重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法

摘要

本发明公开了一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，该重组大肠杆菌由重组质粒导入宿主大肠杆菌中得到，重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET‑28a(+)连接构建而成，AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。以该重组大肠杆菌为全细胞催化剂，催化底物橙皮素，生物合成香叶木素。该方法绿色高效，反应过程不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，成本低，安全性高，且易于大规模生产。

权利要求

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，所述重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET‑28a(+)连接构建而成，所述AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，所述AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

4.一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述方法包括先将权利要求1～3中任一项所述的重组大肠杆菌置于含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠的培养基中诱导蛋白表达，所述蛋白胨中含有血红蛋白，然后以橙皮素为催化底物，进行全细胞催化，生物合成香叶木素。

5.根据权利要求4所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述全细胞催化时，向催化体系中添加额外的α‑酮戊二酸，所述额外的α‑酮戊二酸在催化体系中的浓度为20mg/L～100mg/L。

6.根据权利要求4所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述全细胞催化时，向催化体系中添加硫酸亚铁，0mg/L＜所述硫酸亚铁在催化体系中的浓度≤200mg/L。

7.根据权利要求4～6中任一项所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述含酵母提取物、蛋白胨 和氯化钠的培养基为LB培养基或TB培养基。

8.根据权利要求4～6中任一项所述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，其特征在于，所述诱导蛋白表达时，诱导培养的温度为10℃～35℃；全细胞催化体系中，所述重组大肠杆菌的浓度为OD600＝0.4～1.2，底物为10mg/L～5000mg/L的橙皮素，催化反应的温度为15℃～35℃。

说明书

重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工技术领域，涉及一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，具体涉及一种重组大肠杆菌及利用重组大肠杆菌将橙皮素转化为香叶木素的高效生物合成方法。

背景技术

[0002] 香叶木素（Diosmetin）是一种从植物中分离出来的黄酮类化合物，其结构式如下：

[0003]

[0004] 香叶木素主要存在于柑橘、薄荷等植物中。游离的香叶木素在植物中含量较低，在薄荷中约为0.027%，在柑橘中约为0.016%。香叶木素在植物中主要以芸香糖苷‑地奥司明的形式存在，目前香叶木素和地奥司明作为增强静脉张力的血管保护药被大量用于临床治疗，仅地奥司明片这一种药品在国内经由药店零售的部分在2016年销售额就达到了一亿元以上，且以每年10%以上的速度持续增长。

[0005] 香叶木素现阶段的主要获取途径包括：①从植物中直接通过提取分离获得，但由于香叶木素及地奥司明在植物中含量极低，直接提取成本高、难度大，并没有被广泛使用。②现阶段实际生产中，地奥司明和香叶木素使用柑橘果实中含量较高的橙皮苷为原料，以吡啶为溶剂、以碘和溴为催化剂，在高热条件下脱氢获得，但该方法需要使用有毒试剂及大量有机溶剂，既不环保，也不安全。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种重组大肠杆菌，还提供一种绿色高效、可避免使用大量化学试剂、成本低、安全性高、可大规模生产的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

[0008] 一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，所述重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的编码基因与表达载体pET‑28a(+)连接构建而成，所述AnFNSⅠ为来源于欧白芷的黄酮合酶1，所述AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0009] 上述的重组大肠杆菌，优选的，编码所述AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0010] 上述的重组大肠杆菌，优选的，所述宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。所述重组大肠杆菌记为DE3/pAnFNSⅠ。

[0011] 作为一个总的技术构思，本发明还提供一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，所述方法包括先将所述的重组大肠杆菌置于含酵母提取物、蛋白胨和氯化钠的培养基中诱导蛋白表达，所述蛋白胨中含有血红蛋白，然后以橙皮素为催化底物，进行全细胞催化，生物合成香叶木素。

[0012] 上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述全细胞催化时，向催化体系中添加额外的α‑酮戊二酸，所述额外的α‑酮戊二酸在催化体系中的浓度为20mg/L～100mg/L。

[0013] 上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述全细胞催化时，向催化体系中添加硫酸亚铁，0mg/L＜所述硫酸亚铁在催化体系中的浓度≤200mg/L。

[0014] 上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述含酵母提取物、蛋白栋和氯化钠的培养基为LB培养基或TB培养基。

[0015] 上述的利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，优选的，所述诱导蛋白表达时，诱导培养的温度为10℃～35℃；全细胞催化体系中，所述重组大肠杆菌的浓度为OD600＝0.4～1.2，底物为10mg/L～5000mg/L的橙皮素，催化反应的温度为15℃～35℃。

[0016] 本发明中，来源于欧白芷的黄酮合酶1（Flavone synthase 1 from Angelica archangelica，AnFNSⅠ）经过密码子优化后，经由pET‑28a(+)质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，蛋白诱导表达后，以橙皮素（Hesperetin）作为底物，在重组大肠杆菌菌体内将橙皮素在α‑酮戊二酸和亚铁离子的帮助下合成香叶木素（Diosmetin），α‑酮戊二酸由重组大肠杆菌本身产生，亚铁离子来源于培养基，也可以额外增加α‑酮戊二酸和/或铁源。反应过程如下式（1）所示：

[0017]

[0018] 式（1）

[0019] 反应中二价铁离子在α‑酮戊二酸和分子氧的作用下先生成四价的高活性羰基铁合物，随后铁合物在酶的作用下与底物橙皮素进行反应，经过电子转移‑羟化‑消去最后得到终产物香叶木素，铁离子则被还原为二价。

[0020] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0021] 1、本发明筛选出来源于欧白芷的黄酮合酶1（AnFNSⅠ），经过密码子优化后与表达载体pET‑28a(+)连接构建成重组质粒，再导入宿主大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，通过重组大肠杆菌来催化橙皮素合成香叶木素。本发明的AnFNSⅠ与现有文献报道可能具有类似催化活性的酶相比具有以下优点：①与不同来源的黄酮合酶1(FNSⅠ)相比，AnFNSⅠ具有更好的催化活性；②与不同类型的黄酮合酶(即FNSⅡ)相比，AnFNSⅠ属于α‑酮戊二酸依赖型双加氧酶，可单独发挥作用，便于在工程菌中构建相应的反应体系，而FNSⅡ属于NADPH依赖型P450家族单加氧酶，需要和其他酶(如CPR)或真核生物细胞器协同才能发挥作用；③与同属于α‑酮戊二酸依赖型双加氧酶的黄酮醇合酶(FLS)相比，AnFNSⅠ催化橙皮素得到的反应产物主要为香叶木素，而FLS催化橙皮素得到的反应产物主要为未进行分子内消去的4‑O‑甲基花旗松素；④与未进行密码子优化的野生型AnFNSⅠ相比，本发明所给出的优化序列可以显著提高酶在大肠杆菌中的可溶表达。

[0022] 2、本发明通过合成生物学途径策略，将香叶木素在植物中的合成途径平移至微生物底盘中，构建具有香叶木素合成能力的工程菌，通过工程菌实现香叶木素的绿色、高效合成有助于解决现阶段香叶木素生产过程中高污染的问题。由于橙皮素在柑橘等植物中含量远高于香叶木素的含量、且橙皮素可以通过含量更高的橙皮苷通过水解获得，因此该方法是一种具有较大潜力的香叶木素生物合成方法，且反应过程不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，易于大规模生产。本发明创建的将低值化合物转化为香叶木素的生物合成方法，在较宽的底物浓度范围及反应条件下，均能有效合成香叶木素，与化学合成方法相比，该方法由于不需要使用大量有机溶剂或有毒化学试剂，在产品安全性及环保方面具有较大优势。

[0023] 3、本发明的香叶木素生物合成方法与现有香叶木素的合成方法对比，具有如下表1所示的优势：

[0024] 表1 本发明的香叶木素生物合成方法与现有香叶木素的合成方法对比表[0025]

附图说明

[0026] 图1为本发明实施例1和实施例2中表达载体pET‑28a(+)的结构图。

[0027] 图2为本发明实施例1中香叶木素标准品的质谱图。

[0028] 图3为本发明实施例1中重组菌种发酵液样品的质谱图。

[0029] 图4为本发明实施例1中香叶木素、橙皮素混合标准品的色谱图。

[0030] 图5为本发明实施例1中重组菌种发酵液样品的色谱图。

[0031] 图6为本发明实施例1中重组菌株转化合成香叶木素的时间曲线图。

[0032] 图7为本发明实施例2中重组菌株及对照菌株转化合成香叶木素的时间曲线图。

[0033] 图8为对比例1中密码子优化对AnFNSⅠ表达情况影响的电泳图，其中，优化1为对比例1密码子优化后的AnFNSⅠ，本优化为实施例2密码子优化后的AnFNSⅠ。

[0034] 图9为对比例1中密码子优化对AnFNSⅠ催化底物转化率影响图。

[0035] 图10为对比例2中四株重组大肠杆菌发酵液中橙皮素、香叶木素、4‑O‑甲基花旗松素的浓度图。

具体实施方式

[0036] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。单位mM：mmol/L。

[0037] 橙皮素、香叶木素标准品购自Sigma‑Aldrich（St. Louis, MO），分析纯橙皮素购自生工生物工程（上海）股份有限公司。酵母粉、胰蛋白胨、氯化钠、磷酸盐（NaH2PO4和Na2HPO4）购自北京索莱宝科技有限公司，来源于欧白芷Angelica archangelica的黄酮合酶１基因经过密码子优化后由生工生物工程（上海）有限公司合成。优化前后氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4，对应的DNA序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5。

[0038] LB培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，以50mM磷酸盐缓冲液PBS将pH调整至7.4，使用前121℃高压蒸汽灭菌15min。50mM磷酸盐缓冲液PBS：分别配置50mM的NaH2PO4和50mM的Na2HPO4，以NaH2PO4滴定Na2HPO4至不同的pH。

[0039] 全细胞转化的样品分析：将样品12000rpm离心2min，取上清，以甲醇稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过滤。样品分析使用Shimadzu LC‑MS/MS‑IT‑TOF，进样体积10μL，使用自动进样器进样。使用C18反向色谱柱(Thermo scientific, ODS‑2HYPERSIL, Dim.(mm)250×4.6, particle size 5μm)对样品进行分离。流动相A为水，流动相B为甲醇。使用梯度洗脱，
0min 10％B，3min 30％B，10min 55％B，维持该体积浓度至15min。流速为1mL/min。柱温：40℃。使用外检测器，λ＝254nm测定香叶木素。质谱分析使用负离子模式，以提取离子流(extracted ion chromatograms, EIC)m/z＝299.0623检测香叶木素。二级质谱MS/MS分析的前体分别为：香叶木素299.0623m/z，宽度设置为1Da。通过与标准品的保留时间、一级质谱、二级质谱图进行比对，确定目标物质。使用液相色谱图的峰面积对香叶木素进行定量分析。

[0040] 实施例1

[0041] 一种本发明的重组大肠杆菌，重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ的基因与表达载体pET‑28a(+)连接构建而成，密码子优化前AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0042] 本实施例中，编码密码子优化前AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码密码子优化后的AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0043] 本实施例中，宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌记为DE3/pAnFNSⅠ。

[0044] 本实施例的重组大肠杆菌的构建方法如下：

[0045] （1）AnFNSⅠ的编码基因经密码子优化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并通过双酶切克隆至pUC118，得到重组质粒pUAnFNSI。将pUAnFNSI导入扩增菌内，自我复制，然后重组质粒抽提出来，酶切下来，电泳回收，得到高浓度的目的基因序列溶液。

[0046] （2）pET‑28a(+)是包含Xba I、Nco I和Nhe I等多个酶切位点的表达载体，可以通过不同酶切位点组合策略构建不同的表达结构，pET‑28a(+)的结构如图1所示，DNA序列如SEQ ID NO.3所示，该载体用于异源表达黄酮合酶AnFNS。分别使用限制性内切酶Nco I/Xho I消化重组载体pUAnFNSI和表达载体pET‑28a(+)，使用琼脂糖凝胶电泳分离没切产物，并回收目的基因AnFNSI（1098bp）和表达载体pET‑28a(+) (5369 bp)。将AnFNS基因与表达载体pET‑28a(+)混合，使用T4连接酶在16℃条件下连接过夜，得到重组质粒pAnFNSI，将重组质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。通过菌落PCR验证阳性转化子，所用引物序列为SEQ ID NO .6和SEQ ID NO .7。将阳性转化子转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养后提取重组质粒pAnFNSⅠ并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板用以筛选阳性菌，构建异源表达AnFNSⅠ的工程菌DE3/pAnFNSⅠ。

[0047] 一种利用本实施例的重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，即全细胞转化方法，包括以下步骤：

[0048] （1）重组大肠杆菌的培养

[0049] 将平板划线分离的单菌落转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养。以1％(v/v)的接种量转接至装有25mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素。37℃、220rpm培养，大肠杆菌的浓度为OD600=0.7时，添加终浓度为0.2mM的IPTG以诱导AnFNSⅠ的表达，将三角瓶转移至18℃、220rpm，诱导培养
10h。将菌液收集到离心管中，4000rpm、4℃离心5min收集菌体。

[0050] （2）全细胞催化

[0051] 以25mL PBS洗涤收集的菌体，离心后重悬于等体积的PBS中。同时添加终浓度100 mg/L橙皮素作为底物进行反应，进行全细胞催化，反应温度为23℃，该反应在恒温摇床上进行。在不同的时间点取样进行分析。香叶木素质谱图如图2和图3所示，其中图2为香叶木素标准品，图3为重组菌种发酵液（产物溶液）样品。质谱主要相应峰如下表2所示。

[0052] 表２香叶木素标准品与重组菌种发酵液的质谱主要峰

[0053]

[0054] 由表2可见，有明显的香叶木素生成，负离子模式下其质荷比为299.0623，与标准品质谱结果及现有公开报道相符，并在重组菌种发酵液中检测到了中间产物（4‑O‑甲基花旗松素）的相应峰。香叶木素色谱图如图4和图5所示，其中图4为香叶木素、橙皮素混合标准品，图5为重组菌种发酵液样品，可见明显的香叶木素响应峰。通过香叶木素的产量对取样时间点作图，重组菌株转化香叶木素合成的时间曲线如图6所示，可以确定在转化6小时香叶木素产量趋于稳定，此时培养基中香叶木素浓度为42.22mg/L，底物转化率为42.48%。

[0055] 本实施例的步骤（2）中，还可以加入硫酸亚铁促进反应进行，0mg/L＜所述硫酸亚铁在催化体系中的浓度≤200mg/L，得到高产香叶木素。

[0056] 实施例2

[0057] 一种本发明的重组大肠杆菌，重组大肠杆菌由重组质粒pAnFNSⅠ导入宿主大肠杆菌中得到，重组质粒是由密码子优化后的AnFNSⅠ编码基因与表达载体pET‑28a(+)连接构建而成，密码子优化前黄酮合酶AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的黄酮合酶AnFNSⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0058] 本实施例中，编码密码子优化前黄酮合酶AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码密码子优化后的黄酮合酶AnFNSⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0059] 本实施例中，宿主大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

[0060] 本实施例的重组大肠杆菌的构建方法如下：

[0061] 分别使用限制性内切酶Nde I/Xho I消化重组载体pUAnFNSⅠ和表达载体pET‑28a(+)，使用琼脂糖凝胶电泳分离没切产物，并回收目的基因AnFNSⅠ（1098bp）和表达载体pET‑28a(+) (5369 bp)。将AnFNSⅠ基因与表达载体pET‑28a(+)混合，使用T4连接酶在18℃条件下连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。通过菌落PCR验证阳性转化子，所用引物序列为SEQ ID NO  .6/SEQ ID NO  .7。将阳性转化子转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养后提取重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB平板用以筛选阳性菌，构建异源表达欧白芷黄酮合酶AnFNSⅠ的工程菌。

[0062] 一种利用本实施例的重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，包括以下步骤：

[0063] 将平板划线分离的单菌落转接至含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm过夜培养。以1％(v/v)的接种量转接至装有25mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素。37℃、220rpm培养，大肠杆菌的浓度为OD600=0.8时，添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导AnFNSⅠ的表达，将三角瓶转移至16℃、220rpm，诱导培养
10h。将菌液收集到离心管中。直接向菌液中添加终浓度200 mg/L橙皮素作为底物进行反应，并加入终浓度为50 mg/L的α‑酮戊二酸促进反应进行，该反应在恒温摇床上进行，反应温度为23℃。在不同的时间点取样进行分析，使用不含有AnFNSⅠ的大肠杆菌BL21（DE3）菌株使用同样的反应方法作为对照。通过香叶木素的产量对取样时间点作图，重组菌株及对照菌株转化香叶木素合成的时间曲线如图7所示，可以确定重组菌株在转化7小时香叶木素产量趋于稳定，此时培养基中香叶木素浓度为107.56mg/L，底物转化率为54.13%，而作为对照的不含有AnFNSⅠ的大肠杆菌BL21(DE3)菌株不能在同样的条件下将橙皮素转化为香叶木素。

[0064] 对比例1

[0065] 一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，实施方案与实施例2基本相同，区别仅在于：AnFNSⅠ密码子优化不同。使用不同核苷酸序列构建的重组大肠杆菌经过IPTG诱导后，胞内可溶蛋白SDS‑PAGE结果见图8，香叶木素转化率见图9。图中未优化指使用野生型SEQ ID NO.1序列进行重组大肠杆菌构建，本优化（实施例2密码子优化后的AnFNSⅠ）为使用SEQ ID NO.4序列进行重组大肠杆菌构建。优化1（对比例1密码子优化后的AnFNSⅠ）所用于构建重组大肠杆菌的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。SDS‑PAGE和底物转化率结果显示，不进行密码子优化或优化策略不合适的情况下AnFNSⅠ不能在大肠杆菌中正常表达并催化底物转化，而采用本发明的密码子优化后大幅度提高了AnFNS的异源表达效率，使得该反应可以进行。

[0066] 对比例2

[0067] 一种利用重组大肠杆菌生物合成香叶木素的方法，实施方案与实施例1基本相同，区别仅在于：增加了其他类型可能催化该反应的酶进行对比，构建了以密码子优化后的茶树黄酮醇合酶(Flavonol synthase from Camellia sinensis, CaFLS，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)构建的重组大肠杆菌DE3/pCaFLS，以密码子优化后的黄芩黄酮合酶2(Flavone synthase 2 from Scutellaria baicalensis, ScFNSⅡ，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)构建的重组大肠杆菌DE3/pScFNSⅡ，以密码子优化后的满天星黄烷酮3‑羟化酶(flavanone‑3‑hydroxylase from Gypsophila paniculata, GyFHT，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)构建的重组大肠杆菌DE3/pGyFHT，与本发明的序列优化后欧白芷黄酮合酶1（核苷酸序列如SEQ ID NO.5）构建的重组大肠杆菌DE3/pAnFNSⅠ。发酵12h后，四株重组大肠杆菌发酵液中橙皮素、香叶木素、4‑O‑甲基花旗松素（为该反应中间产物）浓度如图10所示。相较于三株对比菌株，本发明的DE3/pAnFNSⅠ发酵液中香叶木素浓度最高，为39.06 mg/L。DE3/pCaFLS和GyFHT发酵液中主要产物为4‑O‑甲基花旗松素，香叶木素含量分别为1.97mg/L和0.15mg/L，DE3/pScFNSⅡ发酵液中未检测到香叶木素。

[0068] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。