基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用，所述引物探针组合物的靶基因位于乙肝病毒基因组的S区。本发明以乙肝病毒基因组的S区基因为靶点，设计特异性引物探针，基于所述引物探针构建的荧光定量PCR HBV RNA检测方法对于检测低病毒载量患者的血清HBV RNA具有灵敏准确的效果，基于该方法学实现了准确预测慢乙肝患者停药复发、肝癌发生和HBsAg转阴的效果，还可以评估和预测药物治疗效果、临床应用前景广阔。

权利要求

1.一种检测血清中乙肝病毒RNA的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物的靶基因位于乙肝病毒基因组的S区；

所述引物包括SEQ ID NO:2～9所示的核酸序列；

所述探针包括SEQ ID NO:10～13所示的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述靶基因包括乙肝病毒亚型A、B、C、D、E、F、G或H基因型的基因组S区。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述靶基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针包括TaqMan探针和/或杂交探针。

5.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。

6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、CYS、CY5、VIC、TET、JOE、HEX或ROX中的任意一种。

7.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL或Eclipse中的任意一种。

8.一种检测乙肝病毒RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1‑7任一项所述的引物探针组合物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液、dNTP混合液或PCR缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括DNA聚合酶和/或逆转录酶。

11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

2+

12.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液中含有Mg 。

13.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括含有乙肝病毒基因组S区的质粒。

15.一种检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述体系包括权利要求1‑7任一项所述的引物探针组合物。

16.根据权利要求15所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述引物探针组合物中的引物在所述体系中的终浓度为0.1～1pmol/μL。

17.根据权利要求15所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述引物探针组合物中的探针在所述体系中的终浓度为0.1～1pmol/μL。

18.根据权利要求15所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述体系还包括RNA

2+

模板、逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs和Mg 。

19.根据权利要求18所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述RNA模板在所述体系中的终浓度为10ng/μL～100μg/μL。

20.根据权利要求18所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述逆转录酶在所述体系中的终浓度为0.5～10U/μL。

21.根据权利要求18所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述DNA聚合酶在所述体系中的终浓度为0.005～0.05U/μL。

22.根据权利要求18所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述dNTPs在所述体系中的终浓度为20～200μmol/L。

2+

23.根据权利要求18所述的检测乙肝病毒RNA的体系，其特征在于，所述Mg 在所述体系中的终浓度为0.5～3.0mmol/L。

24.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测乙肝病毒RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

采用权利要求1‑7任一项所述的引物探针组合物、权利要求8‑14任一项所述的试剂盒或权利要求15‑23任一项所述的体系对RNA样本进行荧光定量PCR，检测乙肝病毒RNA的水平。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的条件为：

92～98℃预变性10～30s；

92～98℃变性10～20s，55～65℃退火40～60s，70～75℃延伸10～30s，共进行35～45个循环。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，在进行预变性之前，还包括45～55℃反转录5～8min的步骤。

27.权利要求1‑7任一项所述的引物探针组合物、权利要求8‑14任一项所述的试剂盒或权利要求15‑23任一项所述的体系在制备肝病诊断试剂、慢性乙肝抗病毒治疗的疗效评价和/或安全停药、治疗终点监测的乙肝病毒诊断试剂中的应用。

28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述肝病包括急慢性乙型肝炎、乙型肝炎相关肝衰竭、肝硬化或肝癌中的任意一种或至少两种的组合。

说明书

基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测的引物探针组合物、试

剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 乙型肝炎病毒(HBV)DNA水平是肝细胞癌(HCC)发生发展的独立危险因素，HBV DNA水平越高，患者发生HCC的风险就越高。因此，针对HBV DNA水平高引起的肝脏损伤慢性乙型
肝炎(CHB)患者，国内外《慢性乙型肝炎防治指南》均建议他们接受核苷(酸)类药物(NAs)或
者聚乙二醇干扰素(Peg‑IFN)治疗，以控制病毒复制，延缓疾病进展，降低HCC的发生风险。
由于目前难以实现慢性HBV感染的治愈(HBsAg转阴、肝内cccDNA清除)，因此，科学家们将
HBV DNA转阴(病毒学应答)、HBeAg血清学转换(HBeAg血清学应答)作为抗病毒治疗的应答
指标，以评估抗病毒治疗药物的疗效。已有研究表明，在抗病毒治疗过程中，实现病毒学应
答和HBeAg血清学应答的患者较非应答患者/应答不佳患者，HCC发生风险显著下降，提示
HBV DNA和HBeAg是监测慢乙肝患者抗病毒治疗疗效和慢性肝病进展的重要临床指标。

[0003] 近年，随着核苷类抗病毒药物在慢乙肝患者中的普遍应用，很多患者获得了很好的病毒抑制效果，大多数患者达到血清HBV DNA检测不到、HBeAg血清学转换的治疗效果，而
HBsAg水平变化不大。这种情况下，需要新的能够反应病情变化的指标。其中HBV RNA作为
cccDNA的直接下游产物，比HBV DNA更能代表肝内cccDNA的状态。已有研究表明血清HBV 
RNA与肝内cccDNA转录活性相关，是慢乙肝患者抗病毒治疗应答的早期预测指标，并且可以
预测NAs停药后疾病复发的情况。

[0004] 实际上，血清HBV RNA的存在形式较HBV DNA复杂。科学家们发现，血清HBV RNA主要为HBV前基因组RNA(pgRNA)(Wang J,Shen T,Huang X,et al.Serum hepatitis B virus 
RNA is encapsidated pregenome RNA that may be associated with persistence of 
viral infection and rebound.J Hepatol.2016；65(4):700‑710.)，pgRNA长短不一，既存
在完整的全长pgRNA，又存在3’端截断型pgRNA以及不同剪接形式的pgRNA(Liu S,Zhou B,
Valdes JD,Sun J,Guo H.Serum Hepatitis B Virus RNA:A New Potential Biomarker 
for Chronic Hepatitis B Virus Infection.Hepatology.2019；69(4):1816‑1827.)。而
以往的关于HBV RNA的临床研究中，不同研究团队采用的HBV RNA检测方法各不相同，因此，
检测到的HBV RNA种类可能是不同的，这可能会导致不同的研究结果，如由某一检测方法测
定的HBV RNA水平可以预测慢乙肝患者抗病毒治疗应答的HBV RNA，但是不一定可以预测停
药后疾病复发。HBV RNA阳性，代表患者肝内cccDNA仍在活跃转录，患者停药后复发风险极
高并可能增加疾病进展风险。因此，建立血清HBV RNA检测方法，尤为需要关注检测灵敏度
以及对于低病毒载量样本的阳性率，以避免出现假阴性，增加患者慢性肝病进展风险。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用，所述引物探针组合物的靶基因位于HBV基因组的
S区，实现了灵敏、特异的HBV RNA定量检测，提高了低病毒载量样本的检测阳性率，在预测
停药复发、肝癌发生以及HBsAg转阴等方面具有重要的应用前景。

[0006] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 第一方面，本发明提供了一种检测乙肝病毒RNA的引物探针组合物，所述引物探针组合物的靶基因位于乙肝病毒基因组的S区，优选为乙肝病毒基因组的S区160～780nt区
间。

[0008] 本发明中，乙肝病毒基因组的S区位于基因组的中间区域，稳定性好、不易降解或缺失，采用基于S区设计的引物探针进行HBV RNA检测，不仅可以检测到S区基因、而且可以
检测到5’末端(PreC/Core区)和3’末端(X区)等在低病毒载量的慢乙肝患者肝细胞内易降
解缺失的基因，因此，特异性靶向S区的引物探针组合物实现了低病毒载量的慢乙肝患者肝
细胞中HBV RNA的高灵敏检测。

[0009] 优选地，所述靶基因包括常见HBV亚型基因组S区，例如可以是HBV亚型A、B、C、D、E、F、G或H基因型的基因组S区中的任意一种。

[0010] 优选地，所述靶基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有92％以上同一性的核酸序列；

[0011] SEQ ID NO:1：

[0012] gavcacaaccatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggaacacccgtgtgtcttg
gccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggttatcgctggat
gtgtctgcggcgttttatcatcttcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactat
caaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcatcaacaaccagcaccggaccatgcaaaacctgcacaa
ctcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgcacctgtattcc
catcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttacta
gtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatatggatgatgtggttttggg
ggccaagtctgtacaacatctt。

[0013] 优选地，所述引物包括SEQ ID NO:2～9所示的核酸序列，其中，SEQ ID NO:2～5为上游引物，SEQ ID NO:6～9为下游引物；

[0014] SEQ ID NO:2：CATCAGGAYTCCTAGGACC；

[0015] SEQ ID NO:3：CCTGCTCGTGTTACAGGC；

[0016] SEQ ID NO:4：GGTTTTTCTTGTTGACAA；

[0017] SEQ ID NO:5：TGTCCTCCAATTTGTCCT；

[0018] SEQ ID NO:6：ATGATAAAACGCCGCAGAC；

[0019] SEQ ID NO:7：TGAGGCATAGCAGCAGGATG；

[0020] SEQ ID NO:8：GTACAGCAACAWGAGGGAA；

[0021] SEQ ID NO:9：CCCAAGATGATGGGATGGGAATA。

[0022] 优选地，所述探针包括SEQ ID NO:10～13所示的核酸序列，靶向捕获不同基因型的HBV基因组S区；

[0023] SEQ ID NO:10：CCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT；

[0024] SEQ ID NO:11：CCACGTGTCCTGGCCAAAAT；

[0025] SEQ ID NO:12：AAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTA；

[0026] SEQ ID NO:13：TCAACTACCAGCACvGGACCATGCA。

[0027] 优选地，所述探针包括TaqMan探针和/或杂交探针。

[0028] 优选地，所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团，优选为所述探针的5’端标记有荧光基团、3’端标记有淬灭基团。

[0029] 优选地，所述荧光基团包括FAM、CYS、CY5、VIC、TET、JOE、HEX或ROX中的任意一种。

[0030] 优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL或Eclipse中的任意一种。

[0031] 第二方面，本发明提供了一种检测乙肝病毒RNA的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。

[0032] 本发明中，采用第一方面所述的引物探针组合物构建检测乙肝病毒RNA的qPCR体系，实现了灵敏准确检测乙肝病毒RNA的效果，相较于现有的乙肝病毒RNA检测方法，显著提
高了低拷贝数乙肝病毒RNA的检测阳性率，所述体系能够精准监测慢乙肝患者抗病毒治疗
效果，预测治疗应答效果，预测停药复发、肝癌发生和HBsAg转阴，具有重要的应用价值。

[0033] 优选地，所述试剂盒还包括酶混合液、dNTP混合液或PCR缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

[0034] 优选地，所述酶混合液包括DNA聚合酶和/或逆转录酶。

[0035] 优选地，所述dNTP混合液包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

[0036] 优选地，所述PCR缓冲液中含有Mg2+。

[0037] 优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

[0038] 优选地，所述阳性质控品包括含有乙肝病毒基因组S区的质粒。

[0039] 第三方面，本发明提供了一种检测乙肝病毒RNA的体系，所述体系包括第一方面所述的引物探针组合物。

[0040] 优选地，所述引物探针组合物中的引物在所述体系中的终浓度为0.1～1pmol/μL，例如可以是0.1pmol/μL、0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.5pmol/μL、0.6pmol/μL、
0.7pmol/μL、0.8pmol/μL、0.9pmol/μL或1pmol/μL，优选为0.5pmol/μL。

[0041] 优选地，所述引物探针组合物中的探针在所述体系中的终浓度为0.1～1pmol/μL，例如可以是0.1pmol/μL、0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.5pmol/μL、0.6pmol/μL、
0.7pmol/μL、0.8pmol/μL、0.9pmol/μL或1pmol/μL，优选为0.5pmol/μL。

[0042] 优选地，所述体系还包括RNA样本、逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+。

[0043] 优选地，所述RNA模板在所述体系中的终浓度为10ng/μL～100μg/μL，例如可以是10ng/μL、100ng/μL、1μg/μL、10μg/μL或100μg/μL。

[0044] 优选地，所述逆转录酶在所述体系中的终浓度为0.5～10U/μL，例如可以是0.5U/μL、1U/μL、5U/μL或10U/μL。

[0045] 优选地，所述DNA聚合酶在所述体系中的终浓度为0.005～0.05U/μL，例如可以是0.005U/μL、0.01U/μL或0.05U/μL。

[0046] 优选地，所述dNTPs在所述体系中的终浓度为20～200μmol/L，例如可以是20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L或200μmol/L。

[0047] 优选地，所述Mg2+在所述体系中的终浓度为0.5～3.0mmol/L，例如可以是0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L或3mmol/L。

[0048] 第四方面，本发明提供了一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测乙肝病毒RNA的方法，所述方法包括：

[0049] 采用第一方面所述的引物探针组合物、第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的体系对RNA样本进行荧光定量PCR，检测乙肝病毒RNA的水平。

[0050] 优选地，所述荧光定量PCR的条件为：

[0051] 92～98℃预变性10～30s；

[0052] 92～98℃变性10～20s，55～65℃退火40～60s，70～75℃延伸10～30s，共进行35～45个循环。

[0053] 优选地，在进行预变性之前，还包括45～55℃反转录5～8min的步骤。

[0054] 第五方面，本发明提供了一种检测乙肝病毒RNA的装置，所述装置包括：

[0055] 逆转录单元：用于将乙肝病毒RNA样本逆转录为DNA样本；

[0056] 荧光定量PCR单元：用于采用第一方面所述的引物探针组合物、第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的体系对RNA样本进行荧光定量PCR，检测乙肝病毒RNA的水平。

[0057] 第六方面，本发明提供了第一方面所述的引物探针组合物、第二方面所述的试剂盒、第三方面所述的体系或第五方面所述的装置在制备肝病诊断试剂、慢性乙肝抗病毒治
疗的疗效评价和/或安全停药、治疗终点监测的HBV诊断试剂中的应用。

[0058] 优选地，所述肝病包括急慢性乙型肝炎、乙型肝炎相关肝衰竭、肝硬化或肝癌中的任意一种或至少两种的组合。

[0059] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0060] (1)本发明以乙肝病毒基因组的S区基因为靶点，设计特异性引物探针，实现了灵敏准确检测低拷贝乙肝病毒的效果；

[0061] (2)本发明的基于HBV S区的HBV RNA检测方法对于检测低病毒载量患者的血清HBV RNA阳性率，相较于现有技术得到显著提高；

[0062] (3)本发明构建的基于HBV S区的HBV RNA检测体系和检测方法可以检测出低拷贝数的病毒核酸，为预测乙肝停药复发、肝癌发生、表面抗原消失等中期疗效判定和疾病发展
终点事件提供了可靠的方法，在预测慢乙肝患者停药复发、肝癌发生和HBsAg转阴等方面具
有潜在的应用价值。

附图说明

[0063] 图1为靶向乙肝病毒基因组S区的引物探针位置示意图；

[0064] 图2为不同浓度的阳性质控品的RT‑qPCR扩增曲线，其中，扩增曲线从左到右代表7 6 5 4
的阳性质控品浓度依次为5.0×10拷贝/μL、5.0×10拷贝/μL、5.0×10 拷贝/μL、5.0×10
3 2 1
拷贝/μL、5.0×10拷贝/μL、5.0×10拷贝/μL、5.0×10拷贝/μL；

[0065] 图3为RT‑qPCR标准曲线；

[0066] 图4A为基于HBV S区的高敏HBV RNA(S‑RNA)、PreC‑RNA、X‑RNA和RACE的阳性率比较结果，图4B为RACE法和商业试剂盒Sansure的阳性率比较结果；

[0067] 图5为基于HBV S区的高敏HBV RNA(S‑RNA)和RACE预测慢乙肝患者停药复发的结果；

[0068] 图6A为基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测结果分析血清HBV RNA水平与慢乙肝患者肝癌发生之间的关系，图6B为基于HBV PreC区的HBV RNA定量检测结果分析血清HBV 
RNA水平与慢乙肝患者肝癌发生之间的关系；

[0069] 图7为基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测结果预测患者停药后HBsAg转阴结果；

[0070] 图8为基于HBV S区的高敏HBV RNA(S‑RNA)和HBV DNA 24周的水平预测慢乙肝患者HBeAg血清学应答的结果；

[0071] 图9A为RNA应答患者在核苷(酸)类似物治疗过程中的HBV DNA和HBV RNA的动态变化，图9B为RNA应答不佳患者在核苷(酸)类似物治疗过程中的HBV DNA和HBV RNA的动态变
化。

具体实施方式

[0072] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非
对本发明的限定。

[0073] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购
获得的常规产品。

[0074] 实施例1引物探针组合物的设计

[0075] 本实施例以不同亚型HBV基因组S区SEQ ID NO:1为靶基因，设计特异性引物探针SEQ ID NO:2～13，其中，SEQ ID NO:2～5为上游引物，SEQ ID NO:6～9为下游引物，SEQ ID 
NO:10～13为探针，示意图如图1所示。

[0076] 实施例2HBV RNA的提取

[0077] 本实施例首先利用 Virus Spin kit(QIAGEN，德国)从乙肝患者血清样本中提取核酸，再采用DNA消化酶DNase I(Thermo Fisher Scientific)消化DNA，
从而获取HBV RNA，步骤如下：

[0078] (1)吸取888μL AL缓冲液至24.6μL carrier RNA中，吹打均匀；

[0079] (2)将25μL蛋白酶加入到1.5mL EP管中，并加入200μL常温待提取血清(血清分装前吹打混匀)，随后加入200μL AL(carrier RNA浓度为28μg/mL)，涡旋震荡15s，56℃加热
15min；

[0080] (3)将样本瞬时离心后，加入250μL无水乙醇，涡旋震荡15s，室温放置5min；

[0081] (4)将含有样本的过滤柱置于新的收集管中，加入500μL Buffer AW1，8000rpm离心1min；

[0082] (5)将过滤柱置于新的收集管中，加入500μL Buffer AW2，8000rpm离心1min；

[0083] (6)将过滤柱置于新的收集管中，加入500μL无水乙醇，8000rpm离心1min；

[0084] (7)将过滤柱置于新的收集管中，14000rpm高速离心3min；

[0085] (8)将过滤柱置于新的收集管中，打开盖子，56℃加热3min，同时预热AVE缓冲液；

[0086] (9)将过滤柱置于新的1.5mL EP管中，加入50μL AVE缓冲液，室温放置5min；

[0087] (10)14000rpm高速离心1min，随后将30μL提取核酸进行DNase I消化，40μL DNase I消化体系见表1；

[0088] (11)37℃加热40min，随后加入2μL EDTA(50mM)，65℃加热10min，得到HBV RNA。

[0089] 表1

[0090] 试剂 体积(μL)10×消化缓冲液(10×digestion buffer) 4
无酶水(Nuclease‑free water) 4
DNase I(2U/μL) 2
样本 30

[0091] 实施例3靶向HBV基因组S区的HBV RNA定量检测

[0092] 本实施例采用SEQ ID NO:2～9所示的引物对、SEQ ID NO:10～13所示的探针进行HBV RNA阳性质控品的HBV RNA定量检测，RT‑qPCR试剂为 Fast Virus1‑Step 
2+
Master Mix(Applied Biosystems)(主要成分包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、Mg )，体系
如表2所示，荧光定量PCR条件如表3所示。

[0093] 表2

[0094]

[0095] 表3

[0096]

[0097] 阳性质控品的制备方法为：

[0098] 人工合成上述引物探针组合物的靶基因(SEQ ID NO:1)，克隆至pGEM Easy质粒(Promega)上，转染至大肠杆菌JM109(TAKARA)内进行大量扩增；使用Qiagen质粒Midi试剂
盒(Qiagen)纯化含有靶基因的高质量DNA质粒，用Nde I(TAKARA)线性化，再使用T7 
TM
RiboMAX Express RNA试剂盒(Promega)进行RNA转录；采用DNase I消化转录后RNA中残余
的DNA模板，并由QIAmp MinElute病毒纯化试剂盒(Qiagen)纯化转录后的RNA标准品，最后
使用NanoDrop ND‑2000进行定量(Thermo scientific)，作为HBV RNA阳性质控品。

[0099] 阳性质控品在不同浓度下(5.0×101～5.0×107拷贝/μL)的RT‑qPCR扩增曲线如图2所示，以阳性质控品的浓度取log值为横坐标、Ct值为纵坐标，建立标准曲线如图3所示，说
明采用SEQ ID NO:2～13所示的引物探针组合物成功构建靶向HBV基因组S区的HBV RNA检
测体系。

[0100] 实施例4阳性率检测

[0101] 本实施例采用基于乙肝病毒基因组PreC/Core区、S区(引物为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6，探针为SEQ ID NO:10)、X区和3’端polyA尾(RACE法)的RNA检测方法检测188例低
病毒载量的慢乙肝患者血清HBV RNA水平，如图4A所示，发现基于S区的检测方法得到的RNA
阳性率最高，而RACE法得到的阳性率最低(66％vs 10％，p<0.05)。

[0102] 本实施例进一步比较了RACE法与商业试剂盒(Sansure)对另外100例慢乙肝患者血清HBV RNA的定量结果，如图4B所示，RACE法检测的HBV RNA阳性率较商业试剂盒检测的
RNA阳性率更高，进而突出了本发明方法对于低病毒载量样本的检测优势(阳性率：S区方法
>RACE法>商业试剂盒)。

[0103] 实施例5预测慢乙肝患者停药复发的实现过程

[0104] 在一项真实世界的慢乙肝患者停药队列中(n＝50)，采用实施例3(引物为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7，探针为SEQ ID NO:11)和基于RACE的HBV RNA检测方法平行检测患者停
药时的血清HBV RNA水平，应用ROC曲线检验两种方法得到的HBV RNA水平预测停药后肝炎
复发的效能。

[0105] 结果如图5所示，实施例3的基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测方法检测的HBV RNA水平可以较好地预测停药后4年的肝炎复发，而RACE法不能很好地预测停药后肝炎复
发。

[0106] 实施例6预测肝癌的实现过程

[0107] 在接受抗病毒治疗的慢乙肝患者中，仍然有部分患者发展为肝癌。本实施例利用实施例3的基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测方法(引物为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8，
探针为SEQ ID NO:12)检测345名接受抗病毒治疗的慢乙肝患者的血清HBV RNA水平，并通
过Kaplan‑Meier曲线分析血清HBV RNA水平与慢乙肝患者肝癌发生之间的关系。结果如图
6A所示，HBV RNA阴性的患者其肝癌发生风险显著低于HBV RNA阳性患者。

[0108] 本实施例同时利用基于HBV PreC区的HBV RNA检测方法检测这些患者的HBV RNA水平，结果如图6B所示，绝大部分患者未检测到HBV RNA，其与肝癌发生的相关性无统计学
差异。

[0109] 实施例7预测HBsAg清除的实现过程

[0110] 目前，尚未有药物可以治愈慢性HBV感染或清除HBsAg，只有少部分患者经过长时间的抗病毒治疗后，可以实现HBsAg转阴(功能性治愈)，因此，识别大概率可以实现功能性
治愈的慢乙肝患者，有利于优化抗病毒治疗策略，提高临床资源分配效率。

[0111] 本实施例利用实施例3的基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测方法(引物为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9，探针为SEQ ID NO:13)检测170名慢乙肝患者停药时的HBV RNA水
平，结果如图7所示，发现HBV RNA阴性的患者，停药后实现HBsAg转阴的机会较HBV RNA阳性
的患者显著增加，可见HBV RNA是慢乙肝患者HBsAg转阴的一个早期预测指标。

[0112] 实施例8预测慢乙肝患者抗病毒治疗应答的实现过程

[0113] 在抗病毒治疗过程中，慢乙肝患者发生HBeAg血清学转换意味着患者有较好的抗乙肝免疫应答能力，肝内cccDNA转录活性较低。血清HBV RNA是肝内cccDNA的无创替代指
标，对于HBeAg阳性的慢乙肝患者，血清HBV RNA可以有效预测慢乙肝患者接受抗病毒治疗
后HBeAg血清学转换。以核苷酸类似物为例，在一项慢乙肝患者治疗队列中(n＝69)，采用实
施例3的基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测方法检测基线和24周的血清HBV RNA水平，应
用ROC曲线检验HBV RNA水平预测NAs治疗2年后的HBeAg血清学转换的效能。

[0114] 结果如图8所示，基于HBV S区的高敏HBV RNA定量检测方法检测的24周HBV RNA水平可以较好地预测NAs抗病毒治疗的HBeAg转阴，其预测效能较HBV DNA更好。

[0115] 实施例9血清HBV RNA作为监测慢乙肝患者抗病毒治疗疗效的新指标

[0116] 基于实施例6的结果可知，高水平的血清HBV RNA可增加慢乙肝患者发生肝癌的风险。因此，有效降低血清HBV RNA水平可作为经典的抗病毒治疗(包括IFN和NAs)以及新型抗
病毒治疗方案(如核衣壳抑制剂、siRNA、乙肝病毒入胞抑制剂、免疫调节药物等)的疗效监
测指标之一。同时作为乙肝病毒的核酸物质，HBV RNA是肝内cccDNA的直接下游产物，较HBV 
DNA更能代表cccDNA的转录状态。在评价乙肝新药的抗病毒疗效时，除了以传统的HBV DNA
转阴和HBeAg血清学转换作为衡量指标，血清HBV RNA转阴更是反映了肝内cccDNA的低活性
状态，直接反映了乙肝病毒被抑制的程度。以经典的NAs抗病毒治疗为例，在NAs治疗过程
中，当血清HBV DNA迅速被抑制，血清HBV RNA仍可持续在较高水平(基于实施例3的高敏HBV 
RNA定量检测方法检测结果)，随着抗病毒治疗时长的增加，如图9A和图9B所示，有些患者的
HBV RNA水平可逐渐下降(图9A)，而有些患者的HBV RNA水平可维持在较高水平(图9B)，说
明这两类患者对NAs抗病毒治疗的应答是有差别的，同时也提示着HBV RNA持续不转阴的患
者可能需要改善抗病毒治疗策略，以期获得更好的疗效。同理，血清HBV RNA亦可作为乙肝
新药研发的疗效监测指标之一。

[0117] 综上所述，本发明以常见HBV亚型基因组S区为靶基因，设计特异性引物探针，基于所述引物探针构建的荧光定量PCR HBV RNA检测方法实现了低病毒载量患者的血清HBV 
RNA的灵敏特异检测，在预测慢乙肝患者停药复发、肝癌发生和HBsAg转阴的效果等方面展
现出临床应用潜力。

[0118] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的
技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的
添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。