一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP及其表达载体和应用

摘要

一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP及其表达载体和应用，属于基因工程技术领域。本发明包括：一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；一种含有菰黑粉菌内源强启动子pHSP的表达载体；及其在驱动eGFP基因的转录与表达，构建稳定表达系统和获得工程菰黑粉菌中的应用，提高了eGFP的表达强度和荧光稳定性。本发明通过菰黑粉菌内源pHSP启动子和强终止子nosT与eGFP基因相连，构建成了有效的质粒载体pUe‑cbx‑Hsp，提高了eGFP的表达强度，启动eGFP基因转录水平较otef，TFIID2分别增强超过9倍，11倍。

权利要求

1.一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP，其特征在于所述菰黑粉菌内源强启动子pHSP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述菰黑粉菌内源强启动子pHSP的制备方法，其特征在于包括以下步骤：采用CTAB法提取菰黑粉菌总DNA，经0.8%的琼脂糖电泳检测，提取的菰黑粉菌总DNA条带清晰，备用；以上述菰黑粉菌总DNA为模板，采用特异性引物Hs‑F、Hs‑R进行扩增，所述Hs‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，Hs‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，获得菰黑粉菌内源启动子pHSP。

3.一种含有如权利要求1所述的菰黑粉菌内源强启动子pHSP的表达载体。

4.如权利要求1所述的一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP在驱动eGFP基因的转录与表达，构建稳定表达系统和获得工程菰黑粉菌中的应用。

5.如权利要求1所述的一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP在提高eGFP的表达强度和荧光稳定性中的应用。

说明书

一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP及其表达载体和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP及其表达载体和应用。

背景技术

[0002] 菰黑粉菌是菰体内的一种重要的内生真菌，菰黑粉菌侵染茭白植株后，能够抑制其抽穗开花并诱导茎基部膨大，逐渐形成纺锤形的可食用的肉质茎，即“茭白”。茭白营养丰
富，不仅含有糖类、有机氮、脂肪、蛋白质、纤维、维生素，同时还具有较高的药用价值，具有
祛热、生津、止渴、除目黄、解酒毒等多种功效，因此其经济价值较高。

[0003] 目前菰黑粉菌与茭白植株互作机理不清，导致茭白的生产、品质调控及育种等全靠经验指导，出现了品种退化、产量不稳定、品质差异大等问题，因此对“茭白”产生过程中
植株与菰黑粉菌互作的分子机制研究迫在眉睫。其中，一个高效的基因表达系统是有效地
研究目标基因功能的基本保障。目前主要采用的是异源启动子Otef构建的表达系统，虽然
其驱动的eGFP蛋白能够在菰黑粉菌菌株内正常表达，但表达量不高，荧光性不稳定，因此需
要筛选出一个高效稳定表达的强启动子，为菰黑粉菌功能性基因研究及其与茭白互作机制
研究奠定基础。

发明内容

[0004] 针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP及其表达载体和应用。

[0005] 一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP，其特征在于所述菰黑粉菌内源强启动子pHSP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 一种所述菰黑粉菌内源强启动子pHSP的制备方法，其特征在于包括以下步骤：采用CTAB法提取菰黑粉菌总DNA，经0.8%的琼脂糖电泳检测，提取的菰黑粉菌总DNA条带清晰，
备用；以上述菰黑粉菌总DNA为模板，采用特异性引物Hs‑F、Hs‑R进行扩增，获得菰黑粉菌内
源启动子pHSP。

[0007] 所述的制备方法，其特征在于所述Hs‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，Hs‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0008] 一种含有所述的菰黑粉菌内源强启动子pHSP的表达载体。

[0009] 所述的表达载体，其特征在于所述表达载体是在菰黑粉菌内诱导表达eGFP基因的表达载体pUe‑cbx‑Hsp。

[0010] 一种所述的表达载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

[0011] 1）根据菰黑粉菌内源强启动子pHSP的序列，设计特异性引物H‑F和H‑R；

[0012] 2）以pUMa932质粒为模板，使用限制性内切酶KpnI和NcoI双酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳，使用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit对酶切大片段进行回收，待用；

[0013] 3）将菰黑粉菌内源pHSP克隆到pMD 19‑T载体上，经测序验证，获得pMD19‑pHSP载体，使用Vazyme高保真PCR酶Max Super‑Fidelity DNA Polymerase对上述pMD19‑pHSP载体
用步骤1）设计的引物H‑F和H‑R进行PCR扩增；

[0014] 4）采用无缝连接克隆试剂盒将步骤3）获得的PCR扩增产物与步骤2）获得的酶切大片段进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的
LB平板上筛选阳性转化子，扩大培养，用特异性引物hYZ‑F和hYZ‑R进行菌液PCR验证，经1％
琼脂糖凝胶电泳，电泳结果无误后测序，获得菰黑粉菌转化表达载体pUe‑cbx‑Hsp。

[0015] 所述的一种表达载体的制备方法，其特征在于所述引物H‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，引物H‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0016] 所述的一种表达载体的制备方法，其特征在于引物hYZ‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，引物hYZ‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0017] 所述的一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP在驱动eGFP基因的转录与表达，构建稳定表达系统和获得工程菰黑粉菌中的应用。

[0018] 所述的一种菰黑粉菌内源强启动子pHSP在提高eGFP的表达强度和荧光稳定性中的应用。

[0019] 所述的菰黑粉菌是本申请人于已授权专利号ZL201610058044.9中要求保护的一种菰黑粉菌单倍体菌株UET1，其保藏编号为CGMCC No.11843。

[0020] 本发明通过菰黑粉菌内源pHSP启动子与eGFP基因相连，构建成了有效的表达载体pUe‑cbx‑Hsp(在E.coli中用氨苄青霉素（amp）作为选择标记，在菰黑粉菌中用萎锈灵cbx作
为选择标记)，提高了eGFP的表达强度，启动eGFP基因转录水平较Otef和TFIID2启动子分别
增强超过9倍和11倍，为今后在分子生物学水平研究菰黑粉菌的基因功能提供基础材料。

附图说明

[0021] 图1为菰黑粉菌转化表达载体pUe‑cbx‑Hsp结构图；

[0022] 图2为荧光显微镜下观察筛选图；

[0023] 图3为白光显微镜下观察筛选；

[0024] 图4为合成光显微镜下观察筛选图；

[0025] 图5为qPCR的检测结果图；

[0026] 图6为荧光显微镜下各启动子表达eGFP观察图；

[0027] 图7为ImageJ软件测定荧光强度结果图。

具体实施方式

[0028] 以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0029] 以下实施例中所述的菰黑粉菌是本申请人于已授权专利号ZL 201610058044.9中要求保护的一种菰黑粉菌单倍体菌株UET1，其保藏编号为CGMCC No.11843。

[0030] 实施例1：菰黑粉菌内源pHSP启动子的克隆、测序

[0031] 采用CTAB法提取菰黑粉菌UET1菌株的总DNA模板，经0  .8％的琼脂糖电泳检测，提取的菰黑粉菌基因组DNA条带清晰完整，可以满足PCR扩增需要。用特异性引物Hs‑F:5’‑
CATCGGGCCGCATGGCTGAG‑3’（如SEQ ID NO.2所示）；Hs‑R:5’‑GATGACGATTCTAAGGCTGTTGC‑3’ 
（如SEQ ID NO.3所示）扩增获得pHSP全序列928bp（如SEQ ID NO.1所示），克隆到pMD 19‑T
载体上，并测序验证，获得含有菰黑粉菌pHSP序列的质粒pMD19‑pHSP。

[0032] 实施例2：菰黑粉菌内源pHSP启动子驱动eGFP基因在菰黑粉菌中表达

[0033] 1、构建菰黑粉菌内源pHSP启动子和强终止子nosT与eGFP基因相连的质粒载体

[0034] 根据实施例1获得的pHSP启动子序列，设计特异性引物H‑F：5’‑CGAAATTCGAGCTCGGTACCCATCGGGCCGCATGGCTGAG‑3’ （如SEQ ID NO.4所示），其中斜体字GGTACC是限制性内切
酶KpnI的识别位点；H‑R：5’‑CTCGCCCTTGCTCACCATGGGATGACGATTCTAAGGCTGTTGC‑3’ （如SEQ 
ID NO.5所示），其中斜体字CCATGG是限制性内切酶NcoI的识别位点。带下划线的正体字母
为无缝连接方式构建载体所需要的与载体末端同源的片段。

[0035] 以pUMa932质粒为模板，使用限制性酶切KpnI和NcoI对其双酶切，将启动子Otef切掉，经1％琼脂糖凝胶电泳，使用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit对酶切后的大片段进行回
收。

[0036] 以pMD19‑pHSP质粒为模板，使用Vazyme高保真PCR酶Max Super‑Fidelity DNA Polymerase用引物对H‑F，H‑R进行PCR扩增后回收目标条带。

[0037] 使用ClonExpress II One Step Cloning Kit C112无缝连接克隆试剂盒将获得的目标条带与酶切后的大片段进行连接。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株感受态
细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性转化子，阳性转化子扩大培养，并用特异性
引物对hYZ‑F：GAAC  TCGAGCAGCTGAAGCT（如SEQ  ID  NO.6所示）；hYZ‑R：
CGCTGAACTTGTGGCCGTTT（如SEQ ID NO.7所示）进行菌液PCR验证，经1％琼脂糖凝胶电泳，电
泳结果无误的质粒送测序公司测序。由此获得菰黑粉菌表达载体pUe‑cbx‑Hsp (见图1)。

[0038] 2、PEG介导转化菰黑粉菌原生质体获得转化子

[0039] 将构建好的pUe‑cbx‑Hsp载体用限制性内切酶NdeI线性化，用PEG介导转化至UET1菌株的原生质体中，在含10μg/mL萎锈灵的再生培养基上进行筛选，挑取转化子扩大培养，
并在荧光显微镜下观察筛选，在白光下如图2所示；在荧光下如图3所示；在合成光下如图4
所示。结果表明，菰黑粉菌内源启动子可以驱动eGFP基因的转录与表达，可用于稳定表达系
统的构建和工程菰黑粉菌的获得。

[0040] 实施例3：对菰黑粉菌内源启动子pHSP强弱及稳定性的评价

[0041] 1、eGFP表达量评价

[0042] 用生工公司的柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒对实施例2获得的转化子，以及目前菰黑粉菌所用的表达载体（异源启动子Otef和内源启动子TFIID2启动表达eGFP）转化菰黑
粉菌所得转化子，按说明书进行RNA抽提，所有操作均为RNase free操作，抽提完成使用紫
外分析测定所抽提RNA的浓度及质量，利用Vazyme公司的HiScript II Q RT SuperMix for 
qPCR（+gDNA wiper）试剂盒，根据试剂盒操作说明进行反转录，得到反转录产物，利用ChamQ 
Universal SYBR qPCR Master Mix进行检测，其中检测引物分别为：

[0043] eGFP的引物序列：

[0044] qF‑AACCGCATCGAGCTGAAG（如SEQ ID NO.8所示）；

[0045] qR‑ TGATGCCGTTCTTCTGCTTG（如SEQ ID NO.9所示）；

[0046] 内参基因（β‑actin）引物序列：

[0047] QF‑ CAATGGTTCGGGAATGTGC（如SEQ ID NO.10所示）；

[0048] QR‑GGGATACTTGAGCGTGAGGA（如SEQ ID NO.11所示）。

[0049] 采用2‑ΔCt对qPCR的检测结果进行分析，结果如图5所示，从结果可以看到野生型菌株中没有检测到eGFP的表达，经pHSP启动子启动的eGFP的表达量为19.25：经Otef启动子启
动的eGFP的表达量为2.01：经TFIID2启动子启动的eGFP的表达量为1.70：上述结果表明：
pHSP启动子提高了eGFP的表达量，启动eGFP基因转录水平较Otef，TFIID2分别增强超过9
倍，11倍。

[0050] 2、荧光强弱及稳定性评价

[0051] 将实施例2获得的转化子，以及目前菰黑粉菌所用的表达载体（异源启动子Otef和内源启动子TFIID2启动表达eGFP）转化菰黑粉菌所得转化子，用Leica DM6 B荧光显微镜在
相同的参数条件下进行拍照，结果如图6所示，并用ImageJ软件测定荧光强度，结果如图7所
示。从结果可以看到，经pHSP启动子启动表达的eGFP荧光100%表达，其eGFP的荧光强度范围
是36.79 42.14，平均强度为39.73；经Otef启动子启动表达eGFP荧光的细胞占总细胞的
~
84%，其eGFP的荧光强度范围是4.12 8.15，平均强度为6.15；经TFIID2启动子启动表达eGFP
~
荧光的细胞占总细胞的54%，其eGFP的荧光强度范围是2.24 4.17，平均强度为3.02。以上结
~
果表明：内源启动子pHSP提高了eGFP的表达强度，pHSP启动表达的eGFP荧光强度较Otef，
TFIID2启动表达的分别增强超过6倍，13倍，且内源启动子pHSP启动表达的eGFP荧光强度和
表达情况更为稳定。