孢杆菌BHK201801株利于对虾的成活：
[0097] 饲喂芽孢杆菌BHK201801株使对虾成活率较对照组提高25％，而饲喂陆地源的芽孢杆菌LD05使对虾成活率较对照组提高5％。
[0098] 3)芽孢杆菌BHK201801株可减少对虾应激反应：
[0099] 养殖过程中，饲喂芽孢杆菌的对虾未显示出明显的应激反应，而对照组和陆地源芽孢杆菌LD05组的部分对虾在养殖实验的前期，显示出了较明显的应激反应，包括触须及
尾扇发红，空肠空胃等，在养殖中期应激反应逐渐消失。
尾扇发红，空肠空胃等，在养殖中期应激反应逐渐消失。
[0100] 实施例6：制备复合菌群
[0101] 嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株、鲁杰氏菌BD15‑5株和BHK201801株来制备复合菌群。
[0102] 培养基(NO2‑‑N＝5mg/L，NH4+‑N＝5mg/L)：NaNO2 0.3g，NH4Cl 1g，C6H12O6 0.225g，过滤海水1L，pH 7.528.0。
[0103] 1)菌株相容性检测
[0104] 滤纸片法：取200μL菌悬液(1×108CFU/mL)在LB平板上涂抹均匀，然后在平板上等8
距离放置3个无菌滤纸片(Φ＝6mm)，滤纸片上分别点种50μL其他3种悬浮液(1×10 CFU/
mL)，静止30min，在恒温培养箱(30℃)中培养24h。观察滤纸片周围是否具有抑菌圈，若有抑
菌圈则表明2个菌株间不亲和，无抑菌圈则表明2个菌株亲和性较好。
距离放置3个无菌滤纸片(Φ＝6mm)，滤纸片上分别点种50μL其他3种悬浮液(1×10 CFU/
mL)，静止30min，在恒温培养箱(30℃)中培养24h。观察滤纸片周围是否具有抑菌圈，若有抑
菌圈则表明2个菌株间不亲和，无抑菌圈则表明2个菌株亲和性较好。
[0105] 十字交叉线法：用无菌接种环将A菌液(1×108CFU/mL)在LB固体培养基上画3条平8
行线，然后将B菌液(1×10CFU/mL)在同一固体培养基上画3条与A相交的平行线，在恒温培
养箱(30℃)中培养24h。观察交叉点两株菌生长状况，若交叉点两株菌菌落相互覆盖说明两
株菌之间无拮抗作用，否则存在拮抗作用。
行线，然后将B菌液(1×10CFU/mL)在同一固体培养基上画3条与A相交的平行线，在恒温培
养箱(30℃)中培养24h。观察交叉点两株菌生长状况，若交叉点两株菌菌落相互覆盖说明两
株菌之间无拮抗作用，否则存在拮抗作用。
[0106] 将嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株、鲁杰氏菌BD15‑5株和4 ‑
BHK201801株随机组合，按5％比例(接种浓度约10 CFU/mL)接种至海水培养基(NO2 ‑N＝
+
5mg/L,NH4‑N＝5mg/L)中，测定24h的降氮效率。
BHK201801株随机组合，按5％比例(接种浓度约10 CFU/mL)接种至海水培养基(NO2 ‑N＝
+
5mg/L,NH4‑N＝5mg/L)中，测定24h的降氮效率。
[0107] 实验数据用平均值±标准差(mean±SD)表示，通过SPSS 24软件对实验数据进行统计分析，采用单因子方差分析(One‑way ANOVA)和Duncan多重比较法进行差异显著性分
析，取P<0.05为差异显著。
析，取P<0.05为差异显著。
[0108] 滤纸片周围均没有抑菌圈，菌株间的交叉点上菌落相互覆盖，表明嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株、鲁杰氏菌BD15‑5株和BHK201801株之间的相容性较好，无
明显的拮抗作用。
明显的拮抗作用。
[0109] 2)制备复合菌群
[0110] 在本实施例记载的培养基中分别接种嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、美丽盐单胞菌BD15‑8株、鲁杰氏菌BD15‑5株和BHK201801株，在27℃培养12h后，按表3进行混合制成复合菌群，
比较不同菌株复合的降氮效果(见下表3)。
比较不同菌株复合的降氮效果(见下表3)。
[0111] 不同菌株组合的总氨态氮降解率均为90％以上，嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、鲁杰氏菌BD15‑5株、美丽盐单胞菌BD15‑8株和芽孢杆菌BHK201801株的亚硝态氮降解率分别为
30.9％,12.7％,31.2％和28.7％，均低于组合菌株的亚硝态氮降解率。四株菌1:1:1:1复合
的降解效果显著好于其他类型的复合，总氨态氮和亚硝态氮降解率分别为98.1％和
61.4％。
30.9％,12.7％,31.2％和28.7％，均低于组合菌株的亚硝态氮降解率。四株菌1:1:1:1复合
的降解效果显著好于其他类型的复合，总氨态氮和亚硝态氮降解率分别为98.1％和
61.4％。
[0112] 表3：菌株不同复合方式的降氮效果
[0113]
[0114] 海水对虾工厂化养殖中的应用表明，嗜碱盐单胞菌AC3‑2株、鲁杰氏菌BD15‑5株、美丽盐单胞菌BD15‑8株和芽孢杆菌BHK201801株按1:1:1:1比例复合后制成复合菌群(总细
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菌密度达到10210CFU/mL)，泼洒到养殖环境或培育生物絮团，能够维持养殖系统良好的水
质环境，将氨氮、亚硝态氮控制在安全范围(氨氮<0.2mg/L,亚硝态氮<0.1mg/L)，促进对虾
健康生长。
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菌密度达到10210CFU/mL)，泼洒到养殖环境或培育生物絮团，能够维持养殖系统良好的水
质环境，将氨氮、亚硝态氮控制在安全范围(氨氮<0.2mg/L,亚硝态氮<0.1mg/L)，促进对虾
健康生长。